全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(4)：551— 554 2007年 7月
草豆蔻 cDNA文库的构建及鉴定
宋娟娟1，马 伟 ，唐源江 ，陈忠毅1，廖景平1
(1．中国科学院 华南植物园．广州 510650；2．上海交通大学 生命科学学院，上海 200030)
摘 要：以草豆蔻花序原基为材料，构建了 cDNA文库。原始文库滴度为 0．8×10 pfu／mL，扩增后滴度为
4．23×1011 pfu／mL。插入片段大小在 500 bp～1．5 kb之间，重组率为 95．3 。以水稻 RAP1A基因中包含
MADS-box保守区段的序列为探针对该文库进行筛选，获得的阳性克隆经测序及序列比对分析，确认其中共
有 1O个含 MADS-box的阳性克隆。
关键词：草豆蔻；cDNA文库；MADS-box基因；花序原基
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2007)04—055I-04
Construction and identification of cDNA library
of Alpinia hainanensis(Zingiberaceae)
SONG Juan-Juan，MA We．2，TANG Yuan-Jiang1，
CHEN Zhong—Yi1．LIAO Jing-Ping1
(1．South China Institute of Botany，ChimseAcademy of Sciences，Guangzhou 510650，
Chi~ ；2．Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200030，China)
Abstract：An inflorescences primordium cDNA library of Alpinia hainanensis K．Schumann was constructed．The ti—
ter of the cDNA primary library is 0．8×106 pfu／mL，while that of the amplified library is 4．23×10 pfu／mL．The
recombinant rate is about 95．3 ，and the length of cDNA is between 500 bp～ 1．5 kb．The fragment containing the
MADS-box conserved sequence of RAP1A gene of Oryza satiwa is used as probe tO screen the library．Positive clones
are sequenced and the sequences are analyzed first blast within the NCBI database，then alignment with the known
MAD-box gene．Ten MADS-box genes from A．hainanensis are identified．
Key words：Alpinia hainanensis；cDNA library；MADS-box gene；inflorescences primordium
在姜科植物的花器官演化过程中，侧生钻状附
属体、唇瓣的属性及其与退化雄蕊的关系问题一直
是姜科植物研究中一个倍受关注的研究热点。长期
以来，多数研究者 (Rao等，1954；Rao，1963；Pai，
1965；Burrt，1972)根据形态学及解剖学证据认为唇
瓣是由两枚 内轮雄蕊演化来 的，而侧 生钻状 附属体
则代表了两枚外轮退化雄蕊，但这个观点一直缺乏
分子生物学方面的证据。
Coen等(1991)以及 Bowan等(1991)就花发育
的基因控制机理提出了花发育的ABC模型，该模型
较完善地阐述了花器官建成过程中花器官各组成部
分的属性问题，以及花发育调控基因的表达模式。
为了研究姜科植物花发育的分子机理，克隆控制花
器官发育及属性的ABC功能基因，并进而在分子水
平上对姜科植物的花器官属性作进一步的研究，为
此开展了姜科代表植物草豆蔻(Alpinia hainanen—
sis)的cDNA文库构建和MADS—box基因筛选的工
作。
收稿日期；2005-11-18 修回日期；2006—07—06
基金项目：国家科技部专项(2001CCA00300)；中国科学院学科前沿领域项目；国家自然科学基金[Supported by Ministry of Science and Technology
(2001CCA00300),Field Frontiers Project of the Chinese Academy of Sciences；the National Natural Science Foundation of China]
作者简介：宋娟娟(1975一)，女 ．山东胶州人，博士 ，主要从事遗传与发育方面研究。
‘通讯作者(Author for c0rresp0ndence)
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552 广 西 植 物 27卷
1 材料和方法
1．1材料
(1)草豆蔻不同发育时期的花序原基，采自中国
科学院华南植物园姜园。(2)eDNA合成试剂盒、包
装蛋白及反转录酶等购自 Stratagene公司；Oligo—
tex mRNA kit购 自Qiagen公司；TRIZOL试剂购
自GibcoBRL公司。(3)含水稻(Oryza sativa)基因
RAP1A(ABOO3325)的质粒由中科院上海植物生理
研究所提供。
1．2方法
1．2．1总RNA的提取及 mRNA的纯化 草豆蔻的
总 RNA抽提采用 TRIZOL法。花序原基经液氮研
磨后，参照 TRIZOL试剂盒(美国GIB( BRL公司)
说明抽提总 RNA(具体方法见 htp：／／Ⅵ九vⅥr．gibco—
br1．com／contem／sfs／manuals／l5596O26．pdf)，琼脂
糖凝胶电泳鉴定其质量。
采用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA kit从总
RNA中分离纯化出mRNA。并用紫外分光光度计
(BECKMAN，DU640)测定 mRNA 的浓度并鉴定
其质量。
1．2．2 eDNA的合成及 cDNA文库的构建 草豆蔻
eDNA文库采用 Stratagene的 Uni—ZAP XR eDNA
构建试剂盒构建，操作按该试剂盒的使用说明进行。
1．2．3 eDNA文库质量的测定 (a)cDNA文库库
容量的测定：取 1 L包装好的噬菌体液，稀释成不
同的浓度，分别与培养好的大肠杆菌 XL1一blue混
合，37℃培养 15 rain，加入 48℃的 NZY上层培养
基，快速混匀后立即倒人 37℃预热的 NZY平板
上，待平板上层培养基凝固后，37℃倒置培养过夜，
统计噬菌体斑数目并计算 eDNA文库的库容量。
(b)插入片段大小的检测：用牙签随机挑取噬菌斑
21个，分别接种到PCR反应混合液中，以 T3、T 为
引物进行克隆 PCR，扩增产物用 1 琼脂糖凝胶电
泳检测。
1．2．4 MADS-box基 因的筛选 (a)探针制备：
MAD~Box基因的 5 端一般都有 1个约 180 bp的
保守区域，即 MADS—Box，它编码 1个 DNA结合
域。本工作以水稻基因 RAP1A(AB003325)中含
MAD~Box序列的DNA片段为探针来筛选 cDNA
文库，探 针 的标 记采 用 随机 引物标 记法。(b)
MADS-box基因的筛选：文库筛选按照《分子克隆
实验指南》(黄培堂，等译，2002)所述方法进行，经 2
,- -3轮的嗜菌斑转膜，Southern杂交，获得若干阳性
克隆，经序列测 定 后，将序 列于 NCBI(http：／／
www．ncbi．nlm．nih．gov)的数据库中做 Blast分
析，确定所得到的克隆是否是 目的基因。
2 结果和讨论
2．1草豆蔻总 RNA与 mRNA的抽提
草豆蔻的花序原基采用 TRIZOL方法抽提出
总 RNA，电泳分离结果表明，28sRNA和 18sRNA
带型清晰，说明总 RNA提取完好，未被降解。总
RNA经 Oligotex柱纯化后获得 mRNA，经测定其
260 nm与 280 nm的比值为2．126：1，说明mRNA
足够纯，符合建库要求。
2．2文库质量鉴定
经文库滴度测定，原始文库的滴度为 0．8X 10
pfu／mL，接近 eDNA文库滴度的最佳值 1×lO
pfu／mL，扩增后滴度为 4．23 X 10upfu／mL。
随机挑取 21个噬菌斑，以 T。、T 为引物进行
克隆 PCR，发现有 2O个克隆可扩增出 DNA片段
(图 1)，因此该文库的重组率为 95．3 ，满足文库重
组率须达 8O 以上的标准。在扩增出的克隆中，有
18个克隆的插入片段大小在 500 bp～1．5 kb之间，
符合优质 eDNA文库插入片段平均值应达到 1．0
kb的要求。
图 1 草豆蔻 eDNA文库克隆PCR电泳图
Fig．1 The elone-PCR of the eDNA library
0f A．halnanensis
2．3草豆蔻MADS·Box基因的筛选
除个别基因外，ABC模型中控制花发育的基因
都属于 MADS-Box基因家族。所有植物 MADS_
Box基因的 5 端都有 1个约 180bp的保守区域，即
MADS—Box，它 编码 1个 DNA 结合域 (Ng等，
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4期 宋娟娟等：草豆蔻 eDNA文库的构建及鉴定 553
2001)。为检测所构建的草豆蔻 eDNA文库的代表
性，在本工作中，以水稻 MADS-Box基因RAPlA
(AB0032)的包含 MADS-box序列的片段为探针对
圈
圆圆I匣I圃 一⋯一一E^
约 160，000个噬菌斑进行了筛选，结果表明阳性信
号明显(图2)，共获得 38个阳性克隆。
经过测序、序列分析，最终确认得到 lO个包含
图 2 草豆蔻基因 MADS-Box序列与公认 MADS-Box序列比较
Fig．2 Comparison of MADS-Box region of genes of A．hainanensis and the consensus MADS-Box sequence
AHMA
) I L————— ==== 。1 0(cAL
厂[二 三三
AGL3
A ”ADs1 lI 二二 A GL9(SEP3)
I L1 厂—————-[=二= j H MA口DSs3 —
三
三三三 A GL1 4
¨—————1_——————————一A GL 72 lL _(=二二 三三 {
l厂———] 厂_1_———l }{0
I厂-—————c====二二二二二
ll 厂————_L——————————————一 A P 3
L—————————————————————————————————一 A G L 3 2
图 3 小草蔻和拟南芥中 MADS—box的系统进化树
Fig．3 Phylogenetie tree for Alpinia and
Arabidopsis MADS-box genes
下划线为小革蔻基因
Genes of Alpinia are underlined
MADS-box结 构 的不 同克 隆，分别命 名 为 AH—
MADS1、AH ^ DS2⋯ AHMAD$10，这 lO个基 因
分别属于 A、B、C三个功能。利用 C1ustalW multiple
aligment对 得 到 的克隆 的 MADS-Box与公认 的
MADS-Box的氨基酸序列(Theil3en等，1996)进行比
较，结果显示(图 2)草豆蔻基因的MADS-Box序列与
公认 MADS-Box序列有很高同源性，草豆蔻的 lO个
克隆的 MADS-Box序列之间的同源性也很高。在得
到的 lO个克 隆中，AH DS5、AHMADs6以及
AH DS8已提交到 GenBank中，其登录号分别为
AY621154、AY621155、AY621156。
为了进一步确定草豆蔻阳性克隆的进化位置及
功能分类，我们用草豆蔻基因的蛋白全长序列和拟
南芥的 MIKC类 MADS-box基因的蛋白全长序列
做了系统进化树(图 3)。根据 Thei~en等(1996)对
MADS-box基因的分类，对照我们的系统进化树，
可以看出 AHMADSl属于 SQUA亚家族；AH—
MlADS4、AHMlADS9、AHMADSlO和 AHMlADS7
落人 AGL2亚家族；AHMADS3、AHMADS6落人
AG亚家族，而 AHMADS5、AHMADS8分别落人
B功能基因的两个亚家族：DEF和 GLO亚家族。
也就是说，AHMADS1属于 A功能基因同源基因，
AHMADS4、 AHM ADS9、 AHMAD$10、 AH—
MADS7、AHMADS3以及 AHMADS6属于 C功
能基因，AHMADS5和 AHMADS8属于 B功能基
因，而 AHMADS7则属于 E功能基因。因为 AH—
l詈 星} 一一一～～～～一一～～
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MADS2翻译的蛋白序列太短，没有用到系统树的
制作中。
MADS—Box基因属于低丰度的基 因，我们在
160 000个克隆中得到了 lO个不同的目的克隆，说
明草豆蔻 cDNA文库构建所选用的花序原基材料
的时期较为合理，同时说明所构建的cDNA文库是
一 个比较完整、代表性较高的文库。
中国科学院上海植物生理研究所罗达研究员、冯
献忠博士，中国科学院西双版纳热带植物园李庆军研
究员、夏咏梅副研究员对本研究提出了宝贵意见，中国
科学院上海植物生理研究所董志诚博士对实验方法及
软件应用给予了指导，中国科学院华南植物园博士生
邹璞及禹玉华、方坚平先生在材料的采集过程中给予
了很大帮助，特此致谢! ，
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