全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(3)：386— 389 2009年 5月
乳突果苗的组织培养及脂氧合酶的诱导
马长乐1，李 靖 ，赵沛基2
(1．西南林学院，昆明 650224；2．中国科学院 昆明植物研究所，昆明 650204)
摘 要：脂氧合酶(LOx)是植物十八碳酸途径中一个很重要的酶，该酶作用的产物在植物生长发育过程以及
在植物对环境胁迫反应中起着重要作用。首次建立了萝摩科植物乳突果苗的培养体系，并用仿真菌环境(几
丁质)对乳突果组培苗进行刺激诱导，通过 LC-ESI—MS检测脂氧合酶反应的产物 。粗酶活性鉴定结果显示，
经 150 mg／L几丁质诱导 9 h的乳突果组培苗产生了 9-LOX，该酶可催化亚油酸生成 9，10，11-三羟基一12一十八
碳烯酸。推测在乳突果组培苗中，几丁质诱导的十八碳酸代谢途径沿着 9-LOX方向进行。
关键词：乳突果；脂氧合酶；十八碳酸途径 ；几丁质
中图分类号 ：Q946 文献标识码 ：A 文章编号：i000—3142(2009)03—0386—04
Tissue culture 0f Adelostemma gracillimum
seedlings and the inducement 0f lipoxygenase
MA Chang-Le1，LI Jing ，ZHAO Pei-Ji2
(1．Southwest Forestry Colege，Kunming 650224，China；2．Kunming Institute of
Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650204，China)
Abstract：Lipoxygenases are important enzymes in plant octadecanoic acid pathway．Products of this enzyme have im—
portant functions in plant growth and development，as well as in response to environmental stress．Culture system of
Adelostemma gracillimum was the first time to be constructed in Asclepiadaceae．Chitosan was used in the induce—
ment experiment on A．gracillimum seedlings and the products of LOX were detected through LC-ESI-MS．The re—
suits showed that A．gracillimum seedlings induced by 150 mg／L chitosan for 9 h produced 9-LOX and the enzyme
can catalyze linoleic acid to 9，10，1卜trihydroxy-12一octadecenoic acid．It was speculated that octadecanoic acid path—
way induced by chitosan differentiated tO 9-LOX orientation．
Key words：Adelostemma gracillimum ；lipoxygenase；octadecanoic acid pathway；chitosan
脂氧合酶(LOX，EC 1．13．11．12)是含 有非血
红素离子的双加氧酶，广泛分布于动植物。它是植
物十八碳酸代谢途径的关键酶，该途径也称 LOX
途径。该酶作用的产物在植物的生长发育过程中以
及在植物对环境胁迫 反应 中起着重要 的作用
(Grechkin，1998)。在植 物 中，亚 油酸和 亚麻酸是
LOX最常见的底物，根据其对亚油酸加氧的位置特
异性，将植物脂氧合酶分为两类：在亚油酸 C一9位加
氧的被称为 9一LOX，而氧原子加在 C-13位的称为
13一LOX(Brash，1999)。
LOX途径的产物有多样 的生物学功能 ：在种子
中，L0x起防御作用，并促进种子的萌发(Santino
等，2005；Terp等，2006)；在发芽阶段它动员脂肪
(Kolomets等，2000)；在生长阶段它促进块茎和结
节的生长、果实的成熟(Sharma等，2006)；受伤时它
起信号和防御作用(Lee等，2004)；病原菌攻击时它
起抗微生物作用及促进敏感细胞死亡等(Kolomets
等，2000)。
收稿日期：2008一O1—08 修回日期：2008一II一25
基金项目：云南省教育厅科学研究基金(08C0086)[Supported by Scientific Research Foundation of Education Department of Yunnan(08C0086)]
作者简介：马长乐(1976一)．男，新疆呼图壁县人 ，博士，副教授，主要从事植物分子生物学与生物地理学研究，(E-mail)machangle@sina．corn。
通讯作者(Author for correspondence，E—mail：plentyr@mail．kib．ac．cn)
3期 马长乐等：乳突果苗的组织培养及脂氧合酶的诱导 387
乳突果(Adelostemma gracillimum)为萝蘼科
鹅绒藤属植物，是一种重要的药用植物，主要分布于
我国西南部，民间用其根作滋补强壮药，治疗4,JD惊
风症和风湿关节痛。先前 ，我们从乳突果愈伤组织
中分离了两个三羟基 十八碳烯酸 ，经 MS和 NMR
光谱数据分别鉴定为 9，12，13一三羟基一1O一十八碳烯
酸和9，10，11一三羟基一12一十八碳烯酸。它们具有相
同的分子式和分子量(m／z 330)，但是在 LC—ESI—
MS实验中准分子离子峰 m／z 353[M+Na3 的保
留时间分别为 7 min和 10 rain，从结构推断它们均
为9一LOX作用于亚油酸的产物(赵沛基等，2003)。
该类化合物具有抗真菌活性 ，提示十八碳酸代谢途
径和具有化学防御功能的次生代谢途径在该植物中
可能存在关联，我们选择了乳突果作为实验材料进
行脂氧合酶的初步研究。
1 实验材料
乳突果种子采 自云南中甸。它一般生长在山脚
下栅栏边，海拔约 3 000 m的地方。其果实在 1O月
左右成熟。采集乳突果果实4个，收集种子，4℃存
放，用于种子萌发。
2 实验方法
2．1乳突果种子萌发及其苗的组织培养
将乳突果种子用 75 的乙醇浸泡 30 S，再用
0．12 的HgCIz浸泡 10 rain，然后用无菌水洗涤 3
次，用于接种。置培养箱中2个星期左右，待苗长至
4～5 cm，切取l cm长的茎段，接种在另外的培养基
上进行继代培养。
种子萌发的基本培养基为添加 GA 5．0 mg／L
的MS培养基，组培苗和悬浮培养的基本培养基为
添加 BA 2．0 mg／L+NAA 0．1 mg／L的 MS培养
基，培养基的 pH值均为 5．8。培养条件为每天光
照 12 h，温度为(25±2)℃。
GA 配制方法：将 GA 倒人烧杯中，加少量酒
精充分搅拌使其溶解，再加水配成母液备用，在培养
基灭菌后过滤加入(黄涛等，2003)。
2．2苗的悬浮培养及几丁质诱导
选择生长较好的培养两周左右的无菌苗，剪成
1 cm长的茎段，接种到悬浮培养液中，进行摇床培
养。每 100 mL三角瓶分装 20 mL的培养液，每三
角瓶的接种量约为 0．2 g(鲜重)，摇床转速 120
rpm，(25±2)℃下于黑暗中培养。接种两周后的悬
浮培养物用于几丁质诱导实验。
将几丁质(购 自 Aldrich公司)配成 10 mg／mL
的母液(用 HAc和 NaOH调 pH至 5．8)。加入 300
L母液至培养液中，至终浓度为 150 mg／L。摇床
转速 120 rpm，(25±2)℃下于黑暗中培养。
2．3脂氧合酶活性测定
取 5 g经 150 mg／L几丁质诱导 9 h的乳突果
组培苗，液氮条件下研磨成粉末，向其加入 10 mL 4
℃预冷的 100 mmol／L磷酸钾缓冲液(pH6．O)，4℃
搅拌提取 30 min。10 000 g冷冻离心 10 rain，收集
上清液，加入反应底物亚油酸至终浓度为 120
~mol／L，室温放置 30 min。反应产物用 3倍体积的
氯仿／甲醇混合物(2：l，v／v)提取 3次，提取液合并
后，12 000 g冷冻离心 10 rain，收集有机相，用压缩
氮气吹干，溶解于 i mL色谱纯甲醇中，用作 LC-
ESI—MS检测。样品经过反相 HPLC系统 (HPLC
Waters 2695，C18反相柱 3．5 m，3．0×50 ram)，流
动相 A为甲醇、B为含 1 甲酸的蒸馏水梯度洗脱，
进样量为 10 L，流速为 0．2 mL／min。用 Thermo
Finnigan LCQ Advantage质谱仪进行 ESI—MS(离
子阱)分析，质谱仪参数设置分别 为：Capilary
Temp(270℃)，Sheath Gas Flow(15 psi)，Source
Current(8O A)，Capillary vchage(20V)。流动相
前 20 min为甲醇 ：水(63：37)，25~30 rain为甲醇。
质谱检测的准分子离子峰为 m／z 353[M+Na3+
(G6bel等，2002；黄建昌等，2005)。
3 实验结果
3．1种子萌发和苗的继代培养
MS培养基中添加 5．0 mg／L的GA 有利于种
子的萌发，图 1为接种两周后的无菌苗，萌发率高达
100 。转接至含有 BA的 MS培养基上进行继代
培养两周，出芽率较高，诱导出的新芽粗壮，生长速
度也比较快(图 2)，可见 BA对芽的发生产生了促
进作用。
3．2脂氧合酶粗酶活性的测定
用几丁质诱导后的组培苗进行酶活性的测定，
实验结果如表 1所示。对照反应中没有检测到三羟
基十八碳烯酸产物(实验组 E，B，E+B，E+ET，B+
S1)；将底物溶解于无水乙醇中，进行酶反应(实验
388 广 西 植 物 29卷
图 1 乳突果种子的萌发
Fig．1 Seed germination of Adelostemma gracillimum
图 2 乳突果组培苗
Fig．2 Seedlings of Adelostemma gracillimum
组E+S1)，检测到了三羟基十八碳烯酸的存在。该
实验重复 2次 ，得到一致的实验结果。
从 LC-ESI—MS检测图谱上我们可以看到，该物
质的准分子离子峰为 m 353，保 留时间为 9～10
min(图 3)，可推断该化合物为 9，10，1l_三羟基一12一
十八碳烯酸，是 9一LOX作用于亚油酸的产物。以上
实验结果说明：经 150 mg／L几丁质诱导 9h的乳突
果组培苗产生了9-LOX，并且在粗酶提液中存在着
有活性的酶蛋白。
表 1 酶活性测定数据
Table 1 Data of enzyme reaction
实验组 Experiment series m／z 353
酶粗提液 E 一
缓冲液 B 一
酶粗提液 E+缓冲液 B 一
酶粗提液 E+无水乙醇 ET
缓冲液 B+S1溶解于无水乙醇的底物 一
酶粗提液 E+溶解于无水乙醇的底物 S1 1．15E5
4 讨论
近年来 ，国际上关于从植物中研究脂氧合酶已
经很多。许多植物的 LOX基 因序列 已经知道 ，这
入 !眵 ：
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图 3 粗酶活性 LC—ESI-MS检测图
Fig．3 LC-ESI—MS detection of rude enzymes
3期 马长乐等：乳突果苗的组织培养及脂氧合酶的诱导 389
为研究它们之间的系统进化关系，阐明基因序列、结
构以及位置特异性和活性之间的关系提供了可能。
在过去的几十年 中，有关 LOX途径 的生化研究也
取得了很大进 展(Grechkin，1998)。13一LOX途径
的次生代谢产物通过信号分子作用或直接起化学防
御的作用 ，如在受伤反应中茉莉酮酸酯和 OPDA作
为信号分子起作用(Creelman Mullet，1997)；有
的产物对次生代谢起调节作用(李靖等，2004)，此途
径的研究报道也很多，尤其是 JA途径，已经研究的
比较清楚 。而有关 9-LOX途径的研究报道较少。
本文首次建立了乳突果苗的培养体系，并用仿
真菌环境(几丁质)对乳突果组培苗进行刺激诱导，
并作初步的酶活鉴定，检测到了反应产物一9，1o，
l卜三羟基一12一十八碳烯酸的存在，根据结构可知它
为 9 LOX作用于亚油酸的产物。可见在乳突果组
培苗中，几丁质诱导的十八碳酸代谢途径可能沿着
9 LOX方向进行。本实验结果为探索“诱导一9一
L0X途径一化学防御”之间的关系及脂氧合酶基因
的分离奠定基础。至于该酶作用的产物是如何作进
一 步转化 ，以及该途径的产物是如何起到化学防御
作用的，还需要进一步的实验来证明。
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