全 文 ：广西植物Guihaia28(6)：741—745 2008年11月
海南主要普通野生稻的调查及利用
RAPD技术进行鉴别分析
王晓玲1，2，郭安平1*，孔华1，刘恩平1，贺立卡1
(1．中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口571101；2．江西省农业科学院水稻研究所，南昌330200)
摘要：通过对海南现存的主要普通野生稻资源进行考察，报道了海南主要普通野生稻的最新生存状况；并
用RAPD技术对其进行分析。从供试材料中筛选出具有多态性的RAPD引物13条，共扩增出155条带，其
中多态性条带120条，多态性条带比率(PPB)值为77．42％。UPGMA聚类结果表明：海南主要普通野生稻之
间遗传关系较复杂、差异较明显，并将海南主要普通野生稻资源划分为5个小类群，可以很好地将海南本地野
生稻与收集保存的野生稻鉴别开来，为海南普通野生稻资源的合理利用与有效保护提供了重要依据。
关键词：普通野生稻；资源；RAPD标记；遗传多态性
中图分类号：Q949．71文献标识码：A文章编号：1000—3142(2008)06—0741—05
Investigation，identificationandanalysisofmai
commqwildrice(Oryza∥pogmn 11 l aru1 D聆)，
fromHainanProvincebyRAPD
WANGXiao-Lin91，2，GUOAn-Pin91*，KONGHual，
LIUEn-PingI．HEL1’-KaI
(1．InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology，ChineseAcademyofrwpicalAgriculturalSciences．Haikou
571101，Chim；2．RiceResearchInstitute，JiangxiAc demyofAgriculturalSciences，Nanchang330200。China)
Abstract：NowadaysexistingstateofcomlTlOnwildrice(Oryzarufipogon)fromHainanProvincewasinvestigatedin
thispaper．Geneticdiversityof hemwerestudiedanresearchedbyrandomamplifiedpolymorphic(RAPD)prim—
ers．Total13RAPDprimerswerescreened．FromRAPDmarkergraphs，155bandswereg nerated，including120
polymorphicbands，with77．42％proportionofpolymorphicbands(PPB)．ClusteringanalysisbyUPGMAshowed
that0．rufipogonfromHainancouldbeclassifiedinto5types．Commonwildricesbetweenlocalspeciesandcollect—
edspeciescouldbeidentified．Themodelofutilizingreasonablyandprotectingeffeeflynaturalpopulationofeon-llnon
wildricewasproposed．
Keywords：corflmenwi drice(Oryzarufipogon)；resource；RAPDMarker geneticdiversity
稻属(Oryza)是和人类生存密切相关的物种之
一，现有22个种，其中2个为栽培稻，其余均为野生
稻(卢宝荣等，2001；张乃群等，2002)。我国有3种
野生稻：普通野生稻(D．rufupogon)、药用野生稻
收稿日期：2007-11-07修回日期：2008—05-16
基金项目：国家农业部农业结构调整重大技术研究专项(06-II-03B)；中央级公益性科研院所基本科研业务费热带区转基因植物生物安全及生物多
样性研究；华南热带农业大学创新基金(RBCX-0505)[SupportedbytheSpecialFundforMajorTechnologyResearch0fAgriculturalStructureAdjust—
m∞t，MinistryofAgricuhure(06-11-03B)；SpecialFundforBasicS ientificResearchoftheNatiomdNon-profitInstitutesfromChineseGovelTtment#Inno-
vationFoundationofS uthC inaUniversityofTropicalAgriculture(RBCX-0505)]
作者简介：王晓玲(1981一)，男，江西樟树市人，在读硕士，主要从事野生稻研究，(E-mail)wgxoling@163．corn．
’通讯作者(Authorf rcorrespondence，E-mail：gap211@126．eom)
万方数据
742 广西植物 28卷
(o．officinalis)和疣粒野生稻(o．meyeriana)。海
南是我国具有全部3种野生稻的两个省份之一，而
且这3种野生稻资源丰富、类型复杂，因此海南野生
稻在我国栽培稻起源演化过程中具有相当重要的地
位，但是近年来海南普通野生稻和其他地方的野生
稻一样遭到了严重的破坏，原来有的许多地方现已
经或即将消失。为此，1992年，我国将这3种野生
稻均列为国家二级保护植物(高立志等，1999)。
海南现存的普通野生稻资源遗传背景还不清
楚，过去仅根据其地理分布对海南普通野生稻进行
居群划分，或对个别居群进行遗传关系分析(陈良
兵，2004；陈良兵等，2005)，缺乏遗传水平上的系统
研究，很难提供科学依据，加之海南是个天然的育种
温室，除具有本地野生资源外，育种专家也会设法引
入外地资源，这对本地野生资源的研究与保护加大
了难度。RAPD标记现已广泛用于遗传分析(徐鑫
等，2005；何华勤等，2004；Virk等，1995)、基因定位
(庄楚雄等，2000；Yong等，1999IMohan等，1994)．
是一种非常廉价、有用的分子手段。本研究以收集
海南主要现存的原生境普通野生稻与3个收集种为
材料，运用RAPD分子标记技术，分析海南本地普
通野生稻居群间的遗传差异，区分保存了不久、但现
在又不明来历的野生稻，为海南现存普通野生稻资
源的科学利用和有效保护提供参考。
1材料和方法
1．1材料
以海南原生境收集的7个主要居群普通野生稻
(Oryzar“^pogon)及收藏、保存的3个野生稻为
表1海南现存主要普通野生稻调查表(2006年11月)
Table1 Investigationt bleofmaincommonwildriceinHainanProvince
材料，具体材料名称及详情见表1。
1．2方法
1．2．1材料的收集以当地主管部门介绍为主，对
海南普通野生稻进行原生境实地调察、收集部分材
料，并记录现存野生稻所占面积、原生境地理位置与
生态环境。
1．2．2儋州居群为例原生境与异位保存后的形态比
较实地考种与异位保存一年后考种进行对比，比
较两种不同生态条件下普通野生稻的株高、穗长、穗
颈长、剑叶长、剑叶宽、芒长等形态指标，用SAS9．0
软件进行统计分析。
1．2．3基因组DNA的提取用CTAB法提取普通
野生稻总DNA，参照谢中稳等(1999)和沙爱华等
(2005)的方法。
1．2．4RAPD引物筛选及扩增参照晏慧君等
(2006)、郭安平等(2001，2002，2003)，先选取1份材
料进行预备试验，从选择合成的40个RAPD引物
中筛选出13个能够扩增出清晰条带、反应稳定的
万方数据
6期 王晓玲等：海南主要普通野生稻的调查及利用RAPD技术进行鉴别分析 743
RAPD引物(表1)。扩增试剂为：TaqDNA聚合酶、
dNTP购于上海申能博彩，随机引物由上海生工合
成。PCR反应体系包括：DNA模板(50ng·mLl)
1．0gL，10×PCRbuffer(withM92+)2mL，TaqD-
NA聚合酶(5U．mL1)0．4肛L，引物(20mmol·
Lil)各0．5肛L，dNTPs10mmol·L-1)0．5pL，加
ddH20至体积为20pL。反应程序为：95℃预变性
5min；进人循环，每个循环96℃变性30s，36℃退
火30S，72℃延伸60S，共5个循环；再每个循环94
℃变性30S，36℃退火30S，72℃延伸60s，共40
个循环；最后72℃后延伸5rain，取出放置4℃冰
箱冷却、保存。电泳时用1．5％的琼脂糖凝胶，3：
40000goldenview染色。电泳条件：l×TAE电极
缓冲液，恒压90v，电泳1．5h。
1．2．5数据处理与聚类分析电泳图谱中，每一条
带代表引物与模板的一个结合位点，视为有效的分
子标记(顾红雅等，1998)，用DL2000和DLl00梯
度marker作为对照分子量标记，根据各条带迁移距
离，将电泳结果中稳定出现的条带(取强不取弱)的
有、无分别赋值为1、0，统计后将0、1矩阵输入Ex—
eel，采用NTSY孓PC2．1分析软件计算各材料之间
的Nei氏相似性系数和遗传距离，利用UPGMA法
(unweightedpairgroupmeanaverage)进行聚类分
析，建立系统树。
2 结果与分析
2．1海南主要普通野生稻现状
从2006年11月份对海南普通野生稻资源的实
地调察发现：海南普通野生稻基本属匍匐型，在靠近
堤岸处，由于营养丰富，借助堤岸的作用力，各个居
群都发现有部分呈现出了直立型。生长环境遭到了
不同程度的破坏。从原生境与异位保存一年后的形
态特征来看，株高、剑叶长、剑叶宽、穗长、穗颈长等
均有明显差异(表2)，其中，除株高、剑叶长之外，剑
叶宽、穗长、穗颈长之间都达到了极显著差异，说明
普通野生稻的形态特征与其生态环境(特别是营养
条件)有较大的关系。调查结果显示(表1)，海南现
表2海南儋州普通野生稻株型调查表
Table2 Investigationofplants yleofcommonwildricefromDanzhou
注；**表示差异达到显著
存的普通野生稻资源在极速减少，部分居群已经或
即将消失，最明显的表现在三亚、乐东、文昌型，其中
在三亚已很难找到原生境的野生稻；乐东黄流镇新
荣村的生存条件也非常恶劣，估计这一两年内也将
消失；文昌三江洋湿地的，当我们一个月后再去时发
现已经消失，幸好在文昌东路已建立普通野生稻原
生境保护点。
2．2扩增产物的多态性分析
从RAPD扩增图谱(图1)的结果来看，筛选出
来的13个随机引物(表3)总共扩增到155条带，其
中多态性条带120条，多态性条带百分率(PPB)为
77．42％。不同引物扩增出的清晰带数在7～18条
之间，平均每个引物扩增出的条带数为11．92条，扩
增出多态性带数的范围为5～16，其中引物6扩增
出的多态性片段百分率(PPB)最大，为91．67％，引
物1最小，为60％。
2．3数据与聚类分析
对扩增结果整理得到的数据矩阵用NTSY孓
PC2．1软件进行分析，按Nei氏(1987)的公式，计算
遗传相似性系数(GS=2Nd／(N；+N，)，其中N#为
两者均有的带数，M、Ni分别表示各自扩增的带
数)，得到RAPD扩增结果的相似性系数矩阵，根据
对遗传相似性的计算结果，获得各供试材料的遗传
距离。用算术平均非加权配组法(unweightedpair—
groupmeanaverageUPGMA)进行聚类分析。从
得到的数据和聚类树状图可以看出(表4、图2)，文
昌三江洋湿地和三江洋栽培稻示范区水沟内的遗传
距离最小，为0．135，说明这两个类型之间遗传变异
万方数据
744 广西植物 28卷
图1 A、B、c分别为RAPD引物l3、4、5对10个供试样品扩增的结果，其中M为2000标准分子量。M’为100梯度标准分子量11．X1，2．
X5，3．X2，4．X4，5．X3．6．X6，7．X7。8．X8，9．X9，10．X10。
Fig．1Electrophoretieanalysisofamplificationproductsobtainedfroml0sampleswiththeRAPDprimers4，9，11tOfigA，B，C．Lanesare
asfollowslM．DL2000DNAMarker，M
7
IDLl00gradientDNAmarker．
表3供试引物的碱基序列及扩增结果
Table3 Thesequencelistofprimersand
numberofassociatedmonomorphicandpolymorphic
bandsobservedamonggenotypes
程度最小，乐东与长雄野稻(o．10ngistaminata)型
遗传距离最大，为0．555，说明它们之间遗传变异相
对较大。所有材料可以明显地划分为2个大组，5
个小组，第1个大组集中了海南本地种的7个类型
(琼海型、儋州型；万宁型、乐东型；文昌三江洋湿地
型、文昌三江洋示范区型；文昌东路路口型)和三亚
WZI型。第2大组是三亚WZ2型和长雄野稻型。
从这2个大组的划分来看，可明显地将匍匐型与直
立型划分开来。5个小组的划分可以将海南普通野
生稻按照遗传多样性进行区域性划分，这比按照地
方命名的居群划分更科学了一些。对海南这些普通
野生稻进行遗传差异地划分将为以后对不同居群间
亲缘关系的进化研究取样提供了依据。
3 讨论
3．1加强海南普通野生稻的保护
虽然到目前为止，已在海南文昌、琼海、儋州(万
宁正在筹建)建立了原生境自然保护区，但其生存状
况仍不太乐观，由于保护区的范围有限，很难保证野
生稻资源不至于流失。乐东、三亚的即将消失，其它
表4各居群遗传距离I上)相似系数(下)
Table4 MatrixofpairwiseNei’Sgeneticidentity(diagonalbel w nd
distanceabove)basedondataof10commonwildrice
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10
X1 ***0．280．392 0．379 0．344 0．491 0．474 0．367 0．433 0．506
X2 0．716 ***0．4110．299 0．28 0．356 0．388 0．368 0．319 0．553
X3 0．632 0．632 ***0．30．298 0．393 0．358 0．271 0．475 0．523
X4 0．626 0．703 0．71 ***0．2280．362 0．328 0．291 0．456 0．555
X5 0．665 0．729 0．723 0．768 ***0．3440．278 0．289 0．405 0．461
X6 0．542 0．658 0．639 0．645 0．671 ***0．1350．285 0．336 0．509
X7 0．568 0．645 0．677 0．684 0．735 0．858 **g-0．2670．416 0．436
X8 0．658 0．671 0．755 0．723 0．735 0．729 0．755 ***0．3960．519
X9 0．581 0．684 0．574 0．568 0．619 0．665 0．613 0．639 ***0．358
X10 0．555 0．542 0．574 0．529 0．606 0．561 0．626 0．587 0．665 **o
万方数据
6期 王晓玲等：海南主要普通野生稻的调查及利用RAPD技术进行鉴别分析 745
地区的，估计不久也只有小小的保护区内才有野生
稻的痕迹。为了更好地保护好普通野生稻资源，呼
吁当地政府号召群众增强保护意识，鼓励保护行为，
促进人与野生资源的和谐发展。
0．60 0．86 0．73 0．79 0
COnfficient
琼海中原
儋州和庆
文昌东路
三亚WZl
万宁东澳
乐东黄流
文昌三江洋湿地
文昌三江洋示范
三亚WZ2
长雄野稻
85
图2 10个供试材料RAPD的UPGMA聚类图
Fig．2DendogrameneratedbyUPGMAcluster
analysisofRAPDpolymorphismshowinggenetic
divergenceamong10commonwildricesinHainan
3．2遗传分析的探讨
从RAPD分析得到的数据与聚类结果来看，将
海南主要普通野生稻资源分为5个小组，进行这5
个小组的划分为以后对其亲缘关系与进化研究时取
样无疑起到了指导性的作用，这也是对陈良兵等
(2005)的研究作了进一步的完善。文昌三江洋湿地
型与文昌三江洋示范区水沟型由于地理位置的靠
近，其相似系数最大，为0．858。三亚WZl、三亚
WZ2均保存于中国热带农业科学院农业生物安全
检测中心基地，其来历现已不明，其中三亚WZl聚
类在第1大组类，一个最简单的原因可能是它们均
属于匍匐型，但其进一步聚类的范围是与文昌东路
保护区型聚在一起，且之间的距离比第1小组(琼海
与儋州)之间的距离还小，因此，估计它有可能是海
南本地种。从形态上来看，三亚WZ2与长雄野稻均
属于直立型，与海南其它普通野生稻有较大区别。
另外从原生境收集的野生稻资源异位保存后发现：
普通野生稻的叶形、地上茎节、株高、分蘖力、穗粒数
等均有显著性改变，说明野生稻生长的生态环境对
它们的部分性状和遗传结构有一定的影响，与晏慧
君(2006)，Ravil等(2003)的结论是一致的，这也是
提出要进行野生资源原生境保护策略的原因之一。
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(下转第749页Continueonpage749)
万方数据
6期 吴钿等：菠萝蜜叶和花的解剖结构研究 749
进行并进而形成果实的关键因素。菠萝蜜的雌、雄花
均小而不鲜艳，花粉粒小而量多，且质地轻，是典型的
风媒传粉植物，因而干燥的气候条件有利于花粉粒的
传送。在育种工作中，适当选育花期较早或较迟的类
型，避开在3～4月的梅雨季节开花传粉，使更多的雌
花能获得受精机会，有利于菠萝蜜单果产量的提高；
在梅雨季节开花的类型，生产上则应辅以人工授粉。
4 结论
菠萝蜜的叶是典型的异面叶，解剖结构显示有较
强的耐早和抗虫能力；花为典型的风媒花，异花传粉，
三孔花粉粒。
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海南主要普通野生稻的调查及利用RAPD技术进行鉴别分析
作者： 王晓玲， 郭安平， 孔华， 刘恩平， 贺立卡， WANG Xiao-Ling， GUO An-Ping， KONG
Hua， LIU En-Ping， HE Li-Ka
作者单位： 王晓玲,WANG Xiao-Ling(中国热带农业科学院,热带生物技术研究所,海口,571101;江西省农
业科学院,水稻研究所,南昌,330200)， 郭安平,孔华,刘恩平,贺立卡,GUO An-Ping,KONG
Hua,LIU En-Ping,HE Li-Ka(中国热带农业科学院,热带生物技术研究所,海口,571101)
刊名： 广西植物
英文刊名： GUIHAIA
年，卷(期)： 2008,28(6)
被引用次数： 3次

参考文献(21条)
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引用本文格式：王晓玲.郭安平.孔华.刘恩平.贺立卡.WANG Xiao-Ling.GUO An-Ping.KONG Hua.LIU En-Ping.HE
Li-Ka 海南主要普通野生稻的调查及利用RAPD技术进行鉴别分析[期刊论文]-广西植物 2008(6)