全 文 ：广 西 ．植 物 Guihaia 28(3)：411— 413 2OO8年 5月
黄芪原生质体分离技术
刘 强，张宗 申 ，丛丽娜 ，章凌雪
(大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034)
摘 要：以黄芪叶片和愈伤组织为材料，对黄芪原生质体的制备分离技术进行了研究。结果表明：采用黄芪
叶片制备原生质体远远优于黄芪愈伤组织，能够获得大量高活力的原生质体；采用 2 纤维素酶+0．5 半纤
维素酶+O．5 果胶酶的混合酶水解 12 h就能达到较好的分离效果，获得高质量的黄芪原生质体，然后进行
原生质体的培养 。
关键词：黄芪；原生质体；愈伤组织；组织培养
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2008)03—0411一O3
Isolation of protoplast from the Astragalus membranaceus
UU Qiang，ZHANG Zong-Shen ，CONG Li-Na ，ZHANG Ling-Xue
r College of Bio& Food Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 1 16034，China)
Abstract：Leaves and callus of the Astragalus 7，西，谊，z口fet巧 were used to examine the conditions for protoplast prep—
aration and culture of the A．” 7，西，谊，z口fe s．The results showed that the leaf segment of the A．” 7柏 ， ， cet巧 could
release massive and vigorous protoplasts．Compared with the callus of the species，the protoplasts extracted from the
leaf segment are more efficient in the cell fusion and tissue culture．The optimized treatment is 2 cellulase，0．5
hernicelulase，and 0．5 pecfinase for 12 h．
Key words：Astragalus 7ne7 rn加 f s：protoplast；callus；tissue culture
黄芪(Astragalus membranaceus)为多年生豆
科(Fabaceae)植物，其干燥根为常用滋补中药材，含
有活性较强的三萜皂苷、黄酮类、多糖类、氨基酸、微
量元素以及棕榈酸、羽扇豆醇等(胡海英等，2005)。
但由于草原荒漠化以及乱采挖等原因，药用野生黄
芪资源已十分贫乏，即使采用人工栽培的方法不仅
产量不能满足市场需求，而且品质也得不到保证(郑
志仁等，1998)。因此，利用现代生物技术提高种质
资源生物量、优化品质具有重要意义。
植物原生质体融合与培养是通过体细胞杂交创
造新的种质或优良品种的重要生物技术(邢朝斌等，
2006)。分离高质量原生质体是进行原生质体培养
和体细胞杂交的前提，而原生质体产量和活力在很
大程度上取决于材料来源、水解酶组成、酶解时间以
及其它条件(Talman，2006；Tian Meng，1998)。
目前 ，国内外对植物黄芪原生质体的制备、纯化及融
合的研究极少，本实验对此进行大量实验并分析影
响黄芪原生质体得率、活力的因素，获得了制备黄芪
原生质体的理想条件与参数，为进一步利用植物细
胞融合技术改良和生产黄芪提供理论基础。
1 材料与方法
1．1材 料
黄芪愈伤组织培养：取即将成熟展开的黄芪叶
片，清水冲洗干净，75 酒精溶液浸泡数秒，移入
0．1 升汞溶液消毒 7 rain，其间不断摇动，无菌水
冲洗4～5次，撕下叶片下表皮，并将去掉下表皮一
面放在 MS+2，4-D 1．0 mg／L+6-BA 0．5 mg／L+
NAA 0．5 mg／L培养基上，在 25℃黑暗静置培养，
收稿日期 ：2006—12—14 修回日期 ：2007—04—22
基金项目：辽宁省教育厅高等学校科研项目(05L072)[Supported byHighSchool ScientificResearchProgram of EducationDepartment ofLiaoningProvince]
作者简介：刘强(1979一)，男，辽宁抚顺人 ，硕士研究生，研究方向为药用植物细胞工程 。
‘通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E—mail：zhangzs@dlpu．edu．crl；linacong@dlpu．edu．cn)
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412 广 西 植 物 28卷
诱导愈伤组织。3～4 d后 ，形成层部 分开始膨胀 ，
20 d后表面有颗粒状突起并形成黄色的愈伤组织。
1．2方法
1．2．1黄芪叶片的原生质体制备 选取植株顶端未
充分展开的幼嫩叶片，清水冲洗干净 ，75 酒精浸泡
数秒，再用 0．1 升汞溶液消毒 7 min，然后用无菌
水清洗 4～5次，撕下叶片下表皮，并将去掉下表皮
一 面置于盛有酶液培养皿中，25℃黑暗下静置约 13
h，接着在 25℃恒温摇床上50 r／rain振荡 1 h，以分
离原生质体。水解酶液包括 2％纤维素酶 Cellulase
R-IO(Japan)、0．5 半纤维素酶 Hemicellulase(Sig—
ma)和 0．5 果胶酶 Pectolase Y一23(Japan)。酶液
用 CPW-10溶液来配制，pH5．8，最后用微孔滤膜
(O．22～O．45 m)过滤灭菌，4℃可保存 1周。
1．2．2黄芪愈伤组织的原生质体制备 取继代 5～
10 d质地疏松的淡黄绿色愈伤组织 1～2 g，置于盛
有 1O mL酶液的培养皿中，盖上盖子，Parafilm膜
封口。25℃、30 r／min的摇床上黑暗振荡酶解约 13
h，以分离原生质体。
1．2．3原生质体的分离、纯化及检测 酶解液用 200
400目不锈钢筛过滤，于8O0～1 000 r／min离心 5 min
收集原生质体，重复 3次。原生质体悬浮于 CPW-10
洗涤液中(组成为 0．56 mol／L甘露醇，1 480 mg／L
CaC1 ·2H20，5 mmol／L MES等，pH5．8)。用 18％蔗
糖(pH5．8)溶液离心(500 r／min，10 min)漂浮纯化原
生质体。漂浮的原生质体吸至新管中，用 CPW-10洗
涤液洗涤 1次，再用原生质体培养液洗涤 1次，随后
进行原生质体活力、密度的测定(汤章城，1999)。
1．2．4原生质体的培养 经过分离、纯化的原生质
体采用液体浅层培养，3～4 d后可观察到原生质体
第 1次分裂，但原生质体之间粘连严重，且部分原生
质体破裂，再培养 2周后，原生质体分裂形成细胞
团，添加渗透浓度减半的新鲜培养基利于细胞的增
殖。大量植物原生质体培养的实践表明，随着细胞
壁的再生和细胞的持续分裂，渗透剂的浓度需不断
降低，才有利于培养物的生长，此实验仍在进行中。
2 结果与分析
2．1酶液组成对原生质体分离效果的影响
将在新鲜培养基上转接 7 d，颜色淡黄、组织疏
松的愈伤组织和幼嫩的黄芪叶片分别置于表 1所示
三种不同组合的水解酶液中。组合(1)与组合(2)相
比，纤维素酶与半纤维素酶的组合比与果胶酶组合
效果更好。组合(2)和组合(3)比较，三种酶的共同作
用更有利于黄芪原生质体的分离，并且可以得出在
原生质体分离过程中，纤维素酶起关键作用，这应该
是与细胞壁是由大量纤维素成分组成有关。因此，
在后面的实验中，采用纤维素酶+半纤维素酶+果
胶酶的组合来制备黄芪的原生质体(表 1)。
表 1 酶液组成对原生质体分离的影响
Table 1 Effects of enzyme ingredients on separation of protoplasts
(1)2％纤维素酶+O．5％果胶酶 0．7O
(2)％纤维素酶+O．5％半纤维素酶 0．25
(3)2 纤维素酶+O．5％半纤维素 8．00
酶+O．5％果胶酶
65 原生质体数量较多，但活性不高，存在一些胞壁未被酶解的单细胞
6o 原生质体数量少 ，且活性不高，存在大量胞壁未被酶解的单细胞
92 原生质体数量很多，呈非常规则的圆球形 ，活性很高 ，胞壁未被酶
解的单细胞极少
2．2酶液浓度对原生质体分离的影响
在确定了酶液组成的基础上，采用不同浓度的
纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶组合酶解黄芪叶片，
其游离原生质体的产量明显不同(表 2)。酶解后收
集的原生质体的活力基本上都在 7O 以上。对黄
芪来说，组合(3)的原生质体产量最高，故本研究均
采用组合(3)，即 2．0％纤维素酶(Cellulase R一10)、
0．5 半纤维素酶(Hemicelulase)和 0．5 9／6果胶酶
(Pectolase y-23)的组合来分离原生质体。
2．3酶解时间对分离原 生质体的影响
本实验对制备原生质体的酶解时间进行研究，每
隔 2 h检测一下原生质体的情况，如密度、活力等。
结果表明：在酶解 4 h后便有少量原生质体生成，随
着时间的延长，原生质体的数量也逐渐增加；酶解 12
h便产生大量原生质体，其密度和活力为最佳(图 1)，
而后会出现密度和活力下降的趋势，可能是由于失去
细胞壁后，原生质体受到酶液的伤害，或者是因为其
它因素造成的(表3)。因此，当大量原生质体产生后，
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3期 孙苗等：蔷薇科五个植物学名后选模式的指定 297
Herb．Bar Code No．00020870，designated here，
PE!；isolectotype，PE!)．
Spiraea martinii Levi．var．tomentosa T．T．Ya发
表时，作者(俞德浚等，1963)指定保存于中国科学院
植物研究所标本馆的 H．T．Tsai(蔡希陶)53033号
标本为模式 。
查阅该号标本，发现有 2份，分别为 PE Herb．
Bar Code No．00020869和00020870，并且在标本台纸
上均贴有“模式标本／TYPUS”标签和作者于 1959
年 8月 15日手写的新变种命名标签，但都没做任何
交叉标示 。
经比较 ，发 现 PE Herb．Bar Code No．00020870
号标本保存状态较好，其枝、叶、花序和花完整而开
展，无虫蛀和霉变，符合原始描述。根据《国际植物
命名法规》辅则 9A．2和 9A．3的精神，在此选取 H．
T．Tsai 53033(=PE Herb．Bar Code No．00020870)号
标本为后选模式。
致谢 在本文完成过程 中得到陆玲娣研 究员和
谷粹芝研究员的指导和帮助，在此特致感谢 。
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(上接第 413页 Continue from page 413)
因素(周延清等，2003)。本实验对黄芪叶片和愈伤组
织的原生质体的分离进行比较，得出叶片制备的原生
质体优于愈伤组织，并且原生质体的活性非常高，还
具有叶绿体等特征明显的标记，对进行细胞融合的研
究非常有用(严寒等，2005)。酶液的组成、浓度配比
和酶解时间也对原生质体分离有很大的影响，若酶液
浓度大，酶解时间就应缩短，但原生质体破裂数也随
之增多；反之，酶解时间长也会导致较早游离出来的
原生质体破裂(李彦舫等，1999)。本实验采用 2．0 9／5
纤维素酶+O．5 9／6半纤维素酶+0．5 9／6果胶酶的组合
来分离黄芪原生质体，酶解时间为 12 h，得到 9．85X
1O 高产量和 94 高活力的原生质体，达到了原生质
体培养和细胞融合的标准，并为下一步实验奠定了基
础。因此，选择适宜基因型的植物，并建立原生质体
高频再生植株的培养系统是十分必要的(Yang等，
2000)。黄芪不但在中草药临床应用上是非常重要
的，而且也可能成为一种良好的原生质体培养材料，
在遗传工程基础研究领域发挥作用(刘凡等，2006)。
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