全 文 ：植　物　学　报　 1995, 37( 2): 97— 102
Acta Botanica S inica
PCR产物的 RFLP分析在黄芪亚族 (豆科 )
系统学研究中的应用初探
丁士友
(中国科学院昆明植物研究所 ,昆明 650204)
顾红雅　瞿礼嘉　陈章良
(北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室 ,北京 100871)
摘　　要
用聚合酶链式反应 ( PCR)将豆科黄芪亚族 7属 9种及甘草亚族 1属 1种植物叶绿体基
因组中 ndh F和 psb A基因中一段约 3. 1 kb的 DN A扩增出来 , 并摸索出一最佳的 PCR条
件 ,使得此条带得以特异性扩增 , 可直接用于限制性内切酶水解。 通过对此扩增片段的限制
性片段长度多态性 ( RFLP)的初步分析 ,认为利用 PCR扩增出的 DN A进行 RFLP分析来探
讨植物的系统进化问题在中国现行条件下大有潜力 ,其方法简单易行 ,结果可信。
关键词　黄芪亚族 ;聚合酶链式反应 ;限制性片段长度多态性⒇
A PRELIMINARY STUDY ON THE USE OF RFLP ANALYSIS
OF THE PCR AMPLIFIED PRODUCTS IN THE SYS-
TEMATIC INVESTIGATION OF THE SUBTRIBE
ASTRAGALINAE ( FABACEAE)
Ding Shi-you
(Kunmin g Inst itute of Botany, Academia S inica , Kunming 650204)
Gu Hong-ya, Qu Li-jia and Chen Zhang-liang
(N ational Laborator y of Protein Engineering and Plan t Genet ic Eng ineer ing , Peking University , Bei jing 100871)
Abstract
The analysis of va ria tion at the mo lecular lev el ha s been proven ex t remely useful in
the reconst ruction o f plant phylog enetic relationships. A DN A fragment of 3100-base
⒇ 收稿日期: 1994-01-14　接受日期: 1994-04-09
　　承蒙吴征镒教授指导 ,特致谢忱。
　* 本项目由北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室资助。
pairs ( bp) in the chlo roplast genes ndh F and psbA has been amplified f rom 9 species of
7 genera in the subtribe Astrag alinae and 1 species in the subtribe Glycy rrhizinae. A
proper procedure for specifically PCR-amplifing the 3. 1 kb fragment was presented. By
this procedure, the PCR products could be dig ested direct ly af ter amplification. The re-
st riction f ragment length po lymo rphism ( RFLP) analysis of the PCR-ampli fied products
indicated tha t i t had potential systematic signi ficances in the phylo genetic studies o f the
subtribe Astrag alinae. This approach could also reduce time, expense and the amount of
DN A required, and furthermore, obtain reliable resul ts.
Key words　 Astrag alinae; Polymerase chain reaction; Rest riction frugment leng th
polymo rphism
植物分子系统学 ( mo lecular systema tics)的主要内容就是在分子水平上 (如蛋白质、
核酸 )研究植物的系统与进化。近年来 ,这一领域在国外发展非常迅速 ,并已取得了许多引
人注目的进展 [ 1, 2]。黄芪亚族 ( Ast rag alineae)隶属于豆科山羊豆族 ( Galegeae) ,对于本亚
族分子系统学 ,特别是 DNA水平研究的文献甚少。最早的报道是 Lav in等对豆科 136种
植物叶绿体 DNA ( chloroplast DN A,简称 cpDN A) 进行的限制性片段长度多态性
( RFLP)分析 ,发现在蝶形花亚科中 ,一些温带草本族 cpDN A没有反向重复序列 ( inver t-
ed repeated sequence, 简称 IR) , 与豆科大多数类群不同。同时 ,在这些温带草本族中 ,叶
枕退化或缺 ,染色体基数为 7或 8,从而认为它们之间有着较近的亲缘关系 [3 ] ,这与 Pol-
hill从形态地理学上所得的推测相符 [ 4]。另外 ,热带 Milletieae中 Wisteria的 cpDN A亦缺
少 IR,其染色体基数为 8,据此推测其与 Galegeae可能存在关联 [1 ]。 Liston利用聚合酶链
式反应技术 ( polymerase chain reaction,简称 PCR)将黄芪属 14个近缘种叶绿体基因组
中的一段约 4. 1 kb的片段扩增出来 ,并用 23种不同的限制性内切酶酶解这些 PCR产
物 ,发现了 37个突变位点和一个 10 bp的长度变异 ,并据此对这些近缘种进行了分支分
析 [5 ]。在黄芪亚族的系统学研究中 ,前人对种级水平上的分类学研究已做了许多深入而细
致的工作 [ 4]。但对属级水平的系统关系仍存在着许多争议 ,这同样是豆科系统学的难题之
一。 cpDN A是一双链环状 DNA分子 ,在绿色植物中其大小和碱基的排列均很保守 ,除了
很少区域属“多变区”外 ,大部分区域都相当稳定 ,这样的材料较适用于进行属级以上分类
群的系统学研究 [6 ]。由于提纯 cpDN A的步骤繁琐、费时 ,本文试图利用 PCR技术扩增叶
绿体基因组的特异片段 ,通过 RFLP分析手段 ,探讨其在黄芪亚族系统学上不同等级水
平上的应用价值。
1　材料 和 方法
1. 1　植物材料
见表 1。
1. 2　主要仪器及试剂
1. 2. 1　 PCR仪　中国科学院遗传学研究所产品 PCR-90。
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表 1　植物材料
Table 1　 Plant ma terials
种　　名 采　集　地
Species Locali ty
Alhag i p seudalh agi Desv. 宁夏 Ningxia
Calophaca sinica Rehd. 山西 Shanxi
Caragana bicolar Komar. 云南 Yunnan
C. f ranchet iana Komar. 云南 Yunnan
C. sin ica Rehd. 陕西 Shaanxi
Glycyrrhiza uralensis Fisch . 宁夏 Ningxia
Gueldenstaedt ia verna ( Geo rgi ) Bori ss 北京 Bei jing
Hal imod endron holod end ron ( Pall. )
Vass.
甘肃 Gansu
Spong ioca rpel la n ubigena ( D. Don )
Yakovl.
云南 Yunnan
Tibet ia coelestis ( Diel s) P. C. Li 云南 Yunnan
1. 2. 2　 CTAB缓冲液 ( 2× )　 2% (W /V )
CTAB ( hexadecylt rimethy lammonium bro-
mide, Sigma H5882) , 1. 4 mo l /L NaCl, 0.
02 mo l /L EDT A, 0. 1M /L Tris-HCl pH 8.
0,使用前加入 0. 2% ( V /V )巯基乙醇。
1. 2. 3　寡聚核苷酸引物 ( primer)　引物
1: 5 ’ -TCCCTCTTCATG-
TA TGGT TACC-3’ ( ndhF-731,根据蚕豆
cpDN A 序 列 [7 ] ) ; 引 物 2: 5’ -GACTG-
CAATT T TAGAGAG-ACGCG-3’ ( psb A-
3,根据烟草 cpDN A序列 [8 ] ) ,由北京大学
生命中心 DNA合成仪 ( ABI)合成。
1. 2. 4　 Taq DNA聚合酶及缓冲液　北京农业大学产品。
1. 2. 5　限制性内切酶　 New Eng land Bio lab公司产品。
1. 3　实验方法
1. 3. 1　种子萌发　将种子在水中浸泡 1 d(一些沙漠地区生长的植物种子先用开水泡 3
次 ) ,待种子吸胀后 ,将其移入放有潮湿纱布的培养皿中 ,室温光照下放置数天 ,待长出第
1片真叶后 ,剪下子叶及幼叶待用。
1. 3. 2　总 DNA的提取 (CTAB法　依据 Doy le等的方法 [9 ] ,作了部分改动 )。将子叶及幼
叶 (约 50 mg )在液氮中研磨至细粉状 ,移入装有 500μL 60℃预热的 CT AB缓冲液的微量
离心管中 ,置 60℃水浴保温 45 min,加入等体积氯仿∶异戊醇 ( 24∶ 1) ,轻轻倒置几次混
匀 , 5000 r /min离心 5 min, 小心取水相 ,移入一新微量离心管 , 24∶ 1再抽提 1次 ,取水
相加 2 /3体积预冷异戊醇 ,置 - 20℃放置至少 30 min,在 10000 r /min, 4℃条件下离心 2
min,弃上清液 ,沉淀重悬于 100μL 1× TE中 ,加 1 /10体积 3 mo l /L Na Ac和 2— 2. 5倍
预冷 100%乙醇 ,置 - 20℃ 20 min, 10000 r /min, 4℃离心 2 min,弃上清液 ,加 1 mL 70%
乙醇洗涤 1— 2次 ,真空干燥 ,视 DNA量多少 ,加入 50— 200μL 1× TE重悬 DNA,置 4℃
备用。
1. 3. 3　聚合酶链式反应 ( PCR)　 100μL反应体积中包括: 10 mmo l /L Tris-HCl( pH 8.
3) ; 50 mmol /L KCl; 1. 5 mmo l /L M gCl2 ; 0. 01%明胶 ; d ATP、 d TTP、 dCTP、 dGTP各 0. 1
mmo l /L;引物 1和 2各 50 pmo l; Taq DN A聚合酶约 2. 5单位 ;作为模板的总 DNA约 0.
5μg。 先在无模板的反应体系中加入矿物油 50μL置 70℃ , 2— 5 min,然后加入模板 (总
DNA) , 94℃变性 1 min,接以 94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 3 min,循环 5— 7次 ,然后将退
火温度降为 50℃再循环 25次 ,末次循环后置 72℃延伸 5— 10 min。取出离心管 ,除去矿物
油 ,取 5μL反应液电泳检查。
1. 3. 4　 PCR产物的回收　①琼脂糖凝胶电泳回收法 (参考分子克隆手册 [10 ] ): PCR产物
若有几个条带时 ,回收约 3. 1 kb的片段 ,具体步骤如下:配制 0. 8%琼脂糖凝胶 ,溴化乙锭
( EB)在配胶时加入 ,将 PCR反应液全部加入加样孔中 , 5 V /cm电泳 2 h,用手提式长波
紫外灯观察 ,小心切下含有约 3. 1 kb片段的琼脂糖胶 ,放入微量离心管中 ,加 1× TE淹
992期　　　丁士友等: PCR产物的 RFLP分析在黄芪亚族 (豆科 )系统学研究中的应用初探
住琼脂糖块 ,加等体积用 0. 1 mol /L Tris-HCl平衡至 pH 8. 0的酚 ,混匀 ,置液氮中冻 30
min,取出振荡至全溶 , 10000 r /min离心 6 min,取上清液 ,加等体积酚∶氯仿 ( 1∶ 1)和氯
仿∶异戊醇 ( 24∶ 1)各抽提 1次 ,水相移入另一离心管加 1 /10体积 3 mol /L NaAc和 2—
2. 5倍体积预冷 100%的乙醇 ,混匀 ,置 - 20℃ 20 min, 10000 r /min, 4℃ ,离心 10— 15
min,弃上清液 , 70%乙醇洗两次 ,真空干燥 ,重悬于 10— 20μL水中 ,置- 20℃冰箱保存。
②直接回收法:取 1 /10体积 PCR反应液进行电泳检查 ,若仅有 1条约 3. 1 kb的条带时 ,
将此 PCR反应液加等体积氯仿∶异戊醇 ( 24∶ 1)抽提 1次 ,取水相加 1 /10体积 3 mo l /L
NaAc和 2— 2. 5倍体积的冰冷乙醇 ,置 - 20℃ , 30 min后 , 10000 r /min, 4℃离心 15 min,
弃上清液 , 70%乙醇洗两次 ,真空干燥 ,重悬于 10μL水中 ,置- 20℃冰箱保存。
1. 3. 5　酶解　取 5μL回收的 DNA悬浮液 ,加 2μL相应的限制性内切酶缓冲液 ( 10× ) ,
10单位限制性内切酶 ,必要时加 2μL BSA( 10× ) ,加水至总体积 20μL,在适当温度下
(依不同的酶而定 )保温 2 h, 1%— 1. 4%琼脂糖凝胶电泳 , 电压 5 V /cm, 2 h,紫外灯下观
察 ,照像。
2　实　验　结　果
2. 1　 CTAB法提取总 DNA
利用 CT AB法从微量的植物材料中提取到较高质量、大小约 50 kb的总 DNA(包括
核 DNA和质体 DNA) ,与λ-DNA大小相似 (图 1, C) , PCR的结果也表明此法提取的总
DNA可以满意地扩增出 cpDN A中的特异片段 (图 1, D— J)。
2. 2　 PCR扩增
所用的两段寡聚核苷酸引物之间的 DNA为 cpDN A基因组的 ndh F和 psbA基因中
的一段。据 Herdenberger等的研究 ,这段 DNA在蚕豆中为 3. 1 kb左右 [7 ] ,用我们设计的
引物进行 PCR扩增 ,在黄芪亚族 7属 9种及甘草亚族 1属 1种的总 DNA中都能稳定、特
异地扩增到一段约 3. 1 kb的 DNA片段 ,种间大小差异不大 (图 1, D— J)。我们认为此片
段应是包括 ndh F和 psbA基因的 DNA片段。
图 1　总 DNA和 PCR产物
Fig. 1　 Total DN A and PCR products
A.λ-HindⅢ /Eco R I Ma rker; B.λDN A; C. To ta l
DN A Gueldentaedtia verna; D— J. PCR products.
D. Alhagi pseudalhagi; E.Calophaca sinica;
F. Caragana bicolar; G. Gueldenstaedtia verna;
H. Halimodend ron holodendron; I. Spongiocarpella
nubigena; J. Glycy rrhiza uralensis
图 2　 PCR产物的 RsaI酶解
Fig. 2　 RsaⅠ dig est of the PCR-amplified
cpDN A fra gment
A. λ-HindⅢ /Eco RI ma rker; B. Alhagi
pseudalhagi; C. Caragana sinica; D. C . bicolar;
E. C . f ranchetiana; F. Halimodendron holodendron;
G. Spongiocarpella nubigena; H. λ-HindⅢ marke r
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2. 3　 PCR产物的回收
用琼脂糖凝胶电泳回收法得到的 DNA片段进行限制性内切酶酶解时 ,发现一些片
段被部分酶解 ,这可能是由于回收过程中一些酶的抑制物没能去除干净。这样的结果将给
以后的分析工作带来许多麻烦 ,另外我们也尝试了其他的回收方法 ,如 DEAE-纤维素膜
电泳回收法、 低熔点琼脂糖回收法等 ,但这些方法都存在这样或那样的缺陷 ,或步骤复
杂、回收率低 ,或酶切结果不好。我们用直接回收到的 PCR扩增片段进行酶解 , 得到了很
好的结果。
2. 4　酶解
从图 2— 4我们可以看出 ,在同一属不同种间 , 大多具相同的酶切位点 ,突变较少 ,而
在同一亚族不同属间 ,存在较多的不同位点突变 ,亚族间的植物则具有更多的位点差异 ,
这些酶切位点的异同和多少与用经典方法所得的这些类群间的亲缘关系基本一致 (论文
在准备中 )。
图 3　 PCR产物的 Dra I酶解
Fig. 3　 Dra Ⅰ dig est of the PCR-amplified
cpDN A fragment
A. λ-HindⅢ /Eco RI marker; B. Alhagi
pseudalhagi; C. Caragana sinica; D. C. bicolar;
E. C . franchetiana; F. Halimodendron
holodendron; G. Spongiocarpella nubigena;
H. λ-HindⅢ marker
图 4　 PCR产物的 HaeⅢ酶解
Fig. 4　 HaeⅢ dig est of the PCR-amplified
cpDN A fra gment
A. λ-HindⅢ /Eco RI ma rker; B. Alhagi
pseudalhagi; C. Caragana sinica; D. C. bicolar;
E. C. f ranchetiana; F. Halimodendron
holodendron; G. Spongiocarpella nubigena
3　讨　　论
聚合酶链式反应是利用 DNA聚合酶依赖于 DNA模板的特性 ,模仿体内的复制过
程 ,在附加的一对引物之间诱发的聚合酶反应。这种由 Mullis发明的方法由于能简捷、快
速、高效地将 DNA特异片段大量扩增 [11 ] ,从而被认为是分子生物学领域的一项重大突
破 ,短短几年发展迅速并日臻完善。 这项技术应用于植物系统学研究尚处于尝试阶段 ,但
其却存在着巨大潜力。 在此之前 ,植物分子系统学对 cpDN A的研究主要有下述两种方
法:第一 ,整个 cpDN A基因组的 RFLP分析 , 或用探针对某一特定片段进行索氏杂交 ,分
析其 RFLP式样 [ 6]。第二 ,单个基因或其片段的全序列测定。从本文结果来看 ,与这些方法
相比较 , PCR技术应用于 RFLP分析至少有下述优点: ( 1)不需提纯 cpDN A。 ( 2)毋需使
用同位素或其它标记物 ,不受同位素半衰期的限制 ,并减少实验室的污染。 ( 3)省去了繁
杂的基因克隆步骤 ,节约大量时间 ;不需经过测序 ,却能得到相似的结果 ,如 Liston的
1012期　　　丁士友等: PCR产物的 RFLP分析在黄芪亚族 (豆科 )系统学研究中的应用初探
RFLP分析可以检测出 10 bp的长度变异。 ( 4)需要的植物材料很少 ,从少于 50 mg的植
物材料中提取的总 DNA即可满足 PCR的需要量 ;经过 20— 25个循环 ;理论上可以将靶
序列扩增约 106倍 ,即可以检测出在总 DNA中存在 1 /1013量的单拷贝靶序列。
在 PCR程序设计上 ,我们采用了 Erlich等的“热启动 ( ho t star t)”法 [12 ] ,即在加模板
DNA之前 ,让反应液加热至 70℃ , 这样更好地保证其扩增的特异性。在变性、退火、延伸
这 3个温度中 ,退火的温度至关重要 ,不同的植物的 PCR要求不同 ,过高则扩增效率低 ,
过低则特异性不好 , 我们设计了 40℃、 45℃、 50℃、 55℃、 60℃等系列比较温度 ,发现在
55℃时效果最佳。另外 ,为了增加其扩增效率 ,我们严格控制开始几轮循环的退火温度于
55℃ ,然后将其降至 50℃ ,因为开始的 PCR产物将成为以后扩增的模板 ,这样在不影响
其特异性的前提下 ,扩增效率大为提高。
由于 Taq DN A聚合酶缺乏校正功能 ,在一个 30轮循环的 PCR反应中 ,其核苷酸掺
入错误率可达 0. 25% [13 ]。为避免这种随机性的掺入错误而造成酶切位点的可能变化 ,我们
采用多次反应的产物混合在一起回收用于酶切。
本项目的研究仍在进行之中 ,从目前的结果我们可初见端倪 ,可以预测用 PCR扩增
cpDN A的某些片段 ,分析其 RFLP的方法在本亚族的系统学研究上存在着极大的潜力。
参 考 文 献
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