全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ ３２（３）：３６２－３６６ ２０１２年５月
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１２．０５．０１６
桑树肌动蛋白ａｃｔｉｎ基因全长序列的克隆与分析
孔卫青，杨金宏
（安康学院 陕西省蚕桑重点实验室，陕西 安康７２５０００）
摘 要：肌动蛋白在植物的各种生理活动中起着重要作用，是研究基因表达与调控模式的内标参考。通过染
色体步移方法获得了桑树肌动蛋白ａｃｔｉｎ基因１ ６１２ｂｐ的序列，该基因ＣＤＳ长１ ３１２ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：
ＨＭ６２３８６６），编码３７７个氨基酸残基，与水稻、葡萄等的同源基因的序列一致性在９０％以上。基因内含子的
数目及其在基因组上的位置也与水稻、葡萄等的相似。对来自不同物种的２４个肌动蛋白基因进行聚类分析
的结果显示，基因被分为ＣｌａｓｓⅠ和ＣｌａｓｓⅡ两个明显的亚群。
关键词：桑树；肌动蛋白；染色体步移；克隆；序列分析
中图分类号：Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３１４２（２０１２）０３－０３６２－０５
＊ Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｕｌ ｌｅｎｇｔｈ
ｏｆ ｍｕｌｂｅｒｒｙ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ）ａｃｔｉｎｇｅｎｅ
ＫＯＮＧ Ｗｅｉ－Ｑｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｊｉｎ－Ｈｏｎｇ
（Ｋｅｙ Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ，Ａｎｋａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｎｋａｎｇ ７２５０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｃｔｉｎｓ ｐｌａｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ
ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ ｆｕｌ ｌｅｎｇｔｈ １ ６１２ｂｐ ｏｆ ａｃｔｉｎｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ．Ｉｔｓ
ＣＤＳ ｗａｓ １ ３１２ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ３７７ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｈｏｗｅｄ
ａｂｏｖｅ ９０％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｃｔｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｇｒａｐｅ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｓｉｔｅ ｏｆ ｉｎｔｒｏｎｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｗｉｔｈ
ｒｉｃｅ ａｎｄ ｇｒａｐｅ，ｔｏｏ．Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｔｉｎｓ ｆｒｏｍ ２４ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｓｕｂ－
ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ＣｌａｓｓⅡ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ；ａｃｔｉｎ；ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
植物肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）广泛存在于植物界，是一
种高度保守的蛋白质。由肌动蛋白单体聚合形成的
微丝，参与了真核细胞骨架网状蛋白体系的形成，并
赋予细胞强度以及对各细胞器及某些大分子的空间
组织安排（Ｃｏｌｉｎｇｓ等，２００２；Ｖｉｄａｌｉ等，２００２）。研
究发现，肌动蛋白在高等植物的花粉、茎韧皮部、叶
表皮细胞、叶鞘细胞、根毛、卷须、内果皮和茎形成层
等组织中均有表达（李园莉等，２００２），肌动蛋白骨架
体系可能与许多病毒的侵染、运输、复制以及子代病
毒粒子的装配等过程有关（Ｐｈｉｌｉｐ等，２００９）。阎隆
飞等（１９６３）首次提出高等植物中存在肌动蛋白的表
达。目前已有多个植物如水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、拟
南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒ－
ｓｕｔｕｍ）、烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）等的ａｃｔｉｎ基因
被克隆和测序分析（ＭｃＥｌｒｏｙ等，１９９０；ＭｃＤｏｗｅｌ
等，１９９６；Ｌｉ等，２００５；Ｔｈａｎｇａｖｅｌｕ等，１９９３）。这些
基因高度相似，可能由共同的祖先不断复制和分化
遗传下来，且基因的表达也比较稳定，常被用作植物
基因表达调控研究的目的基因在 ｍＲＮＡ水平表达
的内标基因（Ｔｈｅｌｉｎ等，１９９９）。
＊ 收稿日期：２０１１－１０－３１ 修回日期：２０１２－０１－０９
基金项目：陕西省教育厅科技计划项目（０９ＪＳ０１１，２０１０ＪＫ３９１）［Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｎｎｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ
ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（０９ＪＳ０１１，２０１０ＪＫ３９１）］
作者简介：孔卫青（１９８０－），女，山东成武县人，博士，副教授，主要从事生物技术研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｗｅｉｑｉｎｇ＿ｋｏｎｇｗｑ＠１２６．ｃｏｍ。
桑树（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ）不仅是蚕桑生产的主要物质
基础，还是一种重要的降血糖药用植物资源（徐建飞
等，２０１０）。近年来，已从分子生物学的基础上对桑
树进行研究。肌动蛋白作为一个重要的基因，Ｇａｎｇ
等（２００８）报道了第一条桑树肌动蛋白序列的片段
（登录号：ＤＱ７８５８０８．１），本文在该序列片段的基础
上，采用热不对称性ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎ－
ｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲ）方法获得桑树肌动蛋白
ａｃｔｉｎ基因的全长序列，并分析了基因的结构，为研
究桑树基因表达与调控模式提供内标参考。
１ 材料与方法
１．１材料与主要试剂
选取桑树“沙２×伦１０９”十天生叶片。基因组
提取试剂盒、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ Ｋｉｔ、ＥＸ ｔａｑ酶、胶回
收试剂盒、ｐＭＤ１９－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ购自大连宝生物
工程有限公司。大肠杆菌ＤＨ５α购自上海生物工程
公司，质粒提取试剂盒购自北京天根。
１．２方法
１．２．１桑树基因组 ＤＮＡ 的提取与内含子序列的
ＰＣＲ扩增 以基因组提取试剂盒提取的“沙２×伦
１０９”桑树十天生叶片基因组为模板，以 Ｐｒｉｍｅｒ
ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件根据已有ａｃｔｉｎ基因的序列设计的
引物ＡｃＦ和５ｓｐ１（表１），进行ＰＣＲ扩增桑树ａｃｔｉｎ
基因位于该区域的第一、二内含子。扩增产物经
１．０％琼脂糖凝胶电泳分析和胶回收纯化，连接至
ｐＭＤ１９－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ载体，并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受
态细胞，阳性重组质粒送ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序。
１．２．２基因组步移法获取桑树ａｃｔｉｎ基因３′端和５′
端序列 根据基因组步移试剂盒使用说明和本研究
已获得的桑树ａｃｔｉｎ基因的 ＤＮＡ 序列，设计引物
（表１）扩增基因的编码序列以及５′端序列和３′端序
列。具体步骤为：以桑树基因组ＤＮＡ为模板，ＡＰ１
表１ 本研究使用的引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物Ｐｒｉｍｅｒｓ 核酸序列（５′－３′）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′ｔｏ ３′） 引物Ｐｒｉｍｅｒｓ 核酸序列（５′－３′）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′ｔｏ ３′）
ＡｃＦ ＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧ ３ｓｐ１ ＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＧＴＴＣＣＴＣＧＧＴＴＧＡ
５ｓｐ１ ＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＧＧＴＡＴＣＴＣＴ ３ｓｐ２ ＧＡＧＡＴＡＣＣＧＡＴＧＣＣＣＡＣＡＡＧＴＣＣＴ
５ｓｐ２ ＡＣＧＡＣＣＡＣＴＧＧＣＧＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ ３ｓｐ３ ＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＡＣＴＡＴＧ
５ｓｐ３ ＣＡＴＣＣＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣ ＡｃｔｉｎＦ ＧＣＧＡＴＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＣＴＣ
５ｓｐ４ ＣＧＡＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧ ＡｃｔｉｎＲ ＡＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＧＡＡＡＴＣＣＡＣＡ
和５ｓｐ２进行第一次热不对称ＰＣＲ反应，ＰＣＲ程序：
９４℃１ｍ；９８℃１ｍ；９４℃３０ｓ，６０℃１ｍ，７２℃２
ｍ，５ｃｙｃｌｅｓ；９４℃３０ｓ，２５℃３ｍ，７２℃２ｍ后，进行
１５个循环的９４℃３０ｓ，６０℃１ｍ，７２℃２ｍ，２ｃｙｃｌｅｓ
和９４℃３０ｓ，４４℃１ｍ，７２℃２ｍ反应，最后７２℃
１０ｍ。后ＡＰ１、５ｓｐ３引物与ＡＰ１、５ｓｐ４引物分别进行
第二次和第三次ＰＣＲ反应，模板分别使用为稀释１００
倍后的第一次ＰＣＲ反应液和第二次ＰＣＲ反应液１
μＬ，两次ＰＣＲ反应程序与第一次ＰＣＲ反应的后１５
个循环及其后的延伸程序相同。
同样分别以３ｓｐ１、３ｓｐ２和３ｓｐ３与ＡＰ１组合进
行３次ＰＣＲ反应，扩增基因的３′端序列，３次ＰＣＲ
反应程序同前。分别切胶回收第三次ＰＣＲ产物，与
ｐＭＤ１９－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ载体连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α感
受态细胞，阳性重组质粒送ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司使用
Ｍ１３ｐｒｉｍｅｒｓ进行测序。
１．２．３桑树ａｃｔｉｎ基因全长序列的获取与序列分析
根据获得的３′和５′端序列与已知核心序列推测
的编码框设计引物 ＡｃｔｉｎＦ和 ＡｃｔｉｎＲ，并以桑树基
因组的ＤＮＡ和ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增基因序
列。Ｓｉｍ４程序分析基因结构，Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ１．８３软件进
行基因的多序列比对并对基因进化特征进行分析。
２ 结果与分析
２．１桑树ａｃｔｉｎ基因序列的获得
琼脂糖凝胶电泳 ＡｃＦ和５ｓｐ１引物的ＰＣＲ扩
增产物，结果在１ ０００ｂｐ处出现一扩增条带，回收
纯化后进行克隆、测序（图１）。测序结果与原序列
进行比对，获得了ａｃｔｉｎ基因的第一、二内含子。根
据染色体步移试剂盒使用说明进行 ＴＡＩＬ－ＰＣＲ反
应扩增基因的５′端序列，扩增产物的１．０％琼脂糖
凝胶电泳在约３６０ｂｐ处有一扩增条带（图２），回收
该条带并进行克隆测序和序列拼接，获得基因的５′
端序列。同样分别以３ｓｐ１、３ｓｐ２和３ｓｐ３与ＡＰ１组
合进行ＰＣＲ反应，获得了基因的第三个内含子和３′
３６３３期 孔卫青等：桑树肌动蛋白ａｃｔｉｎ基因全长序列的克隆与分析
末端序列。
所有序列进行拼接，并根据拼接序列设计引
物ＡｃｔｉｎＦ和 ＡｃｉｔｎＲ，分别以桑树基因组 ＤＮＡ和
桑树ＲＮＡ反转录的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增
基因的ＤＮＡ和ｃＤＮＡ序列，结果分别在约１ ４００
ｂｐ和１ １００ｂｐ处获得单一条带（图３），测序该条带
验证其确实为所得序列。
图１ 桑树ａｃｔｉｎ基因第一、二内含子的
ＰＣＲ扩增 （箭头所指为扩增条带）
Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １ｓｔ ａｎｄ ２ｎｄｉｎｔｒｏｎ ｏｆ ｍｕｌ－
ｂｅｒｒｙ ａｃｔｉｎｇｅｎｅ（Ｔｈｅ ｂａｎｄ ｉｓ ｐｏｉｎｔｅｄ ｂｙ ａｒｒｏｗ）
图２ ａｃｔｉｎ基因５′末端的染色体步移扩增
Ｆｉｇ．２ ＴＡＩＬ－ＰＣＲ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄ ｏｆ ａｃｔｉｎｇｅｎｅ ５′
Ｍ．ＤＬ２０００分子标记；１，２，３分别为第三次、第二次和第一次扩增。
Ｍ．ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１，２，３ ａｒｅ ｔｈｅ ３ｒｄ，２ｎｄ，
ａｎｄ １ｓｔ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．２桑树ａｃｔｉｎ基因序列分析
桑树ａｃｔｉｎ基因ｃｄｓ长１ ３１２ｂｐ（图４，ＧｅｎＢａｎｋ
登录号：ＨＭ６２３８６６），编码３７７个氨基酸，预测蛋白
分子质量为４１．６ｋＤａ，氨基酸序列中含有肌动蛋白
家族保守的 ＡＴＰ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ和 Ｐｒｏｆｉｌｉｎ结合位点。
ｓｉｍ４程序分析该基因有４个外显子，外显子／内含
子边界符合ＧＴ－ＡＧ规则。内含子分别位于距起始
密码子６０、４５４和１ ０６８ｂｐ处，大小分别为１１９、８１
和９２ｂｐ（图４），与其它物种水稻、葡萄（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆ－
图３ 桑树ａｃｔｉｎ基因的ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．３ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ａｃｔｉｎ
１．ＤＮＡ模板；２．ｃＤＮＡ模板；Ｍ．ＤＬ２０００分子标记。
１．ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ；２．ｃＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ；Ｍ．ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ
ｅｒａ）、毛白杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）等所含内含子
的数目、位置较为相似（图５），但序列差异较大。而
基因的核苷酸、氨基酸序列与同源基因的多序列比
对结果表明：外显子部分核苷酸和氨基酸序列均有
较高的相似性，尤其氨基酸序列一致性在９０％
以上。
以酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）肌动蛋白基
因为外群，对来自葡萄、毛白杨、玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、棉
花和拟南芥等共２４个肌动蛋白基因进行聚类分析
（图６），结果所有肌动蛋白被分为两个亚群ＣｌａｓｓⅠ
和ＣｌａｓｓⅡ，这与Ｚｈａｎｇ等（２０１０）所构建的结果相
似，说明肌动蛋白基因的分化可能发生在物种分化
之前，本研究获得的桑树ａｃｔｉｎ基因归入ＣｌａｓｓⅠ，
与毛白杨的ｐｔａｃｔ９（ＸＰ＿００２３１６２８９）同源性最近，这
也与其形态学分类一致。
３ 结论与讨论
肌动蛋白是生物体内重要的结构蛋白，广泛存
在于高等植物的各种组织细胞中，参与许多重要的
生命活动。高等植物的肌动蛋白由３７５～３７７个氨
基酸组成，具有高度的保守性和同源性，这与肌动蛋
白作为细胞骨架的保守功能是一致的（Ｌｉａｎｇ等，
２００４）。与该结果一致，本研究克隆的桑树肌动蛋白
也由３７７个氨基酸组成，序列中含有肌动蛋白家族
保守的 ＡＴＰ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ和 Ｐｒｏｆｉｌｉｎ结合位点，与水
稻、葡萄、毛白杨等的同源序列的一致性在９０％
以上。
在基因结构上，本研究克隆的桑树ａｃｉｔｎ基因
由４个外显子和３个内含子组成，内含子的两端序
４６３ 广 西 植 物 ３２卷
图４ 桑树肌动蛋白基因及推导的氨基酸序列
Ｆｉｇ．４ Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ａｃｔｉｎ
斜体部分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ核苷酸）为序列内含子；加粗部分为引物序列。
Ｉｔａｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｆⅠ，Ⅱ，ａｎｄⅢｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｎｓ；ｂｏｌｄ－ｆａｃｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．
图５ 桑树与水稻、葡萄、毛白杨肌动蛋白基因所含内含子的数目、位置结构图
Ｆｉｇ．５ Ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｍａｐ ｏｆ ａｃｔｉｎｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｍｕｌｂｅｒｒｙ，ｒｉｃｅ，ｇｒａｐｅ，ａｎｄ ｐｏｐｌａｒ
列符合典型的ＧＴ－ＡＧ法则，属于真核生物拼接位
点很保守的第二类内含子。与水稻等的同源基因的
内含子数量及其在基因的位置也极其相似，尤其第
一个内含子通常都位于第２０个密码子处，由此可
见，肌动蛋白是生物进化中的一类高度保守的基因。
ＴＡＩＬ－ＰＣＲ是在ＰＣＲ技术的基础上发展起来
的染色体步移技术，用于扩增已知序列旁侧的未知
ＤＮＡ片段。其原理是通过高退火温度的长特异引
物和短的低退火温度简并引物的热不对称（高严谨
性ＰＣＲ和低严谨性ＰＣＲ交替）循环程序，有效扩增
特异产物，具有简单快速、特异性高等特点，近年来，
成为分子生物学研究中非常实用的基因侧翼序列克
隆技术（Ｑｉｎ等，２００３；Ａｎｔａｌ等，２００４）。但是该技术
所获得的侧翼序列的长度存在很大的随机性，本研
究利用该技术分别获取了桑树ａｃｔｉｎ基因５′端和３′
端均约３６０ｂｐ左右的序列。本研究在已获得序列
５６３３期 孔卫青等：桑树肌动蛋白ａｃｔｉｎ基因全长序列的克隆与分析
图６ 不同物种肌动蛋白基因聚类分析
Ｆｉｇ．６ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｔｉｎｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
的基础上再次使用该技术以期进一步获得基因的启
动子序列，未获得成功，说明在一个位置可能不能重
复使用该技术进行进一步延伸。
参考文献：
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Ｔｈａｎｇａｖｅｌｕ Ｍ，Ｂｅｌｏｓｔｏｔｓｋｙ Ｄ，Ｂｅｖａｎ ＭＷ，ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｐａｒｔｉａｌ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ：ｅｖｉ－
ｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐｏｌｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ
ｍｅｍｂｅｒｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２４０：２９０－２９５
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６６３ 广 西 植 物 ３２卷