全 文 ：中国生态农业学报 2012年 1月 第 20卷 第 1期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Jan. 2012, 20(1): 7−12


* 国家自然科学基金项目(40801097)资助
宋亚娜(1973—), 女, 副研究员, 博士, 主要从事微生物分子生态学研究。E-mail: syana@sina.com
收稿日期: 2011−04−23 接受日期: 2011−08−26
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2012.00007
氮肥对稻田土壤反硝化细菌群落结构和丰度的影响*
宋亚娜 林智敏 林 艳
(福建省农业科学院生物技术研究所 福建省农业遗传工程重点实验室 福州 350003)
摘 要 以氮肥田间定位试验为研究对象, 利用 PCR-DGGE(聚合酶链反应−变性梯度凝胶电泳)和荧光定量
PCR(real-time PCR)技术, 通过对反硝化细菌 nirS基因的检测, 分析了定位试验第 2年稻田反硝化细菌群落结
构和丰度的变化。DGGE图谱及依据其条带位置和亮度数字化数值进行的主成分分析(PCA)结果均显示: 在氮
肥定位试验第 2 年, 与不施肥对照(CK)比较, 在水稻各个生育期(分蘖期、齐穗期和成熟期)内, 施用氮肥[150
kg(N)·hm−2]的稻田根层土或表土中的反硝化细菌群落结构均无明显变化; 且稻田根层土或表土中的反硝化细
菌群落结构在水稻各个生育期间也均无明显差异。荧光定量 PCR 结果显示, 在水稻生长发育过程中, 施用氮
肥的稻田根层土或表土中的反硝化细菌 nirS基因拷贝数始终显著(P<0.05)高于其对应的不施肥对照。此外, 无
论施用氮肥与否, 根层土中的反硝化细菌 nirS基因拷贝数在水稻成熟期时都会显著(P<0.05)降低; 但表土中的
nirS 基因拷贝数在水稻各生育期间无明显变化; 且水稻成熟期时施用氮肥和不施肥的稻田表土中 nirS 基因拷
贝数都显著(P<0.05)高于根层土。同时, 与对照比较施用氮肥可促进水稻增产 44%。研究表明, 短期定位试验
中施用氮肥能够显著提高稻田土壤反硝化细菌的丰度, 但对其群落结构没有明显影响。
关键词 氮肥 反硝化细菌 群落结构 丰度 nirS基因 聚合酶链反应−变性梯度凝胶电泳 荧光定量 PCR
中图分类号: S154.3 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2012)01-0007-06
Response of denitrifying bacteria community structure and
abundance to nitrogen in paddy fields
SONG Ya-Na, LIN Zhi-Min, LIN Yan
(Institute of Biological Technology, Fujian Academy of Agricultural Sciences; Fujian Key Laboratory of
Genetic Engineering for Agriculture, Fuzhou 350003, China)
Abstract Denitrification is critical for nitrogen cycle in the ecosystem, where fixed nitrogen is released into the atmosphere as N2.
Nitrite reductase, the product of nirS or nirK nitrite reductase genes, is the key enzyme of bacteria dissimilatory denitrification proc-
ess. Denitrifying bacteria community composition varies with environmental factors such as temperature, moisture, pH, O2 and nu-
trient availability. There is obvious denitrification process in flooded paddy fields. Hence denitrifying bacteria community structure
and abundance in paddy fields are used to investigate the response of denitrifying bacteria to nitrogen fertilizer application in paddy
fields. The experiment was conducted in a second-year nitrogen fertilization field with the aid of denaturing gradient gel electropho-
resis and real-time PCR assay copies of nirS gene. DGGE images of nirS gene in root-zone soil and surface soil showed rich abun-
dance of denitrifying bacteria in paddy soils. DGGE band number in surface soil image was higher than that in root-zone soil. Princi-
ple components analysis (PCA) of nirS gene DGGE profile showed that denitrifying bacteria community structure in root-zone or
surface soil of paddy fields with nitrogen fertilizer [N: 150 kg(N)·hm−2] was similar to that of paddy fields without fertilizer (CK)
during rice growth stages of tillering, heading and maturity. Also no difference was noted in denitrifying bacteria community struc-
ture in root-zone soil or surface soil among different growth stages of rice. Denitrifying bacteria nirS gene copy abundance in
root-zone or in surface soil with nitrogen fertilizer treatment was significantly (P < 0.05) higher than that of CK treatment during rice
growth. In both nitrogen fertilizer and CK treatments, denitrifying bacteria nirS gene copies in root-zone soil markedly (P < 0.05)
dropped at maturity stage of rice growth. There were, however, no differences in nirS gene copies in surface soil among the different
rice growth stages. At maturity stage, nirS gene copies in surface soils of both nitrogen fertilizer and CK treatments were higher (P <
8 中国生态农业学报 2012 第 20卷


0.05) than those in root-zone soils. Furthermore, rice yield in nitrogen fertilizer treatment was 44% higher than that of CK. In conclu-
sion, denitrifying bacteria abundance was not only variable but also actively responded to nitrogen fertilizer supply. On the other
hand, denitrifying bacteria community structure was not only relatively stable but largely unresponsive to nitrogen fertilizer supply.
The study demonstrated that nitrogen fertilizer enhanced denitrifying bacteria abundance, which was critical for nitrogen cycling in
paddy field ecosystem.
Key words Nitrogen fertilizer, Denitrifying bacteria, Community structure, Abundance, nirS gene, Denaturing gradient gel
electrophoresis, Real-time PCR
(Received Apr. 23, 2011; accepted Aug. 26, 2011)
作为土壤氮素循环重要组成部分的反硝化作用
是在硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、NO还原酶和
N2O 还原酶 4 种酶连续催化下将 NO3−还原为 N2的
过程。反硝化作用形成的气态物质不仅造成土壤氮
素损失, 并且污染大气产生温室效应。在反硝化过
程中亚硝酸盐还原成 NO 的反应是区分反硝化菌和
硝酸盐呼吸菌的第一步, 后者不会将硝酸还原成气
体, 因此亚硝酸盐还原酶可作为反硝化过程的关键
酶用于反硝化菌的分子标记[1−2]。亚硝酸还原酶有 2
种不同结构形态, 一种酶由含有铜基(Cu-nir)的 nirK
基因编码, 另一种由含有亚铁血红素 cd1(cd1-nir)的
nirS 基因编码[1]。nirK 基因存在于许多亲缘关系较
远的菌株中, 且分子量变化较大; 而含有 nirS 基因
的细菌以假单胞菌占优势, 且在不同菌株中分子大
小相似, 形态结构相对保守[2−3]。
随着分子生物技术的发展, 对土壤中反硝化细
菌群落多样性的认识逐渐增多。研究发现NO3−含量、
O2含量、pH、含水量、温度、季节和植被类型等因
素都可改变土壤反硝化细菌群落结构[4−10]。稻田淹
水的微氧条件为反硝化细菌提供了良好的生存环境,
具有显著反硝化作用[11]。虽然目前已有不少关于反
硝化细菌多样性的研究, 但对稻田土壤中反硝化细
菌功能基因多样性及其功能的研究还较少。
本研究以氮肥田间定位试验的稻田土壤为供试
材料 , 选择反硝化细菌nirS基因为研究对象 , 运用
PCR-DGGE和荧光定量PCR技术分析了施用氮肥对
稻田反硝化细菌群落结构和丰度的影响。初步揭示
了在短期定位试验中稻田土壤反硝化细菌nirS基因
群落结构和丰度对氮肥的响应状况, 为进一步深入
研究反硝化细菌在稻田氮素循环中的作用奠定理论
基础。
1 材料与方法
1.1 试验区概括
2009年开始在位于福建省福州市寿山乡前洋村
的福建省农业科学院生物技术研究所试验基地, 建
立水稻肥料定位试验。供试地点属暖湿的亚热带季
风气候, 无霜期长达 326 d, 年平均气温为 19.6 ℃,
平均湿度 77%, 年均降水量 1 342.5 mm。供试土壤
基本性状为: 有机质 16.87 g·kg−1、pH 5.78、全氮 1.29
g·kg−1、全磷 0.28 g·kg−1、全钾 19.39 g·kg−1、碱解氮
208.1 mg·kg−1、有效磷 15.97 mg·kg−1、速效钾 78.73
mg·kg−1。
1.2 试验设计
试验设置施氮肥 150 kg(N)·hm−2和不施肥料的
对照(CK)处理。氮肥种类为尿素, 2/3 氮肥用做基
肥, 1/3氮肥在水稻分蘖后期追肥。每个处理重复 3
次, 共 6个田间小区随机排列, 小区面积 16 m2, 每
小区种植 300 株。供试水稻品种为“天优 3301”
(Oryza.sativa L. “Tianyou3301”), 按当地常规方法进
行水稻栽培的田间管理。2009—2010年进行 2年的
定位试验, 水稻做中稻栽培, 每年 5月播种、6月移
栽、10 月收获, 各小区水稻全部收获测产。每年水
稻收获后稻茬翻入土中, 下一年按前一年小区排列
进行种植。分别于 2010年 7月(分蘖期)、9月(齐穗
期)和 10月(成熟期)采集土样。每次重复取 5株水稻,
整株挖起后, 取深度为 10~20 cm 的根系周围土壤
(根层土), 5株水稻根系取得的土壤混合为１个样品;
每个小区随机选 5个点采集土层深度约为 0~5 cm的
土壤(表土), 将 5点采集的土壤混合为１个样品。田
间采集的土样放入 4 ℃冰盒中保存, 于实验室内将
混合后的土壤去除根系、杂草、土壤动物和石块等
杂质后混匀, 分装入 50 mL塑料离心管中, −20 ℃冷
冻保存用于土壤微生物分析。
1.3 分析方法
1.3.1 土壤微生物总 DNA提取
称取 0.5 g 于−20 ℃保存的土壤样品 , 采用
FastDNA® SPIN Kit For Soil(Q⋅BIOgene)试剂盒进行
土壤微生物总 DNA的提取, DNA样品−20 ℃冰箱保
存待用。
1.3.2 反硝化细菌群落结构分析
利用反硝化细菌nirS基因特异引物[12]进行PCR扩
增(表1), 反应体系50 μL, 其中2 μL 稀释5倍的DNA
模板加反应液48 μL, 反应液包括1 μL Taq DNA 聚
合酶(2.5 U·μL−1, 天根生物公司, 北京), 5 μL dNTPs
(2 mmol·L−1各碱基 , 上海生物工程公司 , 上海), 5
μL 10×PCR-buffer(10倍的PCR缓冲液, 天根生物公
第 1期 宋亚娜等: 氮肥对稻田土壤反硝化细菌群落结构和丰度的影响 9


司, 北京), 前、后引物各4 μL(5 pmol·μL−1, 上海英
骏生物工程公司, 上海)和29 μL 超纯水。PCR产物
经琼脂糖电泳EB(溴化乙腚)染色检查后, 用40 μL 的
PCR产物进行变性梯度凝胶电泳 , 采用梯度为
40%~60%的8%聚丙烯酰胺凝胶[化学变性剂为100%
尿素7 mol·L−1和40%(v/v)的去离子甲酰胺 ]在1 倍
TAE缓冲液中150 V 60 ℃下电泳5 h。电泳后用10 mL
SyBR green I(Sigma) (1倍 TAE稀释10 000倍)核酸染
料染色45 min, 然后用Bio-Red成像系统拍照。
1.3.3 反硝化细菌的丰度检测
以稻田土壤中 nirS基因拷贝数表示反硝化细菌
丰度。利用荧光定量 PCR技术检测反硝化细菌 nirS
基因数量。如表 1所示, 反硝化细菌的荧光定量 PCR
扩增采用 nirS 基因特异引物, 每个样品 3 次重复。
采用 SYBR® Premix Ex TaqTM(宝生物工程公司 ,
TakaRa, 大连)试剂盒于 ABI PRISM7500 Real-Time
PCR System扩增仪上进行绝对定量 PCR分析。荧光
定量 PCR 反应体系 25 μL, 其中 2 μL 稀释 5 倍的
DNA 模板加反应液 23 μL, 反应液包括 12.5 μL
SYBR® Premix Ex TaqTM (2×), 0.5 μL ROX Reference
Dye II (50×), 前、后引物各 1 μL(浓度同上)和 8 μL
超纯水。
1.3.4 绝对荧光定量 PCR标准曲线建立
以对照处理土样提取的DNA为模板进行反硝化
细菌nirS基因的PCR扩增, 扩增条件如表1所示, 将
100 μL的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 切下含
有反硝化细菌nirS基因的约336 bp片段的胶块 , 用
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit(OMEGA, 美国)胶回收
试剂盒纯化。按试剂盒方法用pMD18-T载体连接
PCR产物, 以大肠杆菌DH5α制备的感受态细胞转化
连接产物, 在氨苄青霉素平板上进行蓝白斑试验筛
选阳性克隆。取部分阳性转化菌液送上海英骏生物
工程有限公司进行测序 , 重组质粒测序结果经
GenBank的 Blast比对 , 与反硝化细菌 nirS基因
(AB456873)同源性达99%。表明重组质粒可以作为
反硝化细菌进行绝对荧光定量 PCR分析的标准
DNA。利用E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit试剂盒提取重
组质粒DNA, 然后用Nanodrop(美国)测定重组质粒
DNA的质量浓度为91.4 ng·μL−1。根据已知重组质粒全
序列和阿伏伽德罗常数6.02×1023 分子数·mol−1计算反
硝化细菌nirS基因拷贝数为4.38×1010 cells·μL−1。以10
倍梯度稀释反硝化细菌nirS基因重组质粒进行荧光
定量PCR检测, 每个稀释梯度重复3次, 获得反硝化
细菌nirS基因标准曲线。

表 1 反硝化细菌 nirS基因 PCR扩增引物及反应条件[12]
Table 1 Primers and PCR conditions of nirS gene of denitrifying bacteria used in the study
项目 Item PCR反应条件 PCR condition
引物序列
Primer sequence (5’-3’)
nirS4F : TTC(A/G)TCAAGAC(C/G)CA(C/T)CCGAA
nirS4FGC1)
nirS6R : CGTTGAACTT(A/G)CCGGT
PCR-DGGE反应程序
Thermal profile for PCR-DGGE


95 ℃预变性 5 min, 95 ℃变性 30 s, 45 ℃退火(−0.5 ℃/循环)40 s, 72 ℃延伸 40 s, 10 个循环; 95 ℃
变性 30 s, 43 ℃退火 40 s, 72 ℃ 延伸 40 s, 20个循环; 72 ℃ 7 min
95 ℃ 5 min, 95 ℃ 30 s, 45 ℃ (−0.5 ℃/cycle) 40 s, 72 ℃ 40 s, 10 cycles; 95 ℃ 30 s, 43 ℃ 40 s, 72 ℃
40 s, 20cycles, 72 ℃ 7 min
荧光定量 PCR反应程序
Thermal profile for real-time PCR
95 ℃预变性 30 s, 95 ℃变性 30 s, 45 ℃退火 40 s, 72 ℃ 延伸 40 s, 40 个循环
95 ℃ 30 s, 95 ℃ 30 s, 45 ℃ 40 s, 72 ℃ 40 s, 40 cycles
1) 在 nirS4F引物的 5‘端加 1个 GC夹 A GC clamp (5’-CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG-3’) was attached to the 5’ end
of primers nirS4F

1.4 数据分析
采用 Quantity One(Bio-Red)软件对 DGGE图谱中
DNA 条带的位置和亮度进行数字化, 利用 CANOCO
4.0(Microcomputer Power, Ithaca, 美国)软件根据不
同处理 DGGE结果的条带亮度和位置的数字化数值
对微生物群落结构组成进行主成分分析 (principle
components analysis, PCA) [13−14]。利用 SPSS 13.0软
件进行数据方差分析。
2 结果与分析
2.1 水稻产量
图 1 显示了施用氮肥对水稻的影响。施用氮肥
可显著(P<0.05)提高水稻产量, 与不施肥对照相比


图 1 不同处理的水稻产量
Fig. 1 Yields of rice under different treatments
CK: 对照处理 Control treatment; N: 施氮处理[150 kg(N)·hm−2]
N treatment.
10 中国生态农业学报 2012 第 20卷


可使水稻增产 44%。表明在该试验稻田中氮肥是决
定水稻产量的重要因素。
2.2 稻田反硝化细菌群落结构
利用反硝化细菌 nirS基因特异引物对稻田土壤
反硝化细菌群落结构进行 PCR-DGGE 分析, 如图 2
所示。由 DGGE 图谱可见, 无论在稻田根层土还是
表土中都存在着丰富的反硝化细菌基因资源。各样
品均呈现出较多的 DGGE 条带, 在根层土或表土中
不同样品的 DGGE 条带数量无明显差异, 但与根层
土(图 2a)比较表土(图 2b)的DGGE条带数量多一些。
图 3显示了利用 CANOCO 4.0生态学软件, 基
于 DGGE 图谱中 DNA 条带的位置和亮度的数字化
数值进行的稻田根层土和表土中反硝化细菌群落结
构的主成分分析(PCA)。由图 3可知, 无论是在根层
土还是表土中, 水稻各生育期内氮肥处理和 CK 处
理的反硝化细菌群落结构在 PCA图中的分布均没有
明显差异。此外, 稻田根层土或表土中反硝化细菌
群落结构在水稻分蘖期、齐穗期和成熟期间也没有
分布差异。表明施用氮肥没有改变稻田 nirS基因型
反硝化细菌群落结构, 且其群落结构在水稻生长过
程中相对稳定。
2.3 稻田反硝化细菌群落丰度
利用 nirS 基因的重组质粒作为标准 DNA 建立
了绝对荧光定量 PCR的标准曲线(图 4)。其中, 标准
曲线的 R2为 0.99, 斜率为−3.36, 线性范围也达到 6
个数量级, 为 4.38×104~4.38×109 cells·μL−1。
依据标准曲线用荧光定量 PCR检测到不同处理
稻田反硝化细菌 nirS基因拷贝数在 1.43×107∼3.29×107
copies·g−1(干土)之间。稻田根层土中(图 5a), 氮肥处
理的反硝化细菌 nirS基因拷贝数在水稻各个生育期
内均显著(P<0.05)高于 CK 处理; 氮肥处理或 CK 处
理的反硝化细菌 nirS 基因拷贝数在水稻生长中前



图 2 施氮与不施氮处理下水稻不同生长时期稻田根层土(a)和表土(b)反硝化细菌群落结构组成的 DGGE图谱
Fig. 2 DGGE images of community structures of denitrifying bacteria in root zone soil (a) and surface soil (b) of the paddy field at
different rice growth stages under nitrogen and non nitrogen application
条带 1、7、13和 2、8、14分别为分蘖期施氮处理和对照，3、9、15和 4、10、16分别为齐穗期施氮处理和对照，5、11、17和 6、12、
18分别为成熟期施氮处理和对照。Band 1, 7, 13 and 2, 8, 14 are three bands of N application and CK treatments, respectively, at tillering stage; band
3, 9, 15 and 4, 10, 16 are three bands of N application and CK treatments, respectively, at heading stage; band 5, 11, 17 and 6, 12, 18 are three bands of
N application and CK treatments, respectively, at maturate stage.



图 3 施氮与不施氮处理下水稻不同生长时期稻田根层土(a)和表土(b)反硝化细菌群落结构组成的 PCA分析
Fig. 3 PCA analysis of community structures of denitrifying bacteria in root zone soil (a) and surface soil (b) of the paddy field at
different rice growth stages under nitrogen and non nitrogen application

第 1期 宋亚娜等: 氮肥对稻田土壤反硝化细菌群落结构和丰度的影响 11




图 4 nirS 基因绝对荧光定量 PCR标准曲线
Fig. 4 Standard curve of real-time PCR of nirS gene
期, 即分蘖期和齐穗期间无显著差异, 但在水稻成
熟期都显著降低(P<0.05)。稻田表土中(图 5b), 水稻
生长过程中氮肥处理的反硝化细菌 nirS基因拷贝数
也始终显著(P<0.05)高于 CK 处理, 但氮肥处理和
CK 处理的反硝化细菌 nirS 基因拷贝数在水稻生长
过程中都没有明显变化。
此外, 在水稻分蘖期和齐穗期, CK 或氮肥处理
的反硝化细菌 nirS基因拷贝数在稻田表土和根层土
间无显著差异; 但在水稻成熟期, 2个处理的表土反
硝化细菌 nirS 基因拷贝数都显著(P<0.05)高于根层
土, CK和氮肥处理的表土反硝化细菌 nirS基因拷贝
数分别是其对应根层土的 1.39倍和 1.58倍。



图 5 施氮与不施氮处理下水稻不同生长时期稻田根层土(a)和表土(b)反硝化细菌的丰度
Fig. 5 Abundance of denitrifying bacteria in root zone soil (a) and surface soil (b) of the paddy field at different rice growth stages
under nitrogen and non nitrogen application
*表示不同处理间差异显著性检验结果为 P<0.05 * means significant difference among different treatments at 0.05 level.

3 讨论
水稻土及其稻田系统是环境友好、生态健康、
可持续利用的人工湿地生态系统[15]。稻田土壤氮素
的累积、迁移、流失等生物地球化学循环过程是稻
田生态系统可持续发展的重要保障之一。稻田土壤
的硝化和反硝化作用直接影响到氮肥利用率、NO3−
淋失、地下水污染和温室气体 N2O排放等农学和环
境问题。通常认为稻田土壤在淹水时以反硝化为主,
而在不淹水时以硝化作用为主。
氮肥供应是决定水稻产量的主要因素[16], 但氮
肥的过量投入会加剧土壤硝酸盐淋失和温室气体排
放, 对土壤、地下水和大气等环境造成污染。反硝
化细菌在稻田氮素循环中起着重要的作用, 稻田反
硝化细菌群落多样性及其功能的研究可为氮素循环
中的反硝化作用提供依据, 将有助于稻田氮肥利用
率提高和温室气体减排的研究[10]。本研究选用了反
硝化过程中关键酶亚硝酸还原酶的 nirS 基因为研
究对象 , 分析了田间定位试验中氮肥施用对稻田
土壤反硝化细菌群落结构和丰度的影响。研究结果
表明, 水稻施用氮肥具有显著增产效果, 同时氮肥
能够显著促进稻田土壤反硝化细菌丰度提高 , 在
水稻生长过程中施用氮肥的稻田表土(0∼5 cm)和根
层土 (10∼20 cm)中的 nirS 基因拷贝数都显著
(P<0.05)高于不施肥稻田; 但施用氮肥对稻田土壤
的反硝化细菌群落结构没有明显影响 , 无论是在
表土还是根层土中, 亚硝酸还原酶 nirS 基因群落
结构在施用氮肥和不施肥的稻田间没有显著差异。
说明稻田土壤反硝化细菌丰度对氮肥的响应强烈 ,
但其群落结构较为稳定。但值得注意的是, 本研究
仅是肥料田间定位试验第 2年的结果, 随着定位试
验年限增加 , 长期施用氮肥也有可能改变反硝化
细菌的群落结构。此外, 本试验还发现稻田根层土
中的反硝化细菌 nirS 基因丰度在水稻成熟期时具
有显著降低的现象。由于在水稻生长后期根系较为
发达 , 根系 O2 的分泌量有可能增加 , 从而可能抑
12 中国生态农业学报 2012 第 20卷


制反硝化细菌的生长。
反硝化作用是由基因和环境因素共同调节的复
杂生态过程[17]。自然界中的反硝化细菌群落结构会
受到多种环境因素的影响, 如 pH、O2含量、含水量、
养分状况和有机质含量等, 而且具有不同功能基因
型(nirS 和 nirK)的反硝化细菌群落对环境因素的响
应程度存在较大差异。长期研究都认为具有 nirS基
因的反硝化细菌主要存在于海洋中 [2,18−19], 本研究
证实在稻田土壤中也存在丰富的 nirS 型反硝化细菌,
其群落丰度可达到 107 copies·g−1(干土)。本研究中短
期氮肥施用虽然没有显著改变 nirS型反硝化细菌群
落结构组成, 但能够促进反硝化细菌 nirS 基因丰度
增加, 可见具有亚硝酸还原酶 nirS 基因的反硝化细
菌在稻田土壤的反硝化作用及氮素循环中具有一定
作用。此外, 也有研究发现长期施用氮肥能够显著
改变亚硝酸还原酶为 nirK基因型的反硝化细菌群落
结构[10]。因此, 仍需进一步开展稻田土壤反硝化细
菌 nirS和 nirK基因功能的研究, 为深入揭示反硝化
细菌在稻田氮素循环中的作用提供理论依据。
参考文献
[1] Zumft W G. Cell biology and molecular basis of denitrifica-
tion[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1997,
61(4): 533−616
[2] Braker G, Zhou J Z, Wu L Y, et al. Nitrite reductase genes
(nirK and nirS) as functional markers to investigate diversity
of denitrifying bacteria in Pacific northwest marine sediment
communities[J]. Applied and Environmental Microbiology,
2000, 66(5): 2096−2104
[3] 张晶 , 林先贵 , 尹睿 . 参与土壤氮素循环的微生物功能基
因多样性研究进展 [J]. 中国生态农业学报 , 2009, 17(5):
1029−1034
[4] Bremer C, Braker G, Matthies D, et al. Impact of plant
functional group, plant species, and sampling time on the
composition of nirK-type denitrifier communities in soil[J].
Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(21):
6876−6884
[5] Cavigelli M A, Robertson G P. The functional significance of
denitrifier community composition in a terrestrial ecosystem[J].
Ecology, 2000, 81(5): 1402−1414
[6] Mergel A, Kloos K, Bothe H. Seasonal fluctuations in the
population of denitrifying and N2-fixing bacteria in an acid
soil of a Norway spruce forest[J]. Plant and Soil, 2001,
230(1): 145−160
[7] Wolsing M, Priemé A. Observation of high seasonal variation
in community structure of denitrifying bacteria in arable soil
receiving artificial fertilizer and cattle manure by determining
T-RFLP of nir gene fragments[J]. FEMS Microbiology
Ecology, 2004, 48(2): 261−271
[8] Mergel A, Schmitz O, Mallmann T, et al. Relative abundance
of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in layers of a
forest soil[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 36(1):
33−42
[9] 莫旭华, 麻威, 史荣久, 等. 氮肥对小麦田土壤 nirS型反硝
化细菌多样性的影响 [J]. 微生物学报 , 2009, 49(9):
1203−1208
[10] 罗希茜 , 陈哲 , 胡荣桂 , 等 . 长期施用氮肥对水稻土亚硝
酸还原酶基因多样性的影响 [J]. 环境科学 , 2010, 31(2):
423−430
[11] 刘杏认, 董云社, 齐玉春. 土壤 N2O 排放研究进展[J]. 地
理科学进展, 2005, 24(6): 50−58
[12] Braker G, Fesefeldt A, Witzel K P. Development of PCR
primer systems for amplification of nitrite reductase genes
(nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environ-
mental samples[J]. Applied and Environmental Microbiology,
1998, 64(10): 3769−3775
[13] Alvey S, Yang C H, Buerkert A, et al. Cereal/legume rotation
effects on rhizosphere bacterial community structure in West
African soils[J]. Biology and Fertility of Soils, 2003, 37(2):
73−82
[14] Marschner P, Neumann G, Kania A, et al. Spatial and tempo-
ral dynamics of the microbial community structure in the
rhizosphere of cluster roots of white lupin (Lupinus albus
L.)[J]. Plant and Soil, 2002, 246(2): 167−174
[15] 曹志洪 , 林先贵 , 杨林张 , 胡正义 , 董元华 , 尹睿 . 论“稻
田圈”在保护城乡生态环境中的功能 II. 稻田土壤氮养分的
累积、迁移及其生态环境意义 [J]。土壤学报, 2006, 43(2):
256−260
[16] Cassman K G, Kropf M J, Gaunt J, et al. Nitrogen use effi-
ciency of rice reconsidered: what are the key constraints [J]?
Plant and Soil, 1993, 155/156: 359−362
[17] Jones C M. Denitrification: from genes to ecosystems [D].
Uppsala: Swedish University of Agricultural Sciences, 2010
[18] Throbäck I N, Enwall K, Jarvis A, et al. Reassessing PCR
primers targeting nirS, nirK and nosZ genes for community
surveys of denitrifying bacteria with DGGE [J]. FEMS Mi-
crobiology Ecology, 2004, 49: 401−417
[19] Holtan-Hartwig L, Dörsch P, Bakken L R. Comparison of
denitrifying communities in organic soils: kinetics of 3NO
−
and N2O reduction [J]. Soil Biology and Biochemistry, 2000,
32: 833−843