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生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
人类抗菌肽 hepc id in在毕赤酵母中的分泌表达和纯化
Farzana Rashid　 Ijaz A li　袁其朋　孙新晓　李文进　李飞
(北京化工大学生命科学与技术学院 ,北京 100029)
　　摘 　要 : 　报道了一种低分子量的人类抗菌肽 hepcidin基因的克隆、表达以及纯化。试验证明在毕赤酵母中能成功分泌
有活性的 hepcidin, hepcidin在重组菌株中的表达量约为 3 mg/L,W estern blot显示 2. 2 kD的重组 hepcidin条带 ,重组 hepcidin
通过凝胶过滤及反向高效液相色谱纯化 ,质谱验证 ,重组蛋白对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出抗菌活性。
关键词 : 　抗菌肽 　Hepcidin 20　铁 　毕赤酵母 　分泌表达
Secretory Expression and Purif ication of a Human Hepcidin in P. pastoris
Farzana Rashid　 Ijaz A li　Yuan Q ipeng　Sun Xinxiao　L i W enjin　L i Fei
( College of L ife Science and Technology, B eijing University of Chem ical Technology, B eijing 100029)
　　Abs trac t: 　Exp ression and purification of small pep tides have always been p roblematic due to enzymatic degradation and many
other technical p roblem s. W e reported cloning and exp ression of a low molecular weight human antim icrobial pep tide hepcidin (Hepc,
20 am ino acids) into pP IC9K transformed into P. pastoris GS115. The study revealed that active hepcidin pep tide can be successfully
exp ressed in this methylotrophic yeast. Hepcidin p rotein exp ressed in recombinant strains was about 3 mg/L. Pep tide exp ression was
detected by immuno blotting. Recombinant hepc 20 was purified through reverse - phase HPLC column and characterized by mass spec2
trometry and am ino acid sequencing. It also exhibited antibacterial activity against S. aureus and B acillus subtilis. Such a research work
is being p resented for the first time and it is hoped that this will p rovide a basis for the mass p roduction of Hepc 20.
Key wo rds: 　Antim icrobial pep tide　Hepcidin 20　 Iron　P. pastoris　Secretory exp ression
收稿日期 : 2009204224
基金项目 :国家自然科学基金 (20576010)
作者简介 : Farzana Rashid (19672) ,女 ,博士研究生 ,研究方向 :生物化工 ; E2mail: fari267@yahoo. com
通讯作者 :袁其朋 ,教授 ,博士生导师 ; E2mail: yuanqp@mail. buct. edu. cn
　　近年来从生物体中发现了多种抗菌肽 [ 1, 2 ]。在
研究人类体液的抗菌性质时 ,发现了一种新肽 [ 2 ] ,
根据其合成部位 (肝脏 )和体外抗菌性质将其命名
为 hepcidin。hepcidin是在肝细胞中合成的富含半
胱氨酸的阳离子多肽 ,对肠内铁离子的吸收起关键
的调节作用 [ 2, 4 ] ,通过与铁的输出膜转运蛋白相互
作用 [ 5 ] ,减少肠内铁的吸收并抑制巨噬细胞内铁的
释放。Zhang等 [ 6 ]提出 hepcidin在医学上可以用于
多种铁稳态失衡的治疗。最初从尿液中分离的到的
hepcidin浓度很低 [ 7 ] ,而且 hepcidin不易于化学合
成。在毕赤酵母菌株 X33 中表达加标签的 hepc
25[ 8 ]已有报道 ,但目前未带标签的重组 hepc 20蛋
白在真核细胞中的表达和纯化还未见报道。为了用
作药物以及进一步研究首次对 hepcidin在毕赤酵母
中的分泌表达和活性分析进行了研究。
1　材料和方法
111　材料
E. coli (BL21) , DH5α,毕赤酵母 GS115菌株以
及质粒 pP IC9K 购自 Invitrogen 公司 ( California,
USA)。下面的培养基用于不同条件下毕赤酵母的
培养 : YPD ( 10 g/L酵母提取物 , 20 g/L胰蛋白胨 ,
20 g/L葡萄糖 ) , BMGY(10 g /L酵母提取物 , 20 g/L
胰蛋白胨 , 100 mmol/L K3 PO4 , 13. 4 g/LYNB , 4 ×
10 - 5生物素 , 10 g/L 甘油 , pH6. 0 ) , BMMY ( 5 m l/L
过滤除菌的甲醇替代 BMGY的 10 g/L 甘油 )。
MGY ( 13. 4 g/L YNB, 4 ×10 - 5生物素 , 10 g/L 甘
油 ) ,MM (5 m l/L过滤除菌的甲醇替代 MGY的 10
g/L甘油 )。MD平板 (13. 4 g /L YNB, 4 ×10 - 5生物
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
素 , 20 g/L葡萄糖 , 15 g/L琼脂 )。MM琼脂平板 (5
m l/L过滤除菌的甲醇替代 MD平板的 20 g/L葡萄
糖 )。RDB (20 g/L葡萄糖 , 13. 4 g/L YNB, 4 ×10 - 5
生物素 ,过滤除菌的 L2谷氨酸、L2赖氨酸、L异亮氨
酸、L2甲硫氨酸各 0. 05 g/L ) , RDB 2G418琼脂平板
(RDB琼脂平板加入 0. 5～3 g/L G418)。兔抗人抗
体 HEPC122S以及合成的人 hepcidin HEPC712P购
自 A lpha D iagnostics ( SanAntonio, TX)。羊抗兔二抗
(连接 AP)购自 Sigma。
112　方法
11211　pP IC9K2H表达质粒的构建 　质粒构建运用
标准重组 DNA技术 [ 9 ]。按照毕赤酵母密码子的偏
好性 ,合成了一段包含肠激酶识别位点的 99 bp的
hepcidin序列 ,将其插入 pMD192T载体。质粒经
PCR以及 DNA 测序验证。 hepcidin 片段用带有
EcoR I位点的上游引物 ( F: 5′2ATGAATTCGACGAT2
GACGATAAGA23′)和带有 N ot I位点的下游引物
(R: 5′2ACGCGGCCGCTCATTAAGTCTT23′)扩增。引
物酶切位点便于后续将 hepcidin蛋白编码序列克隆
到 pP IC9K表达载体。PCR产物用 EcoR I和 N ot I双
酶切连接到用相同酶切过的 pP IC9K表达载体上。
得到的 pP IC9K2H质粒通过酶切和测序验证。
1. 2. 2　毕赤酵母转化以及 H is+ Mut+转化子筛选 　
毕赤酵母通过电转化 ,感受态细胞制备参考文献
[ 10 ]。转化过程使用 B io2Rad Gene Pulser II电转
仪 ,电转参数 2. 5 kV /cm, 50μF和 400Ω。涂有转
化菌的 RDB2G418琼脂平板在 29°C培养 3～4 d。
H is+和 G418抗性菌株挑到 MM和 MD平板上 29°C
培养 2～3 d。H is+ Muts 与 H is+ Mut+转化子通过在
MM和 MD平板上菌落生长快慢进行区分。
11213　毕赤酵母重组转化子的 PCR验证 　hepci2
din多肽序列由 AOX1启动子控制 ,所用引物为 5′
AOX1: 5′2GACTGGTTCCAATTGACAAGC23′; 3′2AOX
1: 5′2GCAAATGGCATTCTGACATCC23′。基因特异
性正向和反向引物 HF: 5′2TTTGTATTTTCTGTTGTG2
GTTGTTG23′和 HR: 5′2GTCTTAAACACATACCACAC
TTAG23′用来验证转化子。按照多拷贝毕赤酵母表
达试剂盒的说明提基因组 DNA进行 PCR。PCR反
应按照下列程序进行 :预变性 94°C 2 m in,接着进行
30个循环 (94°C 40 s, 60°C 40 s, 72°C 40 s) ,最后
72°C延伸 10 m in。
11214　毕赤酵母摇瓶培养和 hepcidin分泌表达 　
经 PCR验证的重组菌株按照修改过的 Invitrogen说
明书 [ 10 ]在 BMGY培养基中培养。每 24 h加入 100
m l/L的甲醇至终浓度 0. 5%进行诱导。每 24 h取
样分析表达水平和细胞浓度。
11215　蛋白估计和 W estern blot分析 　取发酵液离
心 ,上清与 Tricine2SDS2PAGE上样缓冲液混合后进
行 SDS2PAGE电泳分离 [ 11 ]。考马斯亮蓝染色后经
GelDoc analyzer (B io2Rad)进行蛋白估计。蛋白样
品电转到膜上后进行 W estern blot检测。膜用 50 g/
L脱脂牛奶 /TN 缓冲液 ( 10 mmol/L Tris2HCl, 150
mmol/L NaCl, pH8. 0)进行封闭 ,用兔抗人 HEPC标
记 (稀释 1000用 50 g /L脱脂牛奶 /TN缓冲液 ; 20～
25℃, 1 h) ,接着加入连有 AP的羊抗兔 IgG (用 50
g/L脱脂牛奶 /TN缓冲液稀释 10 000倍 ; 20～25℃,
1 h )。结合抗体用 100 mmol/L NaCl, 5 mmol/L
MgCl2 , 100 mmol/L Tris2HCl缓冲液 , pH 9. 5)溶解的
52溴 242氯 232吲哚基 2磷酸盐 ( BC IP ) 和四唑硝基
(NBT)蓝作为底物进行检测。
11216　重组蛋白的纯化和定性 　首先按照 DNA2
MAN计算的等电点从上清中沉淀 hepcidin,接着用
Sephadex G225柱 (1. 0 cm ×100 cm )进行凝胶过滤
层析纯化 ,用 0. 025 M NaCl和 0. 01 M HCl流速 0. 3
m l/m in洗脱。于 37℃进行肠激酶切割反应。然后
hepcidin进一步用反向色谱纯化。采用 RP2HPLC
( Shimadzu, Kyoto, Japan) , VydacC18柱 ( 218TP54) ,
上样量 10μl。HPLC柱用 0. 1% TFA平衡 ,用乙腈 /
0. 1% TFA梯度洗脱。乙腈初始浓度为 15% ,终浓
度为 40% ,流速 1 m l/m in,洗脱时间 30 m in。收集
含有 hepcidin的洗脱液通过 EL ISA分析检测 , hepci2
din的终产量用峰面积估计。用 W aters U ltra Per2
formance LC2ES/MS和 W aters Quattro Prem ier XE进
行质谱分析。含有 hepcidin的洗脱液冻干后保存在
- 20℃。此外 ,纯化的 hepcidin通过 N端测序 ( Shi2
madzu PPSQ221)确定整个多肽的氨基酸序列。
11217　EL ISA分析 　含有 hepcidin的洗脱液点到
微孔板上 ,浓度少于 2μg/m l[ 12 ] ,记录波长 405 nm
下的吸光度。
11218　重组蛋白的抗菌活性 　重组蛋白的抗菌活
221
2009年第 9期 Farzana Rashid等 :人类抗菌肽 hepcidin在毕赤酵母中的分泌表达和纯化
性通过琼脂扩散法针对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢
杆菌进行了验证。对数中期的细胞涂布到 2 ×YT
培养基上 ,加入 25μg重组 hepcidin。平板于 37°C
培养 1 d直到出现抑菌圈。水作为阴性对照。
2　结果与讨论
hepcidin可以通过化学合成或在大肠杆菌中表
达生产 [ 8, 13 ]。在本研究中 ,第一次实现了活性重组
Hepc20在毕赤酵母中的异源分泌表达。
211　转化子表型筛选
30个含有 pPIC9K2H质粒的遗传霉素抗性 (G418R )
菌落接种到 MD和 MM平板上 (图 1)。这些菌落都
是 H is+ Mut+ ,因为它们有相同的生长速度。提取基
因组 ,用 Hepc基因特异性引物进行 PCR扩增。挑
选了 20个含有醇氧化酶和 Hepc基因的转化子。阳
性重组子中 hepcidin蛋白编码序列通过单交换正确
地整合到毕赤酵母基因组中 (图 2)。
图 1　pP IC3. 5 K2hepc id in表达质粒的构建
1. pP IC9K2H质粒泳道 ; 2. 整合的 pP IC9K2H 的 PCR产物 ; 3. 对照菌
株的 PCR产物 ;M1. DNA marker DL 15000
图 2　hepc基因整合入毕赤酵母基因组的验证
212　hepcidin的表达
能在含 1 mg/m l G418 平板上生长的单克隆
(H is+ Mut+ )用来进行摇瓶蛋白表达研究。细胞以
与前面提到的同样的条件在 BMGY培养基上生长
后 ,每 24 h加入 0. 5%的甲醇诱导。用转化过空质
粒 pP IC9K的菌株作为对照。Tricine2SDS2PAGE表
明异源 hepcidin多肽在毕赤酵母中成功表达。
213　蛋白表达和 W estern blot检测
重组 hepcidin蛋白在诱导 48 h后通过 Tricine2
SDS2PAGE检测。进入对数生长期蛋白已明显表
达 ,稳定期达到峰值 ,之后基本保持稳定。蛋白表达
水平达到 3 mg/L。细胞最佳收获时间是诱导后 48
～60 h。用兔抗 HEPC进行 W estern blot,合成的
HEPC712P作为对照。在图 3中可以看到 2. 2 kD的
单一阳性反应条带。用 pP IC9K载体转化的诱导重
组菌株检测不到同样分子量的条带。
1. 产量最高菌株 ; 2. Hepc阴性对照 ; 3. 人 Hepc 20 (阳性对照 )
图 3　重组多肽的 W estern blot检测
214　蛋白纯化 , EL ISA检测以及重组 hepcidin定性
细胞 (诱导 60 h)破碎制备样品后 ,重组多肽经
过等电点沉淀 ( p I8. 53 )以及 SephadexG225凝胶过
滤色谱纯化 (图 4)。含有 hepcidin的部分经过反向
HPLC进一步纯化 (图 5) ,反向 HPLC hepcidin出峰
时间与化学合成的 hepcidin相同。另外 ,测定的分
子量与计算值一致 ( 2. 19177 kD )。每一种分离组
分通过 EL ISA 分析以确定组分中是否含有重组
Hepc并证实得到的物质确实是 hepcidin。EL ISA结
果 (表 1)显示重组菌株出现 hepcidin阳性信号 ,阴
性对照菌株没有信号。在 48 h收集的培养基中得
到相同的结果。
另外 , LC2ESI2MS分析得到分子量为 2. 192 kD
的峰 (图 6)。质谱的主峰和氨基酸测序结果显示重
组蛋白的分子量和氨基酸序列与天然 hepcidin20
相同。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
1. 样品 1; 2. 样品 2;M. 蛋白 marker
图 4　经 Sephadex G - 25纯化的 Hepc电泳图谱
1. 样品 1; 2. 样品 2;M. 蛋白 marker
图 5　hepc id in的反向 HPLC色谱图
表 1　EL ISA结果显示的 405 nm的吸光度 ( 3次平均值 )
测试组别 1 2 3 4 5
EL ISA
平均值
(405nm)
0. 239 0. 251 0. 259 0. 152 0. 394
注 : 1, 2, 3. 重组 Hepc样品 ; 4. 不含 Hepc的阴性对照 ; 5. 含 HEPC 712
P的阳性对照
1. 样品 1; 2. 样品 2;M. 蛋白 marker
图 6　经反向 HPLC纯化的 hepc id in的质谱图
215　重组蛋白抗菌活性
此外 ,通过琼脂扩散分析 ,重组 hepcidin与之前
报道一样对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出
抗菌活性。
3　总结
总结 hepcidin 的摇瓶培养表达量可以达到
3 mg/m l,高于之前的报道。另外 ,之前的研究报道 ,
hepcidin是从尿样中分离或者是以带标签的形式表
达 [ 14, 15 ] ,本研究利用毕赤酵母 GS115菌株成功表达
纯化了未加标签的 hepcidin, hepcidin对金黄色葡萄
球菌和枯草芽孢杆菌表现出抗菌活性。这是 hepc
20在毕赤酵母中成功分泌表达的首次报道 ,这将有
助于铁代谢失调患者的治疗。
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