全 文 ： 文章编号 1000—3142(2000)04—0361—06
小麦生育前期 POD
姬 生栋 ，
n
，7．／口／
同工酶的动态变化
李金 亭，吉 爱玲 ，李 吉学，王 丹，徐存拴
， — —
_ — 一
(河南师范大学生命科学学院．河南新乡 453002)
摘 要 ：利用复性电泳技术 ．对 2个小麦品种 (冬性品种 、春性 品种)从 出茁到拔节初期绿叶中的
POD酶 谱进行分析 ，结果表明：(I)小麦从 出苗到拔节初期 POD 的分子量均在 35 kD以上 (吉 35
kD)；(2)三 叶期以前叶片中 POD活性比三叶新 以后的弱 ；(∞ 小 麦叶片中 POD酶带变化主要集
中在 52-146 kD间；(4)从出茁到拔节初期小麦绿叶中始终吉有 300．52、39、37 kD 4条活性较
强的过氧化物酶；(5)在不同的生育阶段和环境 条件下，绿叶中 POD的种类 和话性均有显著变化
美键词：尘苎兰墨些塑塑 差苎皇兰 同 酮
中囤分 类 号 ：Q949 71 4 206 文 献标 识 码 ：A
The dynamic changes of
in growth earl ier
peroxidase isoenzym es
stage of wheat
jI Sheng—dong，LI Jin—ting，jI Ai—ling，
LI ji—xLie，W ANG Dan，XU CLID—shuan
(Cd~ge Idly Science-Henan Jv一 U~ rsity·Xinxiang 453002，China)
Abstract：The peroxidases of green [eaves in two kinds of wheat breeds(winter，spring variety)from
sprout 0f seedling to the initial stage 0f·ointing were analyzed with renaturafion e[ectrophoresis．The
results show：(1)The MWs of peroxidases from sprout of seedling to the initial stage of jointing are al
above 35 kD (including 35 kD)． (2)The activity of peroxidase before the trefoil stage is weaker than
later． (3)Th e M Ws of peroxidases in wheat】eaves are mainly between 5Z kD to 146 kD (4)The
four kinds of stronger peroxidases of 30．0 kD-52 kD，39 kD and 37 kD always exist in the period of
sprout of seedling to the initial stage of Jointing (j)The kinds and activity of peroxidase have
changed greatly under different growth stages and environmental conditions
Key words：W heat；peroxidase；renaturatlon electrophoresis
小麦从出苗到拔节 ，要经过多种复杂的生理 、生化变化才能完成各发育阶段，如异养阶
段、自养阶段、幼穗分化、春化阶段 、光照阶段等。小麦苗期各种代谢括动之所以能按一定
牧稿 日期 ：1999—1O-2s
作者简介 姬生栋 (1963)．男，实验帅，长期从事4、蛊静子生物学研究
基金项 目：河南省 自然科学基盎资时项 日 (974013100)
维普资讯 http://www.cqvip.com
362 广 西 植 物 20卷
模式有序地进行，主要依赖于基因控制的一 系列活性蛋 白质—— 酶进行调控，过氧化物酶
(POD)是一种重要的氧化还原酶。研究小麦生育前期 POD的动态变化，将从一个侧面反映出
小麦各阶段的生长发育特点，体内代谢状况，以及对外部环境的适应性 ’
80年代初建立起来的复性电泳技术 (G PAGE)．是一种电泳后仍可保持酶的生物活性 、
研究各类酶结构、性质和作用的较理想的方法 ．其原理是 SDS与酶结合而使酶发生可逆变
性 ，电泳完毕后用非离子去垢剂 (如 TritonX l00)洗去与酶结合的 SDS，从而使酶恢复活性 ，
然后用联苯胺染色法对 POD同工酶染色。用此方法可了解每条 POD带的分子量大小 近来许
多研究者用复性电泳技术研究蛋白水解酶” ，但使用此方法研究 POD还很少有报道 。本文用
复性 电泳技术研究正常播种的大田小麦 ，从出苗到拔节初期小麦叶片中 POD的变化情况。
1 材料和方法
1．1材 料
本研究供试 小麦 品种有 2个 ，冬 性品种为 PH85一l6(Tritlcum aestiT,um I ．CV PH85—1 6)，
春 性 品种 为黑引一号 ．aestivum I ．CV Heiyin 1)。材 料于 1997年 lO月 】]日种于河南师 范
大学小麦试验田，播种在肥力等条件一致的同一田块，田间管理按常规大田措施 ，采用小区
条播种植，设 3个重复，随机排列，每个重复小区面积 10 m ，品种间设保护行。
1、2样品的 采集与 处理
小麦出苗后第 6 d(10月 23日)上午第 1次取样，随机取样，以后每隔 10 d取 1次样，
翌年 3月 l2日为第 1 5次取样，此时黑引一号下部节间长 2、3 C1TI，PH85一l 6下部节间长 l C1TI。
每次取整株迅速放人液氮中，带回实验室，4℃ 环境中洗净 ，取整株绿叶用 0、9 NaCI提取，
冰浴匀浆，4。c离心 (20 000 g，5rain)，取上清液分装于 Eppendoff管中，放人一85。c冰箱
中保存 备用 。
1、3蛋 白质浓 度测定 和复性 电泳
按 Neuhof等0 的方法测定制备液的蛋白质浓度。电泳前在样品制备液中加人样品缓冲
液 (3倍样 品缓 冲液 ：78 甘油 10 mL+0 5 mol／L Tris—HCI，pH6、8，3、5 mL+SDs 10 g，加 水
至 100 mI )。电泳时每槽所加 样品蛋 白质总 量相同 ，按 Neuhaus—Steinmetz等 的复性电泳 (G—
PAGE)方法进行 ，分离胶浓度 1O ，浓缩胶浓度 ，每槽加样品总蛋白量 50 pg，电泳在 4。c
环境 中，恒压进行 ，样品在浓缩胶里时，电压≤5O V，每板初始电流≤10 mA；样品进人分离胶
后，电压≤100 V，每板电流≤10 mA。待前沿指示剂(1 溴酚兰)到分离胶下缘 l～2 cm 时停
止电泳，取出分离胶板 ，切除溴酚兰 以下部分，将胶板放人 250 mL洗涤液中(TritonX一100 12
ml ，Tris—base 3、03 g，加双蒸水 500 mL，调 pH7、0)洗涤 30 rain，后再用单蒸水洗 2次，双蒸
水洗 1次，每次 5 rain，洗涤完毕 ，用联苯胺染色法对 POD染色(0、l g联苯胺+ mL无水乙醇
+10 mL]． M 乙酸钠 +10 ml 1、 M 乙酸 +5O mL双蒸水 +2 mL 3 H ( )，显色后随 即用
水冲洗保存于 7 乙酸中。同一板中加人 2种标准蛋白(Ml：M．w．97、4、66、2 42、7、31 l4．4
kD，Shanghai Promega和 M2 ：M．W．21 2 】]6 97、4 66．2、57．5、40 kD，Promega)，电泳完 毕
洗胶前将带标准蛋白的胶切去，固定 染色、脱色参照 Laemmli方法。
1．4酶活性测定
将显色后保存于 7 乙酸中的胶板进行扫描处理，然后将扫描的图像信息用ScanPacK软
件系统进行活性分析 。
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 姬生栋 等 ：小麦生 育前 期 POD 同工酶 的动态变化 363
1．5主要试剂
Acrylamide (USBj Bisacrylamide (fluka) Gelatin (Sigma) TEM ED c Bio Rad)、SDS
cGibco)、Tris—base (Gibco)、TritonX i00(FARC())等 ，所用试剂 均为分 析纯 。
2 结 果
2．1同一 品种各生 育阶 段 POD的变 化
由图 1可以看出．春性小麦品种黑引一号从出苗到拔节初期，各生育阶段叶片中 P()I]酶
带有明显变化。其中有 4条酶带贯穿于各生育期，分别为 300、52、39、37 kn。此外．1 7 kD
酶带仅 a 、a12这 2个时期不 存在 。出苗后 第 6 d f图 1中 a ，此时小 麦为一叶 一 ．叶 片的
电泳 图谱 中 ，除上述 5条 酶带外 ，还有 i06 kD．i 4 6 kD活性较 弱 到第 1 6 d(图 1中 a)．仍
可 见到 6条酶带 ，但 1 46 kD和 106 kD消失 ，出现 一条 90 kD新带 ．此时正是三 叶 --- ．是
小麦幼苗由异养阶段转变为自养阶段的时期 。小麦生长到 26 d和 36 d(图 1中 a{和 a )以后 ．
与 a 、a!对应 的 5条 酶带活性显 著加 强 ．同时 出现一 条活性极 强 的新 带 -74 kD 和一 条较弱的
酶 带一 98 kD。小麦 生长到 4 6 d t图 1中 a )，此时小麦 已是五叶一心 ，74 kD活性银 弱 ．出现
90 kD一条 强带 ，此后小麦 幼穗分 化开始进 入二棱 期 ，气温 开始下降 ，90 kD酶带减 弱 ．85 kD
酶 带具 极强的活性 (见 图 1中 a。)。小 麦生长到 66 d(图 1中 a )．叶片 POD带型 与 a。．a；相
同．只是 300 kD酶带 活性 比前 边几个 时期 的都强 ，此 时春性 品种 出现 轻度冻 害 。小麦 生长到
76 d(图 1中a )，已进入翌年元月 2日，从酶谱看 ，74 kD活性基本消失 ，90 kD酶带叉重新
出现 ，且活性较弱 ，此 时小麦 已进入越冬期 。随着越冬 期的进一步深A ．春 性品种 冻害达 到
中度，POD酶谱又有新的变化 (图 1中 a )，总 POD活性达到拔节以前各生育期的最高值 ，出
现 249、146、1 06 kD 3条活性 较强 的新带 ，47 kD酶带 消失 。小麦生 长到 96 d (图 1中 a )，
1 46、106 kD酶带基本消失，9O、47 kD酶带又出现。小麦生长到第 106 d(图 1中 a )，249、
98、90 kD酶带消失，85 kD酶带 出现。随着气温回升，越冬期将结束 ．小麦生长到 116 d
(图 1中 a】2)，47 kD酶带消 失 ，出现 2条较 弱 的酶带 45 kD和 98 kD，而 300、52、39、37 kD
这 4条带 的活性 均较 强 。小 麦生长 到第 126 d(图 1中 a 2月 22 Et)．98 kD活性加 强 ，8j
kD活性消失．1 46 kD活性较弱 ．47 kD酶带又重新出现。小麦生长到第 136和 1．t6 d(图 1中
a 和 a1 )，POD酶带与 a 基 本 一致 ．300、52、39、37 kD活性渐有减 弱 。总之 ，纵观春性小
麦黑引一号从出苗到拔节初期整个 POD酶谱 ，可以清楚地看出，300、52、39、37 kD这 4条
酶带在整个小麦生育前期都存在 ，其活性强弱随着生育阶段的不同及环境条件的变化而变化 ，
各 生育 阶段变化最 活跃 的酶 带主要在 1,16～7,1 kD之间 ，47 kD酶带在小麦 生长到第 86、11 6
d时消失．并且 POD同工酶的分子量均大于 35 kD。
PH85 16小麦属于冬性品种，从出苗到拔节初期叶片中过氧化物酶酶谱变化情况见图 2，
其 中 300、52、39、37 kD 4条酶带存在于每个时期，且活性较强，出苗后第 6 d (图 2中
b )，POD主要有 8条酶带 ，除 上述 4条外 ．还有 14 6 kD (活性弱 )、1 06 kD (活性较 强 )、47
kD 【活 性最强 )、36 kD (活性 弱 ) 小麦长 到三 叶期 (图 2中 b：j，14 6 kD活性减弱 ．106 kD
消 失 ，出现一 条 98 kD 酶带 ．36 kD活性 比 b 强 ．249 kD也清晰 可见 。小麦 生长到 26、36 d
L图 2中b⋯ b)，出现一条活性银强的酶带一74 kD，52、47、37．36、300 kD活性加强，9s
kD活性减弱，1 46 kD基本消失。小麦生长到 ,16 d(图 2中 b )，74 kD活性很弱 ．24 9、37 kD
活性增强，此时出现一条活性很强的酶带一90 kD，本次取样前一天开始降温。随后到第 56 d
维普资讯 http://www.cqvip.com
36d 广 西 植 物 20卷
】 he mx as⋯ Ⅵ Heivill 1 wheat
：、 i ． 什 示出苘 后第 、I 6、 6、：e 4 5、；
rI r抒丁 瞎 蛋 f M2 高 抒千埘标 准蛋 白
! PH85l 6小 盔 POD酶谱
一
Fig ! he peroxide．s。f PH 85 wheat
b PH 85】6 其他 通孵 同 目 ．。1) Pit 1 6 Th⋯ Lhc ⋯ ⋯ h。 1
(图 2中 bo)．总酶活 比各 时期都强 ，出现一 条活性强 的酶 带一 8j kD，并且 52、4 7、37 kD均
比其它 时期活性 强 ，此时 PH85 1 6已达 五叶一心 ，幼穗分化 为单 棱期 小麦 生长到 66、76 d
图 2中 b 、b )，9O、85、47 kD酶带消失 ．98 kD活性较 弱 ，出现 43 kD一条新带 ，7 kD
活 性加强 小麦 生长到 86 d(图 2中 b。)，106 kD活性增 强 ，74、4 3、36 kD基本 消失 ，1 7 kB
又重 新 出现 一但 活性极 弱 。小麦 生长到第 96 d (图 2中 b， )，7t、47 kI]活性增 强 ．36 kD重
新 出现 ，98 kD活性减弱 小麦 生长到第 1 06 d、11 6 d、1 26 d r图 2中 b ，b ：．b 。)，带型
与 b， 基本一致，只有 47 kD消失 ，出现一条 42 kD新的酶带，74 kD活性变化依次为强一弱
一 强 随着越冬期结束 ，进八起身、拔节初期 (罔 2中 b b， ，，74 kD极弱，85 kD活性增
强．42 kD酶带消失，4 5 kD以较强活性 出现。总之．冬性小麦 PH85—1 6从出苗到拨节初期 ，
绿叶中 P()D酶带以 300、52、39、37 kl-)较稳定，分子量介于 1 4 6～74 kD和 47～{2 kD之间
的酶带变化较大 ，249 kD活性在小麦生长到 56 d以后渐渐消失 ，过氧化物同工酶分子量均大
于 等于 35 kD
，
淆 、 瞬 *
j ⋯
噎
一 吨
引 h
；
坼
一
1●
号
．
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 姬生栋等 ：小麦生育前期 POD同工酶的动态变化 365
2．2品种间 POD酶谱的变化
从 2个品种复性电泳图谱可以看出，300、52、39、37 kD这 4条 POD带存在于所研究的
2个品种每个时期。2个品种的过氧化物酶分子量均在 ：35 kD以上 (含 35 kD) 2个品种酶谱
的变化趋势基本一致，POD酶带的消失、出现主要集中在 l46～74 kD及 4 7～42 kD之间，冬
性品种 PH85—1 6在 47～42 kD之间的酶带变化比春性品种黑引一号活跃。PH85—16小麦的 36
kD基本上一直保持较强的活性 (生长到 86 d除外)，而春性品种电泳酶谱未发现此带 。2种
小 麦品种从 出苗到 26 d以前 ，POD的活性较低 ，生长到 26 d POD活性 显著 提 高 ，以后仍 一
直保持较强的活性。小麦生长到 86 d(图 1、2中a，、b )，2个品种 300、106 kD的活性明显
加强，特别是 106 kD活性显著增加．而 4 7 kD活性显著减弱，与前后 2个生长时期的 POD酶
带形成 显著差异 。
3 讨 论
小麦 从 出苗 到拔 节初要经 过几个重 要的生育 阶段 ，纵观各 时间段小麦绿 叶 中 POD同工 酶
的变化，可清楚地看出，无论是冬性 (PH85—16)还是春性 (黑引一号)小麦出苗后 26 d(图
l、2中 a3、b：)POD总活性显著加强，并出现一条新的活性极强的酶带-74 kD。小麦生长到
l 6 d时 2个 品种 的叶龄为三 叶期 (黑 引一号三 叶一心 ；PH85 1 6三叶一 心 ，1个 小蘖 )，此 时
异养阶段即将结柬 ，转向自养阶段。到出苗后 26 d，小麦完全以 自养为主，这时分蘖已开始，
幼穗 分化 刚进 入单棱初 期 。由此 可见 ，74 kD的 出现 (图 l、2中 a。 、bz-b )和总 POD 活性
加强的现象可能与幼穗分化开始或小麦异养阶段结柬转 向自养阶段有关，或是二者共同作用
所致，或与其它别的因素有关 。看来 ，POD是反映小麦代谢活动的一个重要酶类
以前研究 POD酶谱 多以小麦样 品鲜重为基础 ，本 电泳每个处理 的蛋 白质总量均相
同，避免了处理间制样过程 中发生误差，更准确地反映 了POD的变化。POD酶谱中 2种小麦
品种变化总趋势基本一致，74 kD在春性小麦生长到 76 d时，活性突然降低 ，此时幼穗分化
已是单棱末期；冬性小麦 PH85—1 6生长到 1 36 d时 74 kD活性也突然减弱，这时 PH85 16也
处于单棱末期。从这一点看，74 kD活性强弱，可能与苞原始体分化或穗轴分化有关，是小麦
生理 变化过程 中一个重要 的氧化还 原酶 。
2个品种在生长到 46 d时 (图 1、2中 a 、b )酶带发生显著变化，恰好在这次取样的前
一 天发生气温突然降低 ，所以 74 kD酶活减弱 ，出现一条活性很强的 鲫 kD酶带 ，可能是由
于玲刺激引起小麦体内发生正常的生理反应 ，以后随着温度的平稳，POD酶带有如下变化过
程：90 kD减弱，85 kD出现，85 kD活性减弱，74 kD活性又重新加强 在小麦生长到 86 d
时，取样前一天也有一次降雪和气温骤降 ，这时冬性品种 74 kD活性减弱，43 kD消失 ，106
kD活性加强；春性小麦黑引一号 90 kD活性减弱，47 kD消失，1 46、106、52 kD活性突然
加强。这两次降温 POD酶带变化十分相似，这说明 POD对冷刺激特别敏感。关于 2次降温 ，
同一品种间激括 的POD酶带不一致，这可能是由于第二次降温伴有降雪或是因为生育期不同
所致。从总的 POD活性来看，第一次降温，冬性品种总酶活与前边相邻时期相比变化不大，而
后边相邻时期 POD活性显著增大，这可能是冬性品种受到低温刺激后，需要一个恢复期才能
使酶活加强。春性品种受到玲刺激后 ，POD活性短时间内增加，这可能是因为其对低温较敏
感 ，不需要长时间恢复，就可以使 POD活性加强。这一现象还有待于进一步探讨。春性品种
第二次降温酶活性加强，可能与春性 品种完成春化阶段，对环境比较敏感 ，或其它生理现象
维普资讯 http://www.cqvip.com
366 广 西 植 物 2O卷
有关 ，此时春性品种已发生严重冻害 2个品种在春化阶段总 POD活性强，与 (杨肇驯)“ 报
道一致 ，并且 POD酶带也发生十分显著变化，74 kD可能也与春化作用有关。冬性品种第 2
次降雪降温后 (图 2中 b )总酶活降低，这是否由于地表气温降至 0。C以下，小麦地上部分
生长缓慢，机体内部代谢活动降低引起?而春性品种的 POD活性加强是因为发生了严重冻害
所致?看来，POD可能是连接环境与代谢的一种重要酶类。
以上结果可以看出，POD是小麦体内最重要的氧化还原酶类之一，它具有多种同工酶，对
外界环境和小麦机体内部生理变化十分敏感。POD活性的强弱以及 POD某种同工酶的活化
或抑制 ，直接反映着小麦机体内某个生育时期的代谢状况，同时，还反映出外部环境因素变
化情况 。上述提到的几种在小麦各生育阶段变化 比较活跃的 POD同工酶，将为进一步研究小
麦机体内调控机制提供依据。在逆境条件下．POD的活性及同工酶谱均发生变化，这是机体
进 行正常代谢 活动 的一 种重要生理 调节功能 。
总之 ，为 了确 保实验结果 的可靠性 ，本试验 于 1997～ 1 998、1 998～1 999年度做 了 2次 重
复 ，实验结果基本一致。同时 ，每年度各品种均设 3个重复，随机排列，随机取样，从而降
低试验误差，使实验的精确性提高，更真实地反映大田小麦叶 POD的变化情况，电泳结果
表明重复间的 POD同工酶谱相同。本文仅就 1 997～L998年度 1个重复结果进行分析。但是 ，
由于本研究对象生长在大田环境中，受到各种外界环境因素的影响 ，加上小麦机体内部各种
代 谢活动 时刻变化 ，所 ，对 POD酶谱 的分析很难针 对某种环境 因素或生 理指标 ，有时很 可
能 是几种 因素综 合作用 的结果 。因此 ，有些结论还 有待 于进 一步研 究 。
参考文献 ：
C13徐存拴 ，吉爱玲 ，夏 民等．用复性电泳技术研究溶酶体蛋 白水解酶的性质和活性 [J]．河南科学，1 998，
16 (2)， 184～ 191
：2]孙景信 ，王玉琦 ，徐 元等 小麦 POD同工酶谱蛋 白条带中硒的中子活化分析 _J] 科学通报，1997，42
(16) 1 770～ 1773
(33习 岗．傅志东等 外磁场对小麦萌发期过氧化物酶台成 的影响及其激活效应 _J] 植物生理学报 ．1 993t
19 (2)： 155～ 161
4]杨肇驯 ．王文宏 ，谭克辉等．冬小麦幼苗春化期间过氧化物酶的变化 [J]．植物生理学报 ，1981，7(4)：
3】1～ 3 L6
[j]慎 攻 ，王彩莲 ，徐 刚等．辐射对大麦过氧化物酶 同工酶谱 影响的初步研究 EJ] 遗传 ，1991．13
(1)： 7～ 9
[6]童 哲 ，崔郁英 ，王健菊等．小麦幼根 和幼苗中几种同工酶的研究 [J]．植物学报 ，1 980，22(2)：147
～ 150
C73王 莹，李效宇，徐存拴等．海带、裙带菜和紫菜蛋白酶谱的研究 [J]．植物学报，1998，40(10)：939
～ 946
C83 geusseD C，Dowdle E B．Electrophoretic Analysis of Plasminogen Activators in Polyacrylam[de Gels Con—
taining Sodium Dodecylsulfate and Copolymertzed Substrate[J]．， m￡B km，1 980，102：196~202
(93 Neuhaus—Steinmetz U t Xu C-S，Fracela F et a1．Heat Shock Response and Cytotoxicity in C6 Rat Glioma
Cells：Structure—activity Relationship。f Different Alcohols_J] Mo!l~harmacology，1994，45：36~41
[10]Scandalios，J G．Isozyme in Development and Differentiation EJ] Ann Rev Plato Physiol，1974，25：225
～ 258
[】13 Neuhof V PhilippK ，ZimmerH G A Sfnpie．Versatile，Sensitive and VolumeIndependentMethodfor
Quanthative Protein Determination which is Independent of Other External Influences[J]．z Physml
Chem ， 1979，360；1657～ 1670
(12]Laemml[UK，Cleavage of Structural Protdns During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4[J]．
N oXure，1970，2．27：680～ 685
维普资讯 http://www.cqvip.com