全 文 ：　 　 倡 福建省重大科技项目（２００３I００５）和厦门市高新技术项目（３５０２ Z２００２１０５２）资助
　 　 倡倡 通讯作者
收稿日期 ：２００６唱０５唱２８ 　 改回日期 ：２００６唱０６唱３０
花鲈肝脏 hepcidin 相关 cDNA Hepc2 的克隆及序列分析 倡
陈君慧 　王克坚 倡倡 周红玲 　任洪林 　杨 　明
（厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室 　 厦门 　 ３６１００５）
摘 　 要 　 Hepcidin（Hepc）是一类性质独特的抗菌肽 ，具有广谱的抗革兰氏阳性 、阴性细菌和真菌等作用 。 利用 RT唱
PCR 和 RACE等技术 ，从经过多种细菌攻毒的花鲈（ Lateolabrax japonicus）肝组织中克隆出 Hepc全长 cDNA ，命名
为 Hepc２ ，Genbank 登录号为 AY６０４１９５ 。 Hepc２ 有 ５８１ 个碱基 ，其中阅读框有 ２５８ 个碱基 ，编码 ８６ 个氨基酸 。预测
氨基酸序列和白鲈及其他鱼种在相同保守的区域有 ８ 个半胱氨酸 ，相对分子量为 ９４１８ ．５５dal 。 在 ３’非编码区有
２２５bp ，包含终止密码子下游 １８９nt 处的多腺苷酸化 AATAAA信号和 ２１２nt 处的 polyA信号 。 预测蛋白的信号肽断
裂位点在第 ２４和第 ２５个密码子之间 。 通过与白鲈（ Morone chrysops） 、人和其他鱼种来源的 Hepc cDNA 和蛋白质
同源性分析表明 ，从花鲈肝中分离的 Hepc２ cDNA 属于 Hepc基因家族的新成员 。
关键词 　 花鲈 　 Hepcidin 　 抗菌肽 　 基因克隆 　 序列分析
Cloning and sequence analysis of hepcidin唱like cDNA Hepc2 from liver of Lateolabrax japonicus ．CHEN Jun唱Hui ，
WANG Ke唱Jian ，ZHOU Hong唱Ling ，REN Hong唱Lin ，YANG Ming（ State Key Laboratory of Marine Environmental Sci唱
ence ，Xiamen University ，Xiamen ３６１００５ ，China） ，CJEA ，２００７ ，１５（３） ：１２９ ～ １３２
Abstract 　 Hepcidin is a unique antimicrobial pep tide which exerts broad唱spectrum antimicrobial action against Gram唱nega唱
tive and Gram唱positive bacteria ，as well as fungi ．A Hepc唱like cDNA was amplified f rom the liver of L ateolabrax japonicus
challenged with a mixed bacteria solution ．Using RT唱PCR and RACE w ith a specific primer pair ，a full length cDNA se唱
quence Hepc２ of the Hepc唱like an timicrobial peptide （GenBank accession number ：AY６０４１９５） was obtained ．Hepc２ cDNA
is composed of ５８１ bases ，which contains an ORF of ２５８ bases ，encoding ８６ amino acids ．The deduced amino acid sequence
is conserved between white bass and other fish species ，which share eigh t cysteines at the identical conserved position ．The
relative molecular weigh t of the protein is ９４１８ ．５５dal ．The ３′non唱coding region is composed of ２２５bp ，with a polyadeny唱
lation signal AATAAA sequence appearing at position １８９ nt ，and poly （A） tail at ２１２ nt ，downst ream codon TAA ．The
signal peptide cleavage site of its deduced protein is presumed between codon ２４ and ２５ ． High homologies with Hepc
cDNAs and proteins of white bass （ Morone chrysops） ，human and other fish are shown ．It indicates that Hepc２ cDNA
from Lateolabrax japonicus liver is a new member of the Hepc gene family ．
Key words 　 Lateolabrax japonicus ，Hepcidin ，Antimicrobial peptide ，Gene cloning ，Sequence analysis
（Received May ２８ ，２００６ ；revised June ３０ ，２００６）
鱼类抗菌肽是鱼体天然免疫的重要组成部分 ，当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时 ，能迅速产生抗菌
肽以预防和杀伤病原微生物 ，但它对真核细胞几乎没有作用［１］ 。 其分子量小 ，合成速度快 ，在体内扩散迅
速［２］ 。 因此 ，抗菌肽产品在疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌和治疗药物 ，可作为抗生素添加剂的
良好替代品在水产养殖业中发挥不可估量的作用 。 Hepcidin 是近年来发现的一类具广谱抗革兰氏阳性和阴
性细菌 、真菌作用的抗菌肽［３］ ，因发现其主要在肝脏中表达且有抗菌特性 ，所以首先命名为 Hepc 。 本研究利
用 RT唱PCR 、RACE等技术 ，从我国南方海水养殖花鲈鱼（ Lateolab rax japonicus）肝脏中扩增 Hepc cDNA 序
列 ，为研究 Hepc的诱导表达机制及利用生物技术手段人工表达抗菌肽等奠定基础 。
1 　 实验材料与方法
实验花鲈购自厦门龙海海水养殖场 ，体长 ３５cm 。 攻毒菌株溶壁微球菌（ Micrococcus lysodikicus） 、副溶
第 １５卷第 ３ 期 中 国 生 态 农 业 学 报 Vol ．１５ 　 No ．３
２ ０ ０ ７ 年 ５ 月 Chinese Journal of Eco唱Agriculture May ，　 ２００７
血弧菌（ V ibr io parahaemmolyticus） 、大肠杆菌（ Escher ich ia coli ．）及大肠杆菌 ER１６４７ 感受态细胞均为厦门
大学近海海洋环境科学国家重点实验室保存菌种 。 根据已发表的白鲈（ Morone chrysops）Hepc cDNA［５］设计
引物 S１ 为 ５′CGAAGCAGTCAAACCCTCCTAAGATG ３′ ，A１ 为 ５′GAACCTGCAGCAGACA CCACATCCG
３′ ，LYH５GSP２ 为 ５′ACTGATGTCTCCTCATGTGCAGC ３′ ，引物由上海博亚生物工程公司合成 。
将花鲈置于沙滤海水中暂养 ３d后 ，在含有溶壁微球菌 、大肠杆菌和副溶血弧菌的 LB（Luria唱Bertani）液
体培养基浸泡 ５min ，继续置于沙滤海水中养 ２７h 后 ，解剖取其肝组织 ，分成适当大小的几份 ，用锡纸包好 ，立
刻置于液氮中 。 称取保存于 － ８０ ℃ 的肝组织 １００mg ，用 １mL Trizol试剂提取总 RNA ；取适量总 RNA 、下游引
物 A１ 和 AM V 反转录酶 ，４２ ℃ 温育 ６０min ；取适量反转录产物 、引物 A１ 、S１ 和 Taq DNA 聚合酶 ，９４ ℃ 预变性
２min ；９４ ℃ 变性 ４０s ，６０ ℃ 退火 ４５s ，７２ ℃ 延伸 ６０s ，３０ 个循环 ；７２ ℃ 延伸 ５min 完成 PCR 反应 ；取适量总 RNA
利用 SMART RACE cDNA Amplification Kit 完成 ５′唱RACE ，以及 ３′唱Full RACE Core Set完成 ３′唱RACE 。 用
QIAquick Gel Extraction Kit 回收目的片段 ，与 pMD１８唱T 载体连接 ，经转化 、酶切鉴定 ，在上海博亚生物工程
公司测序 。 将测序结果利用 GeneTool软件校正引物 A１ 和 S１ 区序列并拼接获得完整 Hepc２ cDNA 序列 。
应用 DNASIS v２ ．５ Demo 分析核酸 、氨基酸序列 。 在 Genbank 和 Sw iss唱prot 中 ，利用 http ：／／www ．ncbi ．
nlm ．nih ．gov／的 BlastN 和 BlastP 进行同源序列检索分析 ，将同源序列应用 DNAStar５ ．０ 和 ClustalX１ ．８３ 进
行一致性和差异性分析并绘制系统进化树 。 应用 http ：／／www ．cbs ．dtu ．dk／services／SignalP 网站上 SignalP
３ ．０ 进行信号肽断裂位点预测 。
2 　 结果与分析
2畅1 　 花鲈肝 Hepc全长 cDNA Hepc2 核酸和预测氨基酸序列
利用特异性引物 A１ 、S１ ，以花鲈肝组织提取的 RNA 为模板 ，进行 RT唱PCR 反应 ，电泳结果检测到 ３００bp
左右的片段（图 １a） 。 经测序和序列比对确认为 Hepc唱like cDNA 后 ，利用 ３’RACE 、５’RACE 试剂盒 ，以所提
取的 RNA 为模板分别扩增得到 ５００bp 、２００bp左右的特异条带（图１b ，１c） 。经过多次验证 ，序列拼接获得Hepc２
图 1 　 Hepc2 RT唱PCR 、3′RACE 、5′RACE产物琼脂糖电泳图 倡
Fig ．１ 　 Picture of agarose gel elect rophoresis for RT唱PCR ，３′RACE ，５′RACE products
倡 a ：M唱D L２０００marker ，１唱R T唱PCR 产物（约 ３００bp） ；b ：M唱DL１５０００marker ，１唱３’RACE 产物 ，
２唱３’RACE 产物（约 ５００bp） ；c ：M唱D L２０００marker ，１唱５’RACE 产物 ，２唱５’RAC E 产物（约 ２００bp） 。
全长 cDNA 序列（GenBank 登录号 AY６０４１９５）和预测的氨基酸序列（见图 ２） 。 Hepc２ 长 ５８１ bp ，编码区 ２５８
bp ，编码 ８６ 个氨基酸 ，由信号肽（２４aa） 、前域（４１aa）和成熟肽（２１aa）３ 部分组成 ，在 C 末端 ，包含 ８ 个半胱氨
酸残基的保守序列 。 预测编码蛋白相对分子量为 ９４１８ ．５５dal 。 ３′端非编码区长 ２２５ bp ，终止密码子 TAA 下
游 １８９nt 出现 AATAAA 信号 ，poly （A）尾巴出现在 AATAAA 信号下游 １８nt（即终止密码子 TAA 下游
２１２nt） 。 http ：／／www ．expasy ．ch 网站上 SignalP ３ ．０ 分析显示 ，编码的第 ２４ 和 ２５ 氨基酸之间为信号肽断裂
位点（见图 ３） 。
2畅2 　 Hepc2 cDNA预测氨基酸序列同源性比较
将花鲈 Hepc２ cDNA 所编码蛋白的氨基酸序列（AAT０９１３８）做 Blastp 检索 ，结果显示与多种生物 Hepc
蛋白同源性较高 ，并通过网站在数据库中取 ２４ 个同源氨基酸序列 ，应用 DNAStar 软件进行多序列联配对比
及一致性和差异性分析（见图 ３） ，应用 ClustalX１ ．８３ 绘制系统进化树（见图 ４） 。
１３０　 中 国 生 态 农 业 学 报 第 １５ 卷
图 2 　花鲈 Hepc相关 cDNA Hepc2 及其预测氨基酸序列 倡
Fig ．２ 　 Hepc唱like cDNA Hepc２ f rom Lateolabrax japonicus and the deduced amino acid sequence
倡 预测氨基酸序列包括信号肽 、前域和成熟肽 ３ 部分 。 多聚腺苷酸加尾信号
用下划线标出 ，终止密码用星号标出 。
图 3 　 预测花鲈 Hepc2 氨基酸序列结构域部分与相似蛋白同源比对分析 倡
Fig ．３ 　 Domain comparison of amino acid sequence deduced from L ateolab rax j aponicus Hepc２ cDNA w ith some simila r prot ein sequence
倡 成熟肽 C末端有相对保守的 ７ ～ ８ 个半胱氨酸残基 ，花鲈 Hepc２ 推导氨基酸序列用下划线标出 ，黑点标出其成熟肽可能的断裂位点 ，
黑色矩形标出白鲈 （AF３９４２４６）和人 （AF３０９４８９）的 Hepc 成熟肽断裂位点 ，其他蛋白均为预测结果 。
第 ３期 陈君慧等 ：花鲈肝脏 hepcidin 相关 cDNA Hepc２ 的克隆及序列分析 １３１　
　 　 经蛋白同源性对比分析 ，花鲈肝 Hepc２ 预测氨基酸序列与多数鱼类 （除虹鳟 AF２８１３５４ 、大西洋鲑
BI４６８１９１）的 Hepc相关蛋白的一致性较高（５７ ．０ ％ ～ １００ ．０ ％ ） ，与大鲮鲆（AJ８９０３３６）的 Hepc相关蛋白一致
性为 １００ ．０ ％ ，与白鲈（ AF３９４２４６）Hepc 相关蛋白一致性为 ７４ ．１ ％ 和花鲈 Hepc１ 相关蛋白的一致性为
７７畅９ ％ 。 蛋白进化树聚类分析表明 ，花鲈 Hecp２ 与大鲮鲆 、罗非鱼 、黑鲷 Hep５ 等多数鱼类属于亲缘关系更
近的一族 ，鱼类与哺乳动物（人 AF３０９４８９ 、家鼠 AF２９７６６４ 、挪威鼠 AF３４４１８５）的 Hepc相关蛋白不在同一侧
支（见图 ４） 。 但发现 Hepc２ 与人胃癌细胞表达的一个蛋白 DADS２ 有 ６７ ．９ ％ 的一致性 。
图 4 　花鲈肝 Hepc2预测氨基酸序列与同源蛋白序列进化树分析
Fig ．４ 　 Phylogenetic t ree analysis of amino唱acid sequence deduced from Lateolabrax japonicus
Hepc２ cDNA and some homological creatures’ Hepc precursor proteins
3 　 小结与讨论
本研究从经过多种细菌攻毒的花鲈肝组织中克隆出 Hepc全长 cDNA ，命名为 Hepc２ ，有 ５８１ 个碱基 ，其中阅
读框有 ２５８个碱基 ，编码 ８６ 个氨基酸 。 预测氨基酸序列 C末端有 ８ 个半胱氨酸 ，相对分子量为 ９４１８畅５５dal 。 通
过同源性分析 ，表明从花鲈肝中分离的 Hep２ cDNA属于 Hepc基因家族的新成员 。
Hepc具有广谱的抗菌活性在于其独特的结构性质 。 Hepc由带正电荷的氨基酸构成其基本结构 ，是一
类在 C末端富含 ８ 个半胱氨酸残基的保守肽家族 ，能形成带 ３ ～ ４ 个分子内二硫键桥的 ３ 级结构 。 这种肽能
作用于入侵微生物的膜 ，使其产生穿孔现象 ，从而达到抗菌或杀菌的效果［６］ 。 不同生物来源的 Hepc 组成相
似 ，为信号肽 、前域和成熟肽 ３ 个部分 。 通过本研究结果预测花鲈前域与成熟肽的断裂位点可能在第 ４２ 个
氨基酸残基异亮氨酸（I）左右（见图 １ 和图 ３） ，成熟肽包含 ２１ 个氨基酸和白鲈的成熟肽大小一致 。
Hepc最早从人的血浆和尿液中分离纯化得到 ，之后在鼠（ Mus musculus） 、鱼 、猪 、狗等多种动物体内均
有发现［７ ，８］ 。 对预测的 Hepc２ 蛋白和其他鱼以及哺乳动物的 Hepc相关蛋白进行多序列联配对比 ，Hepc２ 和
多数鱼类的 Hepc相关蛋白的同源性比来源于挪威鼠 、家鼠 Hepc相关蛋白高 。 利用 ClustalX１ ．８３ 绘制系统
进化树 ，鱼类 Hepc相关蛋白在同一支 ，而哺乳动物在另一支 ，这可能和它们所处的进化地位相一致 。 至于
花鲈肝脏 Hepc相关基因的表达特性 、生物活性及其相关功能有待于进一步研究 。
参 　 考 　 文 　 献
１ 　 Douglas S ．E ．，Gallan t J ．W ．，Gong Z ．，et a l ．Cloning and develop mental expression o f a f amily o f p leurocidin唱like ant imicrobial peptides from
wint er flounder ，Pleu ronectes ame ricanus（Walbaum） ．Development al and Comparative Immunology ，２００１ ，２５ （２） ：１３７ ～ １４７
２ 　 Lehrer R ．I ．，Ganz T ．Defensins of vertebrate animals ．Curr ．Opin ．Immunol ．，２００２ ，１４ （１） ：９６ ～ １０２
３ 　 Park C ．H ．，et a l ．Hepcidin ，a urinary antimic robial peptide synthesized in the live r ．J ．Bio l ．Chem ．，２００１ ，２７６ （１１） ：７８０６ ～ ７８１０
４ 　 Hiroko Shikel ，et a l ．Bass Hepc is a no vel antimic robial pept ide induced by bacterial challenge ．Eur ． J ．Biochem ．，２００２ ，２６９ （８） ：２２３２ ～ ２２３７
５ 　 Verga Falzacappa M ．V ．，Muckenthale r M ．U ．Hepcid in ：I ron唱hormone and ant i唱microbial pept ide ．Gene ，２００５ ，３６４ ：３７ ～ ４４
６ 　 Pig eon C ．，I lyin G ．，Courselaud B ．，et a l ．A new mouse live r唱specif ic g ene ，encoding a protein homologous to human antimic robial peptide
hepcidin ，is ove rexpressed during iron overload ． J ．Biol ．Chem ．，２００１ ，２７６ （１１） ：７８１１ ～ ７８１９
７ 　 Sanga Y ．， Ramanathan B ．，et a l ．Porcine live r唱expressed antimic robial peptides ，hepcidin and LEAP唱２ ：cloning and induct ion by bac terial
infection ．Developmental and Comparative I mmunolo gy ，２００６ ，３０ （４） ：３５７ ～ ３６６
１３２　 中 国 生 态 农 业 学 报 第 １５ 卷