全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(6)：827— 831 2011年 11月
巫山淫羊藿愈伤组织细胞的悬浮
培养条件优化的初步研究
韩素菊 ，黎云祥
(1．绵阳师范学院，四JlI绵阳 621000；2．西华师范大学 ，西南野生动植物
资源保护教育部重点实验室 ，四川 南充 637002)
摘 要：通过研究接种量、激素配比、糖浓度、培养基种类对巫山淫羊藿悬浮培养细胞生长及其愈伤组织黄酮
类含量的影响，建立了巫山淫羊藿细胞悬浮培养的技术体系。结果表明：巫山淫羊藿愈伤组织细胞悬浮培养在
B5基本培养基中并附加 1．0 mg·L-12，4一D和0．2 mg·L- BA，蔗糖浓度40 g·L- ，接种量每 3O mL为鲜重2 g
时，黄酮类化合物含量最高。说明用松脆的巫山淫羊藿胚性愈伤组织可容易建立理想的悬浮细胞培养体系。
关键词：巫山淫羊藿；细胞悬浮培养；黄酮类化合物
中图分类号 ：Q945 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2011)06—0827—05
Primary study 0n suspension cell culture
n T 1 ● ■ ● T
0I E m m eatun wu$ ane
HAN Su_Ju1，LI Yun-Xiang2
(1．Mianyang Normal University，Mianyang 621000，China；2．ChinaWest Normal University，Key
Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation，Nanchong 637002，China．)
Abstract：The technological system of cel suspension culture by the flavonoids content of E．wushanense was
established through studing the effect of inoculation concentration，hormone combination，sugar concentration
and various medias．The result showed that the suspension culture optimum medium of E．wushanense was
B5 medium supplemented with 1．0 mg·L～2，4-D and 0．2 mg·L～6-BA，the sugar concentration was 4．O％
and the optimum inoculation concentration was 2 g per 30 mL．The highest content of the total flavonoids ap—
peared on the medium．
Key words：Epimediun wushanense；suspension cell culture；flavonoids
巫山淫羊藿(Epimediun wushanense)，来源于
小檗科(Berberdiaceae)淫羊藿属(Epimedium)的多
年生宿根性草本植物。李时珍《本草纲目》中称其有
“益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”之功效。现代药
理实验研究表明，淫羊藿能增加心脑血管血流量，促
进造血功能、免疫功能及骨代谢，具有抗衰老、抗肿
瘤，补肾阳，强筋骨，祛风湿等功效，临床应用十分广
阔(国家药典委员会，2000；李晶晶等，2002)。淫羊
藿药用历史悠久，其有效成分为淫羊藿甙(Icarin)
等黄酮类化合物次生代谢产物和多糖 (郭宝林，
1999)。随着现代中药产业化的进程，现代科学对淫
羊藿的深入研究，新的疗效的不断发现，以淫羊藿为
主要原料的中成药、民族药产品不断问世，市场对淫
羊藿需求量愈来愈大，使其野生资源渐有不能满足
收稿 日期：2010-11一O2 修回日期：201l一07—2O
基金项目：四川省教育厅重点项目(09ZX011)；四川省科技厅应用基础研究项目(2008JY0158)；四川省重点实验室开放基金项目(XNYB09一O4)
LSuPP。 。dby K Y Project of Sichuan Education Department(09ZX011)；Basic Research Project of Sichaun Science and Technol0gy Department
(2oo8JYo158)；Open Pund for Key Laboratory of Siehuan Pr0vinciaI(XNYB09—04)]
作者简介：韩素菊(1976一)，女，N Jl资中人，硕士，讲师，主要从事植物生理研究
。
通讯作者：黎云祥，教授，博士生导师，(E-mail：)yx
_ li@263．net
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需求之虞。国内外淫羊藿细胞悬浮培养及其黄酮含
量的研究鲜见报道。
本项目通过研究接种量、激素配比、糖浓度、培
养基种类对悬浮培养细胞生长及其愈伤组织总黄酮
含量的影响，建立了巫山淫羊藿细胞悬浮培养的技
术体系，以期为巫山淫羊藿野生资源保护以及建立
高效的淫羊藿黄酮离体生产体系提供技术基础。
1 材料与方法
I．1材料培养
从淫羊藿(E．wushanense)幼嫩叶片诱导得到
的愈伤组织，经过继代培养反复筛选后选取生长均
一
，质地疏松，分散性好的淡黄色的愈伤组织作接种
材料。在愈伤组织接种继代 16 d后，接种在培养液
中进行振荡培养(120 rpm)，光照 12 h·d～。培养
液采用同继代愈伤组织的培养基相同的激素和蔗糖
浓度配比的 LS培养基+2，4一D 2．0 mg·L。+0．5
mg·L 6-BA+Sugar 30 g·L一，只是不加琼脂(韩
素菊，2007)。培养瓶采用 i00 mL的三角瓶。每瓶
中加培养液 3O mL。悬浮培养初期 10 d后用 120
目的不锈钢筛对培养物进行过滤，除去大细胞团，保
留分散程度好的小细胞团及单细胞。培养初期每半
个月换培养液 1次，每次换液时将培养物静置，倒去
上层 2／3培养液，保留I／3原液，加入 2／3新液。悬
浮培养初期每半个月继代 1次，2次后，逐步缩短为
I周继代 1次。这样通过 4～5次继代培养，即可得
到只含单细胞或小细胞团的培养物。将这些细胞混
匀，得到悬浮培养细胞。
1．2培养方法
将得到的细胞悬浮培养物在培养6 d后，用 400
目不锈钢筛网过滤收集细胞。然后在超净工作台上
用电子天平称量一定数量的细胞接种到分装有 30
mL液体培养基的 100 mL三角瓶中到进行培养。
1．3悬浮培养细胞生长实验参数的测定
以悬浮培养细胞的鲜重 ，干重及总黄酮含量为
生长指标，所得实验结果为4～5个平行试样的平均
值。细胞鲜重测定：20 d悬浮培养结束，用 400目不
锈钢筛网过滤收集细胞，用蒸馏水洗去细胞表面的
培养液，再用滤纸吸取多余水分，最后称量得到细胞
鲜重。细胞干重的测定：把收获的细胞测其鲜重以
后，置于 60℃的烘箱中过夜烘干至恒重，称量得细
胞干重 。
细胞增长率 一(收获细胞湿重一接种细胞湿
重)／接种细胞湿重 ×100 。
培养物中总黄酮含量测定：总黄酮含量采用分
光光度法(胡筱等，2004)。将悬浮培养细胞收集，洗
涤 ，60℃烘干至恒重，研细 ，取 0．05 g粉末 至三角
瓶中，加入 85 乙醇 10 mL浸泡，室温振荡 48 h。
过滤得到总黄酮提取液。取滤液 1．0 mL于试管
中，再加 入 10 mL 85 乙醇摇 匀得 到样 品液 ，在
269．56 nm处测吸光度。根据标准曲线计算相应样
品中总黄酮的含量。用淫羊藿甙标准品以同样方法
表 l 接种量对淫羊藿悬浮培养细胞生长的影响
Table 1 Effects of different inoculum densities on the growth of suspension cells of E．wushanense
测 得 标 准 曲 线 为：C一25．349A一0．2225，R。一
0．9990，其中 C为测量样品中总黄酮含量(／．tg·
mL )，然后再计算出每瓶培养出的悬浮细胞中的
总黄酮含量与产量。
2 结果与分析
2．1初始接种密度对悬浮培养细胞生长的影响
称 1、2、3 g悬浮培养细胞接种到添加了 2·O
mg·L 2，4一D，0．5 mg·L- BA、蔗糖30 mg·L 的
30 mL的 LS培养液中。20 d培养结束后收集细
胞，测量细胞增长率。悬浮培养中，初始接种量的多
少对细胞的生长有很大的影响，这与植物细胞具有
群体生 长特性有 关，单个细胞难 以生长、繁 殖
(Dornenburg and Seydel，2008)。由表 1可以看 出，
初始接种量在 1～2 g(每 30 mL培养液)范围内，细
胞增长率在2 g时达到最大值，而此时的悬浮培养
细胞颗粒均匀，N,NNf~，分散性好(图 1)；如继续
6期 韩素菊等：巫山淫羊藿愈伤组织细胞的悬浮培养条件优化的初步研究 829
增加接种量，细胞增殖倍数呈下降趋势，培养细胞所
得的干重也没由于接种量的增倍而增倍，此时的悬
浮培养液也变的混浊，镜检时发现有很多空细胞，瓶
壁上也聚集了很多的衰败细胞或者巨型细胞(图 2)，
图 1 悬浮培养细胞
Fig．1 Suspension Cell
所以悬浮细胞系在继代培养过程中，初始接种量以
每 30 mL的液体培养基加入 2 g左右的培养物为
宜。接种量过低时，细胞生长速率下降，过高反而抑
制细胞生长。说明接种细胞密度需要达到一定量才
图 2 巨型细胞
Fig．2 Giant cell
有利于悬浮细胞生长，适合淫羊藿悬浮细胞培养的最
适宜密度为3O mL液体培养基加入 2 g鲜重细胞。
2．2激素配比对淫羊藿细胞生长的影响
以LS为基本培养基，蔗糖 30 g·L ，pH值调
至 5．8，接种量为每瓶 2 g。2，4一D分别取 0、1．0、
2．0、3．0(mg·L- )4个水平，6-BA分别取 0、0．2、
0．4、0．5(mg·L )4个水平。进行 2因素 4水平 16
处理的试验 。
表 2 激素配比对细胞生长的影响
Table 2 Effects of 2，4-D and 6-BA on the growth of cels
注：表中x为各种激素水平下细胞干重的平均值。
830 广 西 植 物 31卷
大多数细胞悬浮培养时，激素 2，4一D一般有利
于细胞的生长(杨帆等，2010)。因而巫山淫羊藿细
胞悬浮培养时，采用的激素种类同于获得疏松愈伤
组织时的激素 ，即 2，4一D和 6-BA。
从表 2可以看出，2，4一D在取 1．0 mg·L 时收
获细胞生物量最大，而 BA在取 0．2 mg·L 时收获
的细胞生物量最 大。当浓度在 1_0～2．0 mg·L
范围内时悬浮培养细胞的鲜重和干重基本稳定。当
2，4一D高于3 mg·L 镜检时，细胞内含物减少，空
细胞和变形细胞增加，细胞干重下降。故较适合细
胞悬浮生长的激素组合为 2，4一D1．0 mg·L～，6-
BA0．2 mg·L 。
表 3 不同蔗糖浓度对悬浮细胞培养的影响
Table 3 Effects of different sugar concentration on
the growth of suspension of E．wushanense cels
蔗糖浓度
处理 Concen一
序号 tration
No． of sugar
(g·L一 )
细胞干重
Cel dry weight(g／bottle DW)
工 Ⅱ Ⅲ X
养液中的适合浓度。
当蔗糖浓度在 2O～40 mg·L- 范围内时，淫羊
藿悬浮培养细胞的生长随浓度的升高而升高，当在
40 mg·L- 时，细胞鲜重最大。蔗糖浓度过高，在 50
mg·L- 时，淫羊藿细胞生长受到抑制。因此，蔗糖浓
度以在培养基中添加蔗糖 40 mg·L- 为宜，能使淫羊
藿细胞生长良好，细胞鲜重和干重均能达最大值。
2．4培养基对淫羊藿悬浮细胞生长和总黄酮含量的
影响
用电子天平称量过滤收集到的 2 g悬浮培养细
胞，接种到附加 1．0 mg·L 2，4一D，0．2 mg·L。BA
和 40 mg·L- 蔗糖的 MS，LS，B5，1／2MS，N6的培
养液中。淫羊藿细胞在不同的液体培养基中生长和
总黄酮的合成情况不同，在 1／2MS培养基中，细胞
生长较好，但所得细胞干重却较低，可能在 1／2MS
培养基里的细胞含水量多，进而干重偏低；而 MS，
B ，N 培养液的细胞生长基本相同，但在 B 培养基
中的细胞干重最大，总黄酮含量也最高，达 5．47 ，
说明 B 培养液有利于黄酮的合成；而在 LS培养基
中的细胞生长和黄酮含量都较低。所以 B 培养基
有利于巫山淫羊藿细胞的生长及总黄酮的合成。而
N。培养基有利于新疆雪莲细胞的生长和总黄酮的
合成((朱朝德，1998)，可能黄酮的合成需要的培养
基种类与培养的物种有关。
表 4 不同基本培养基对淫羊藿悬浮培养细胞生长和黄酮合成的影响
Table 4 Effects of different basic media on suspension cel of E．wushanense
3 讨论
3．1悬浮培养体系的建立
细胞悬浮培养的研究是植物细胞生产工业化必
经的重要步骤(汤行春，2OO7)，但要建立良好的细胞
悬浮培养系统，必须先获得高脆性愈伤组织，获得松
散的高脆愈伤组织常常是由固体培养过渡到悬浮培
养的先决条件(李士生，1990；陈崇顺，1994)。在悬
浮细胞系的建立过程中，植物细胞生长调节剂是影
响细胞状态的重要 因素(王海波，1991；张学英，
2004)。本实验通过观察不同浓度 2，4一D、6一BA对
悬浮细胞生长的影响，在悬浮细胞培养过程中，2，4一
D浓度不宜过高，以 1．0 mg·L。为宜并附加 0．2
mg·L BA，培养的悬浮细胞为小颗粒状、淡黄色、
分散性好、细胞生长快，且细胞产量高(图 1)。在实
验中，初始接种量对悬浮细胞生长影响很大，当细胞
接种量为每 3O mL液体 1．0 g时，淫羊藿悬浮细胞
生长缓慢，而且最后收获的细胞鲜重与干重产量低，
接种量在 3．0～4．0 g时，悬浮培养液在继代第 10
天左右就会变混浊，瓶壁上也会沉积一些衰败的死
细胞。在悬浮培养细胞体系中，只有适宜的细胞密
5 6 O O一 0 I． 3 71 自㈣ 值 在
O O O O — 球
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6期 韩素菊等：巫山淫羊藿愈伤组织细胞的悬浮培养条件优化的初步研究 831
度才有利于细胞的生长。
3．2不同种类的液体培养基对淫羊藿悬浮体系建立
的影响
不同种类的液体培养基对植物细胞的生长和次
生产物的形成有很大的影。目前，比较适合多种植
物的一般营养条件的培养基，有多种配方可供选择，
如 MS，KC，White，B ，N。，LS等，有的研究表明降
低培养基中氮源的总浓度能促进黄酮类化合物的合
成(Yamakawa，1983)。本实验结果也表明含低浓
度铵的 B 培养基有利于巫山淫羊藿细胞生长及黄
酮类化合物的合成。
综上所述，利用松脆的胚性愈伤组织，可很容易
地建立起理想的巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系。悬
浮体系保存在B5基本培养基中并附加 1．0 mg·L
2，4一D和0．2 mg· BA，蔗糖浓度 40 g·L ，接种
量每 30 mL为 2 g，这样建立起的悬浮细胞培养体
系能获得高产黄酮的含量可接近淫羊藿黄酮的含
量。说明建立悬浮细胞培养系研究细胞生长和次生
代谢产物积累规律对于植物细胞培养放大和提高次
生代谢产物的得率具有重要意义，也是未来植物细
胞培养生产次生代谢产物发展的主要方向。
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