全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(6)：889— 893 2009年 l1月
多倍体罗汉果 PCR—RFLP参数的优化与应用
韦荣昌 一，李 锋 ，黄夕洋2*，蒋水元2，蒋向军3，戴 俊4，李志刚
(1．广西大学，南宁53004；2．； 毳广西植物研究所，广西桂林54106；3．桂林亦元生
现代生物技术有限公司，广西 桂林 541004；4．广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541004)
摘 要：以多倍体罗汉果 DNA为材料，采用 L16(45)正交组合试验和单因素梯度试验 ，研究 NIg2+、dNTP、引
物、Taq DNA聚合酶、模板 DNA浓度和退火温度、循环次数等对 PCR扩增结果以及内切酶量 、酶切时间对酶
切反应的影响。结果表明 ，多倍体罗汉果 RFLP最优 PCR反应体系和扩增参数为：在 25 L扩增反应体系
中，10×Buffer 2．5／*L，MgCI2 1．5 mmol／L，dNTP 0．2 mmol／L，引物 0．1／*mol／L，Taq DNA聚合酶 2．0 U，模
板 DNA 60 ng；退火温度为 56℃ ，循环次数为 35次。酶切反应体系：内切酶 10×Bufer 2．0 L，内切酶 5．0
U，PCR产物 1 5 L，超纯水补至 2O L；酶切时间 2 h。
关键词 ：多倍体罗汉果；PCR—RFLP；酶切反应；优化与应用
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3l42(2009)06 0889—05
Optimization and prelimi nary study on the PCR-
RFLP parameter of polyploidy Siraitia groSvenor
WEI Rong—Chang 一，LI Feng2，HUANG Xi—Yang2 ，JIANG Shui—Yuan2，
J IANG Xiang-J un0，DAI J un4，LI Zhi—Gang]
(1．Guangxi University，Nanning 530004，China；2．Ouangxi Institute of Botany，Guang．zi Zhuang Aulonornous
Region and Chinese Academy of Sciences，Guilin 541006，China；3．Guilin Sunnyli Modern Bio-
INC．，Guilin 541004，China；4．Guangxi Normal University，Guilin 541004，China)
Abstract：In this paper，the DNA of polyploidy Siraitia grosvenorii was regarded as the research object，several im—
portant factors including MgClz，dNTP，primer，Taq DNA polymerase，template DNA ，annealing temperature，ampli—
fication and enzyme quantity，digestion reaction time were optimized by L16(4 )orthogonal design experiment and
single factor experiment in order to investigate the effects on the results of PCR amplification and digestion reaction
．
The test results showed that a total volume of 25 L PCR reaction system contained 10×Buffer 2．5 L，MgCl2 1
． 5
mmol／I ，dNTP 0．2 mmol／L，general service primer 0．1 lmol／I ，Taq DNA polymerase 2．0 U，template DNA 6O
ng，and annealing temperature was 56℃ ，amplification for 35 cycles was optimizational PCR amplification reaction of
RFLP of polyploidy S．Krosvenorii．The total volume of 2O“L digestion reaction system contained digestion enzyme
10×Buffer 2．0 L，digestion enzyme 5．0 U，PCR product 15 L，digestion reaction time 2 h
．
Key words：polyploidy Siraitia grosvenorii；PCR—RFLP；digestion reaction；optimization and application
罗汉果 (Siraitia grosvenorii)是单性、雌雄 异
株的葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属多年生藤本植
物(路安民等 ，1984)，为我国所特有，主要产于广西
的永福、临桂、龙胜等地。罗汉果甜苷作为一种综合
收稿日期：2009—06一l8 修回日期：2009—10—13
基金项目：国家科技支撑计划项目(2006BAIO6A11一O1)；广‘西科技攻关项目(桂科攻 5—2—2)；桂林科技攻关项目(20080103—1)[supported by National
Key Technology R D Program(2006BAl06A1l一01)；Key Technologies Research and Development Program of Guangxi(5-2～2)；Key Techn0】0 es
Research and Development Program of Guilm(20。801。={一1)]
作者简介：韦荣昌(1983一)，男 ，广‘西梧州人，硕士研究生，主要从事药用植物学和分子生物学研究。
通讯作者(Author for c()rrespondence，E～mail：xiyang0687@l63．tom)
89O 广 西 植 物 29卷
性状最佳的天然甜 味剂 ，广泛应用于食品、保健品、
药品中，适合所有人群长期食 用，是糖尿病人 、肥胖
者 、高血压患者的理想糖替代品(李典鹏等 ，2000)。
多倍体罗汉果具有形态上 的巨大性，可大幅提高相
应部位的产量 ，增强抗逆性，提高活性成分含量，其
中三倍体罗汉果还具有无籽的特性 ，大大提高 了整
果利用率和甜苷提取收得率 ，对整个罗汉果产业具
有里程碑的意义。
限制性片段长度多态性 一聚合酶链式反应 (re—
striction fragment length polymorphism—，polymer’·
ase chain reaction，PCR—RFLP)是 一种 模 拟体 内
DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段
技术。PCR RFI P标记具有很高的分辨能力 ，又以
共显性的方式遗传，其结果有很强的重复性和准确
性，在高密度遗传连锁图谱、指纹图谱的构建，群体
遗传与系统演化等研究领域有着重要 的应用价值
(张婷，2007)。随着 DNA标记技 术的发展 ，PCR—
RFLP标记 已经广泛应用于猕猴桃属 (李健仔等，
2003)、仲彬草属(张利等，2006)、黄芪亚族(丁士友
等 ，l995)、黄精族(吴世安等，2000)等植物的系统学
和分子水平遗传多样性研究。而 PCR—RFLP在多
倍体罗汉果方面的应用至今一片空白，因此，通过对
多倍体罗汉果 PCR—RFI P参数的优化与应用初探，
可以为多倍体罗汉果的分子育种、群体遗传与系统
演化、高密度遗传连锁 图谱的构建和新品种选育等
研究与综合利用提供一定的指导作用 。
1 材料与方法
1．1试 验材料
多倍体罗汉果新鲜叶片采 自广西桂林兴安县漠
JI J乡的罗汉果种植基地。选 取生长状 况 良好 的植
株，采集 10片左右健康成熟叶片 ，用硅胶干燥保存 ，
带回实验室中待用。
1．2主要仪器
PCR 仪 (美 国 BIO—RAD 伯 乐 公 司，Model：
P FC一200)；微型高速离心机 ；电泳槽 ；电泳仪；凝胶
成像系统；微量移液器 ；均为国外进 口。
1．3主要试 剂
脱氧核糖核苷酸(dNTPs)和引物(primer)购于
上海生工生物工程技术服务有限公司；Taq I)NA聚
合酶(5 U／~L)和限制性 内切酶购于 MBI公司；
I ambda DNA／HindⅢ+EcoR I Markers购于华美
生物工程公司。
1．4试验方法
1．4．1多倍体罗汉果总 DNA的提取 采用改 良的
CTAB(2×)法 (Doyle，1987)提取多倍体罗汉果叶
片的总 DNA。
1．4．2 PCR—RFLP反应体 系的优化 经初步试验
筛选后选择 叶绿体基 因组通用引物 trnD—trnT(5
ACCAATTGAACTACAATCCC一3 ， 5 -CTAC—
CACTGAGTTAAAAGGG一3 )为优化试验用 的引
物。采用五 因素四水平的正交试验设计选择最佳试
验条件 。在 25 L扩 增 反 应体 系 中设计 Mg 、
dNTP、随机引物 、Taq DNA聚合酶和模板 DNA浓
度五因素四水平(表 1)，正交试验方案采用 u 6(4。)
(杜荣骞 ，1999)正交表(表 2)。在 BAO RAD热循
环仪上进行 PCR扩增反应 ，基本反应程序为：94℃
预变性 3 min；94℃变性 1 min，52℃退火 50 S，72
℃延伸 2 min，40个循环 ；72℃延伸 7 min。PCR扩
增产物经 1．5 琼脂糖凝胶电泳 ，EB染色后在凝胶
成像系统上观察并照相。
表 1 多倍体罗汉果 PCR—RFLP扩增
反应体系五因素四水平表
Table 1 Five factors and four levels of PCR—RFLP
amplification reaction system of polyploidy
Siraitia rosvenorii
1．4．3 PCR—RFLP反 应程 序 的优 化 进 一步对
PCR—RFLP扩增反应程序 中的退火温度 和循环次
数进行单因素梯度优化筛选 ，并 比较两者对扩增条
带清晰度的影响。退火温度、循环次数分别设计 4
个水平：52℃、54℃、56℃、58。C和 30次、35次、40
次、45次。PCR扩增产 物经 1．5 琼脂糖凝胶 电
泳，EB染色后在凝胶成像系统仪上观察并照相。
1．4．4酶切反 应 的优 化 在 2O L酶 切体系中，
PCR产物 15 L，lO×Buffer 2 I ，酶切温度 37℃，
限制性内切酶(Hind I1])和酶切时间分别设计 3个
水平 ：5 U、7．5 U、10 U 和 2 h、4 h、6 h，在 BAO—
RAD热循环仪上保温运行。酶切产物经 1．5 琼
6期 韦荣昌等 ：多倍体罗汉果 PCR—RFI P参数的优化与应用 89l
脂糖凝胶电泳，EB染色后在凝胶成像系统仪上观察
并照相。
表 2 多倍体 罗汉果 PCR—RFLP扩增反应
体系的 LI6(4 )正交试验方案
Table 2 L1 6(45)orthogonal test designed for the
system of PCR—RFLP amplification reaction
of polyploid Siraitia grosvenorii
0．10
0．20
0．30
0．40
0．10
0．2O
0．30
0．40
0．10
0．20
0．30
0．40
0．10
O．2O
0．30
0．40
2 结果与分析
2．1 CTAB法提 取总 DNA
利用 CTAB法从多倍体罗汉果 叶片材料 中提
取到了较高质量 的总 DNA，PCR—RFLP的结果 也
表明此法提取的总 DNA可以满意地扩增 出相应的
片段。部分多倍体罗汉果的总 DNA如图 1所示。
2．2 PCR—RFLP反应体系的优化结果
根据 L16(4。)正交试验方案，一共有 16个组合
试验，不同组合的PCR扩增结果存在一定的差异，
结果依次如图 2中 1—16泳道所示。
Mg。 对 PCR扩增的特异性和产量有显著的影
响，l一4泳道和 l3一l6泳道因 Mg 浓度过低或过高
而没有扩增出条带或扩增量极少无法进行下一步的
实验；另外，5泳道和 9一l2泳道的扩增结果中存在
模糊和拖尾现象而不如 6—8泳道的扩增效果好，其
中由于 7、8泳道中 dNTP浓度偏低或偏 高以及 引
物量的过高而影响了 PCR产物量 ，所以 6泳道扩增
糸 最清晰、明显且扩增产物量较多。
图 1 多倍体罗汉果的总 DNA
Fig．1 Total DNA of polyploid Sirailia NrOSVdg710r
M：Lambda DNA／Hind1I[+EcoR I Markers。下同。
图 2 多倍体罗汉果 PCR—RFLP
正交试验方案优化结果
Fig．2 The optimization results of orthogonal test
designed for PCR—RFLt of polyploidy
Siraitia g‘rosvenorii
因此，正交试验方案表 明，多倍体罗汉果 PCR—
RFLP最优扩增反应体系为：在 25 L扩增反应体
系 中，1O× Buffer 2．5 L，MgC12 1．5 mmol／L，
dNTP 0．2 mmol／L，引物 0．1／~mol／L，Taq DNA聚
合酶 2．0 U，模板 DNA60 ng，此条件下扩增图谱条
带清晰，信号较强，无背景干扰。
2．3 PCR—RFLP反应程序 的优化结果
2．3．1退火温度单 因素优化对 PCR—RFLP反应程
序的影响 退火温度是影响 PCR产物多不多，条带
亮不亮等特异性的较重要因素 ，退火温度与时间，取
决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列
的长度，在 Tm值允许范围内，选择较高的复性温度
可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高
PCR反应的特异性 。
图3中 l_4泳道依次分别代表优化 PCR—RFLP
扩增反应 程序试 验 中设计 的退火 温度： 2℃、54
7 3 9 O 7 4 7 5 搦 m
5
∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 加 舳 ∞ ∞ ∞ 加
5 O 5 0 5 O 5 O O 5 O 5 O 5 O 5
O 1 1 2 1 2 0 1 2 1 1 0 1 0 2 1
1 2 4 6 2 1 6 4 4 6 1 2 6 4 2 1
O O O O O 0 0 O O O O O O O 0 O
O O O O 5 5 5 5 O O O O 5 5 5 5
1 1 ； } 2 2 2 2 2 2 2 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 O 2 3 4 5 6
892 广 西 植 物 29卷
℃、56℃、58℃。从试验结果可知：52～58℃均可
扩增 出条带 ，但 2℃、58℃时扩增条带模糊且伴随
轻度拖尾现象；而 54℃、56℃时 的扩增条带清晰，
扩增产物量较多，为保证引物与模板的特异性结合 ，
提高 PCR反应的特异性 ，因此选择 56℃为最优退
火温 度 。
2．3．2循环次数 单因素优化对 PCR—RFLP反应程
序的影响 循环次数决定 PCR扩增程度 ，循环次数
主要取决于模板 DNA 的浓度 。一般的循环次数选
在 3O～40次之间，循 环次数越多，非特异性产物的
量亦随之增多。
图 3 多倍体罗汉果 PCR—RFLP退火温度优化结果
Fig．3 The optimization results of different annealing
temperature of PCR—RFLP of polyploidy
Siraitia grosvenorii
M 1 2 3 4
图 4 多倍体罗汉果 PCR—RFLI 循环次数优化结果
Fig．4 The optimization results of different cycles of
PCR—RFLP of polyploidy Siraitia grosvenorii
图 4中 1—4泳道依次分别代表优化 PCR—RFLP
扩增反应程序试验中设计的循环次数：30次、35次、
40次、45次。从试验结果可知 ：3O～45次循环均可
扩增 出条带 ，在 4O次、45次循环 时，由于循环数过
多，非特异性 产物量增 多并 有一定 的拖尾 现象 ；30
次、35次循环时，都能很好的扩增产物量，PCR产物
都已达到检测水平，但 3O次循环时扩增产物量有分
散现象，故选择 35次循环为最优循环次数。
因此，扩增反应程序 的优化试验表明，罗汉果
PCR—RFLP扩增的最优反应程序为：94℃预变性 3
min；94℃变性 l rain，56℃退火 50 S，72℃延伸 2
rain，35个循环 ；72℃延伸 7 rain。
2．4酶切反应的优化结果
通常 ，一个 5O L的反应体系中，l I 的酶在 1
×NEBufer终浓度及相应温度条件下反应 1小时
即可降解 1 g已纯化好的DNA。如果加入更多的
酶 ，则可相应缩短反应时间 ；如果减少酶的用量，对
许多酶来说 ，相应延长反应时间(不超过 16 h)也可
完全反应。
图 5 多倍体罗汉果 PCR—RFLP酶量优化结果
Fig．5 The optimization results of enzyme quantity of
PCR—RFLP of polyploidy Siraitia grosvenorii
M：Lambda DNA／HindⅢ十EcoR I Markers
图 5和图 6中的 l、2、3泳道分别表示 5 U、7．5
U、10 U和 2 h、4 h、6 h。从试验结果可知：内切酶
量 5 U、7．5 U、10 U 的扩增条带均为四条，且清晰
度基本一致，无拖尾现象，出于经济效益考虑，5 u
的内切酶量最优。酶切时问 2 h、4 h、6 h的扩增条
带也是四条 ，清晰、明亮度均基本一致，无背景干扰 ，
出于节省时间考虑 ，2 h的酶切时间最优。
3 讨论
PCR反应主要因素有 Mg。 、dNTP、引物、酶和
模板 DNA。其中，Mg抖对 PCR扩增的特异性和产
量有显著的影响，在一般的 PCR反应中Mg 浓度
为 1．5～2．0 mmol／L为宜 ，Mg纠浓度过高，反应特
异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq
DNA聚合酶的活性 ，使反应产物减少 ；在 PCR反应
中，dNTP应为 5O～200／lmol／I ，尤其是注意 4种
dNTP的浓度要相等 (等摩尔配制)，如其中任何一
7 3 9 0 7 4 7 5 播
5
6期 韦荣昌等：多倍体罗汉果 PCR—RFLP参数的优化与应用 893
种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起
(bD)
21 227
5148／2973
4269
3530
2027
1 904
1 587
1 375
图 6 多倍体罗汉果 PCR—P,FLP酶切时间优化结果
Fig．6 The optimization results of digestion reaction
time of PCR—RFLP of polyploidy Siraitia grosvenorii
错配 ，浓度过低又会 降低 PCR产物 的产 量，dNTP
能与 Mg 结合，使游离的 Mg 浓度降低；引物与
模板 DNA互补的程度决定了 PCR产物的特异性 ，
通常以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓
度偏高会引起错配和非特异性 扩增 ，且可增加引物
之间形成二聚体的机会 ；Taq DNA聚合酶浓度过高
可引起非特异性扩增 ，浓度过低则合成产物量减少；
模板 DNA的量一般在 2O～200 ng均可进行 PCR
扩增。本试验 PCR—RFLP反应体系的优化是运用
正交试验设计并严格遵循上述原则 的基 础上进行
的，正交试验设计作为研究 多因素多水平的一种设
计方法 ，通过选择的所有水平组合 即得正交表，表中
的每个因素的每个水平与另一个因素各水平各碰一
次是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性
的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分
散，齐整可比”的特点，故正交试验设计是一种高效
率、快速 、经济的实验设计方法 。试验结果准确，稳
定性 良好。此外，影响 PCR—RFLP的一个重要因素
就是污染，极其微量的污染即可造成假阳性 的产生。
在做 PCR时，习惯把 dd H。O、l0×Buffer缓冲液、
Mg 、dNTP、引物、模板 I)NA、Taq DNA聚合酶合
到一个 Ep管 内混匀 ，再分装 ，这样 可以减少操作 ，
减免污染 ，增加准确性。值得注意的是 ：在 Ep管_丌
盖 、吸¨和污 进 怆的 复吸佯以及』JI1样t,，，因空
气 液14：面 、擦形成 随 气别处飘敞的气溶咬而
污染，尤其是 1O×Buffer缓 冲液最容易形成气溶
胶 ，故在操作时 ，尽可能一步到位 ，避免反复吸取，同
时开盖时要轻开轻盖 ；此外 ，酶应最后被加人到反应
体系中(在加酶前所有其它试剂都应加好并预混和
快速离心)，且由于 Taq DNA聚合酶和限制性内切
酶的密度比其它试剂 的密度大，故在加酶后一定要
吹打混匀，可用枪轻轻地反复吸取或用手指轻弹 Ep
管底管壁 ，然后再快速离心即可。
参考文献 ：
杜荣骞．1999．生物 统计学 I-M]．北 京 ：高 等教育 出版 社，241
— — 248
Ding SY(丁士友 )，Gu HY(顾 红雅 )，Qu LJ(瞿礼嘉 )，et a1．
1995．A preliminary study on the use of RFLP analysis of the
PCR amplified products in the systematic investigation of the
subtribe astragal inae(fabaceae)(PCR产物的 RFLP分析在黄
芪亚族(豆科)系统学研究 中的应用初探 )I-j]．Acta Bot Sin
(植物学报)，37(2)：97—102
Doyle JJ，Do yle JL 1987．A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissuel,J]．PhytochemBull，19：11—15
Li DP(李典鹏)，Zhang HR(张厚瑞)．2000．Studies and uses of
Chinese medicine Luohanguo-a special local product of Guangxi
(广西特产植物罗汉果的研究与应用)[J]．Guihaia(广西植
物)，20(3)：270—276
Li JZ(李健仔)，Li SG(李思光)，Luo Yt (罗玉萍)，et a1．2003．
PCR—RFLP analysis on chloroplast DNA of actinidia Ra(猕猴桃
属植物叶绿体基 因 PCR—RFLP分析 )[J]．Bull Bot Res(植物
研究)，23(3)：328—333
Lu AM(路安 民)，Zhang ZY(张志耘)．1984．The genus siraitia
merr．In China(中国罗汉果属植物)[J]．Guihaia(广西植物)，
4(1)：27—33
Zhang L(张利)，Zhou YH(周 永红)，Zheng YL(郑 有良)，et a1．
2006．PCR-RFLP analysis of plasmon in Kengyilia populations
(仲彬草属物种细胞质基 因组 PCR-RFLP分析)[J]．Acta Prat
Sin(草业学报)，15(3)：115—122
Zhang T(张婷 )．2007．Molecular marking technologies and their
applications in conservation genetics(分子标记技术及其在保护
遗传学中的应用)l,J]J Wuhan Bioengineeing Institute(武汉生
物工程学院学报)，3(2)：109—1 10
wu SA(吴世安)，Lv HI (吕海亮)，Yang J(杨继)，et a1．2000．
Molecular systematic studies on the tribe Polygonateae(s．1．)in
China based on RFI Ps data of PCR—amplified chloroplast DNA
fragments(叶绿体 DNA片段的 RFI P分析在黄精族系统学研
究中的应用)[J]．Atta Ph3 tota2olt Sin(植 物分类学报)，38
(!)．97— 1】0