全 文 ：84　
纪淑娟 ,刘艳平 ,白　冰 ,蒋东华 ,张　旋 ,那其朔
(沈阳农业大学食品学院 ,辽宁沈阳 110161)
摘　要:采用比色法研究不同种类豆科植物于不同发育阶段 、不同部位乙酰胆碱酯酶(AChE)活性 ,并测定其总酯酶活
性 、蛋白质含量 、水分含量 ,旨在为农药残留快速检测提供配套的新酶原 。结果表明 ,在不同种类的豆科植物中均检测
到乙酰胆碱酯酶活性 ,但不同种类豆科植物存在差异 ,干种子期 、幼芽期及幼苗期各部位的乙酰胆碱酯酶活性存在差
异 ,以每克干物质中乙酰胆碱酯酶酶活计 ,干种子期猪腰豆(WhitfordiodendronfilipesDunn)中乙酰胆碱酯酶酶活性最
高 ,为 10.28U/g干重 。
关键词:豆科植物 ,发育阶段 ,乙酰胆碱酯酶 ,活性 ,有机磷农药 ,酶原
Acetylcholinesteraseactivityforleguminousplant
atdiferentdevelopmentalstagesanddiferentparts
JIShu-juan, LIUYan-ping, BAIBing, JIANGDong-hua, ZHANGXuan, NAQi-shuo
(ColegeofFoodScience, ShenyangAgricultureUniversity, Shenyang110161 , China)
Abstract:Inordertodevelopnewsourceofenzymeutilizedforrapiddetectionofpesticideresidueinagricultural
product, theactivityofacetylcholinesterase(AChE)indiferentkindsofleguminousplantsatdifferentpartsand
differentdevelopmentstagesweredetectedbythecolorimetrymethod.Thetotalesteraseactivity, thecontentof
proteinandwaterweretestedsimultaneously.ResultsshowedthatAChEactivitiesweredetectableinvarious
leguminousplants.Thedifferencesareevidentamongdifferentkindsofplant, duringdiferentdevelopmentstages
atdiferentparts.TheactivityofAChEintheseedofWhitfordiodendronfilipesDunnwasthehighest, whichwas
10.28Upergramdryweight.
Keywords:leguminousplant;developmentstage;acetylcholinesterase;activity;pesticideresidue;zymogen
中图分类号:TS255.1　　　　文献标识码:A　　　　文 章 编 号:1002-0306(2010)04-0084-03
收稿日期:2009-09-22
作者简介:纪淑娟(1960-),女 ,博士 ,教授 , 主要从事食品质量控制方
向的教学与科研工作。
基金项目:辽宁省自然科学基金项目(20082125)。
　　有机磷农药的快速检测一直是食品安全领域的
研究热点。酶抑制法快速检测农药残留技术在检测
速度 、成本 、操作繁简程度等方面都比传统的仪器分
析方法具有明显的优势 ,但其检测的灵敏度和可靠
性与使用的酶有密切关系 。国内外酶抑制法检测农
药残留主要用动物乙酰胆碱酯酶(AChE),其灵敏度
高 ,但取材不便 ,价格昂贵 [ 1] 。 20世纪 80年代以来 ,
人们开始尝试用来源丰富 、取材和制备都十分方便
的植物酶源替代动物酶源 ,迄今从植物中筛选用于
农药残留检测的酶原均为酯酶 ,其灵敏度不高 ,检测
效果不好。植物 AChE作为酶界发现的新一族 [ 2] ,在
玉米 、大翼豆等植物中已检测出其活性 [ 3] ,最近研究
发现 ,类似于电鳗 AChE,植物 AChE可以水解硫代乙
酰胆碱(或乙酰胆碱)和硫代丙酰胆碱 (或丙酰胆
碱),其对乙酰胆碱的特异水解性是最强的 [ 4] ,但目
前对植物 AChE酶原的研究刚刚起步 。本实验研究
了 7种豆类植物于干种子期 、幼芽期 、幼苗期不同部
位的 AChE活性 ,旨在为农药残留快速检测提供配套
的新酶原 ,降低检测成本 ,更重要的意义在于解决植
物酶原在农药残留检测中灵敏度低的问题 。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
九粒宽菜豆 、宝研 1号豇豆 、8217黄豆 、猪腰豆
Dunn、辽引红小豆 1号 、辽绿豆 26、辽沈蚕豆　均购
自沈阳市种子市场 。
FA-004型电子天平　上海精科天平有限公司;
UV-7200分光光度计　北京普析有限公司;CT14RD
台式高速冷冻离心机　上海天美生化仪器设备工程有
限公司;数显恒温水浴锅　常州国华电器有限公司;
HY-2调速多用振荡器 　国华电器有限公司;
PB-10sartoriuspH计　赛多利斯科学仪器(北京)有
85　
限公司。
1.2　实验方法
1.2.1　干种子 、幼芽 、幼苗植物乙酰胆碱酯酶的提取
　取一定量干种子粉按 1∶5(w/v)加蒸馏水 ,振荡
3000r/min, 30min,放置过夜 , 4层纱布过滤 ,冷冻离
心 ,取上清液 。将培养 2、4、6d的黄化幼芽 、生长 21d
的黄化幼苗取不同部位 ,按 1∶5(w/v)加蒸馏水 ,加入
石英砂研磨 ,过滤 、离心取上清液 ,于 4℃保存备用 。
表 1　不同豆类在不同时期 、不同部位的 AChE活性
发育阶段 猪腰豆 菜豆 红小豆 绿豆 豇豆 黄豆 蚕豆
干种子 10.28±0.24a 9.56±0.3a 2.53±0.04a 1.79±0.14d 0.1±0.011i 2.01±0.02c 2.87±0.11a
2d胚 1.35±0.07f 1.82±0.03ef 2.52±0.16a 1.58±0.09e 1.69±0.1f 1.40±0.04e 1.17±0.12c
2d子叶 1.48±0.04ef 1.61±0.02f 2.16±0.17b 1.59±0.02e 2.04±0.15d 1.66±0.06d 1.05±0.06c
2d胚根 0.81±0.01h 1.0±0.01h 1.81±0.05c 1.72±0.03de 0.88±0.13e 0.82±0.03g 0.77±0.03d
4d胚芽 3.66±0.26b 1.80±0.12ef 0.54±0.02e 0.53±0.04h 8.69±0.05b 0.5±0.08i 1.07±0.07c
4d胚轴 1.29±0.07f 1.32±0.06g 1.38±0.09d 2.0±0.23c 1.75±0.06ef 0.13±0.03j 2.71±0.12b
4d胚根 2.19±0.12d 4.64±0.11b 2.3±0.3b 4.05±0.07a 4.18±0.13c 0k 0f
6d胚芽 1.65±0.09e 2.74±0.09d 0.59±0.11e 0.26±0.06i 4.06±0.03c 0.72±0.04h 0.75±0.07d
6d胚轴 2.24±0.12d 1.92±0.03e 1.67±0.1c 1.1±0.1fg 1.41±0.03g 0.92±0.03f 0.46±0.04e
6d胚根 1.37±0.14f 1.75±0.08ef 0.65±0.06e 1.18±0.18f 1.88±0.09h 0k 0f
21d叶 1.03±0.08g 4.60±0.31b 0.76±0.12e 0.59±0.08h 9.03±0.09a 2.56±0.07b 1.07±0.05c
21d茎 2.94±0.1c 4.3±0.12c 0.23±0.04f 3.24±0.12b 0.83±0.04h 3.17±0.08a 0f
21d根 0.28±0.03i 1.89±0.03e 0.69±0.08e 0.96±0.08g 0.19±0.04i 0k 0f
注:每列数据后相同的字母表示数据间无显著性差异(p>0.05), 统计分析软件 DPS7.05,统计方法为单因素方差分析。
(下转第 89页)
1.2.2　总酯酶活性测定　参考李绍中等方法 [ 5]有改
进 。将粗酶液用缓冲液稀释 ,于 3mL稀释酶液中加
入 5μL16mmol/Lα-乙酸萘酯丙酮溶液 ,混合均匀 ,
在 40℃恒温水浴中保温 5min,加入 0.5mL0.8%固蓝
B(3.6%SDS)溶液 ,混合均匀 ,于 40℃恒温水浴保温
5min。以不加底物(α-乙酸萘酯)的反应液作空白 ,
在 595nm处读取以上反应液的吸光度。
1.2.3　AChE活性测定　参考兰平等方法 [ 6 ]略有改
进 。比色杯中依次加入下列试剂:0.4mL的粗酶提取
物 、2.6mL的磷酸缓冲液 (10mmol/L, pH7.5)、 50μL
75mmol/L碘化硫代乙酰胆碱 , 充分混匀后水浴
15min,加入终止剂 4% SDS100μL、100μL10mmol/L
DTNB(10mmol/LPBS, pH7.0),以不加底物的反应
液作空白 ,记录 412nm处吸光度。酶活用每克干物
质中的酶活力单位大小来计。
1.2.4　蛋白质含量测定　采用考马斯亮蓝-G250法。
1.2.5　实验统计方法　实验结果主要采用 Microsoft
Excel应用程序和 DPS7.05版数据处理系统进行数据
处理。
2　结果与分析
2.1　干种子期不同种类豆科植物中 AChE活性分析
取 7种豆类在干种子时期的酶提取液 ,经稀释
后按照 1.2.2, 1.2.3 , 1.2.4的方法进行测定 ,实验结果
用 DPS软件分析 ,结果见图 1。
在同样的检测条件下 ,溶液体系的吸光度越大 ,
酶活性越高 。从图 1可知 ,干种子时期 ,猪腰豆和菜
豆的 AChE活性明显高于其他豆类植物 ,绿豆中该酶
活性较低 ,活性最低的为豇豆 ,统计分析结果表明 ,
猪腰豆和菜豆 AChE活性无显著性差异;不同种类豆
中酯酶的活性也存在差异 ,其中黄豆中酯酶活性最
图 1　干种子期不同豆类的 AChE与酯酶活性及蛋白质含量
高 ,其次为菜豆 ,豇豆中酯酶活性也最低;从蛋白含
量的测定结果可以看出 , 黄豆和蚕豆的蛋白含量明
显高于其他豆类 ,猪腰豆 、菜豆蛋白含量相对较低。
综合分析不同种类豆中 AChE活性 、酯酶活性和蛋白
含量可以看出 ,猪腰豆 AChE活性高 ,而且其酯酶中
AChE所占比例较大 ,同时杂蛋白也较少 ,更利于分
离纯化处理 ,可以作为植物 AChE理想的酶原 。
2.2　干种子期及幼芽至幼苗期不同的种类不同部位
AChE活性比较
为避免光照对 AChE活性的影响及叶绿素的干
扰作用 ,本实验材料均经避光处理 ,测定发芽 2、4、6d
及生长 21d的幼苗在不同部位的 AChE活性 。
　　由表 1可知 ,在不同种类的豆科植物中均检测
到 AChE活性 ,但豆科植物从种子发芽到幼苗发育过
程中 , AChE活性因豆类种类 、发育阶段和幼苗部位
的差异而有所不同。干种子时期 ,猪腰豆和菜豆中
AChE活性较高 ,蚕豆次之 , 豇豆中 AChE活性最低
仅为 0.1±0.011U/g干重 , AChE活性排序为猪腰豆
>菜豆 >蚕豆 >红小豆 >黄豆 >绿豆 >豇豆 。幼芽
期发芽 2d时 ,子叶和胚中 AChE活性显著高于根中
的 AChE活性 ,其中红小豆在胚和子叶中具有较高的
AChE活性 ,达到了 2.5U/g干重以上;随发芽时间的
延长 ,除了红小豆 、黄豆 ,其他豆类 AChE总活性呈先
升后降的变化趋势 ,当发芽时间到达 4d时 AChE总
活性最高 ,说明此时期某些部位 AChE活性达到最
佳 ,其中 ,豇豆变化幅度最大 , 4d胚芽中 AChE活性
达到 8.69 ±0.05U/g干重 , 绿豆和菜豆在 4d根部
AChE活性也较高 , 分别为 4.05 ±0.07U/g干重和
4.64±0.11U/g干重 ,但其他种类的豆科植物中根部
89　
的 FB1连接在果糖上 。加热 D-葡萄糖至 65℃ 48h,
再与 FB1作用 [ 8 ] 。这两种方法降低伏马菌素 FB1毒
性的效果是相似的。 Castelo等 [ 9]研究发现通过挤压
膨化可以降低伏马菌素水平 ,并且如果在挤压膨化
的过程中加入适量的葡萄糖 ,则能够更为显著地降
低伏马菌素 FB1水平 ,去除率为 45.3%～ 71.0%,当挤
压膨化条件为最优时去除率最高能够达到 92.1%。
而加入果糖和蔗糖的效果不如葡萄糖 ,去除率分别
只有 29.5%～53.0%和 19.2%～39.0%。
利用挤压膨化法去除玉米中的伏马菌素 ,是一
种较好的方法 ,能够在去除伏马菌素的同时生产出
高附加值的膨化玉米休闲食品 ,非常适合于应用到
生产实际中。由于时间和条件的原因 ,在挤压膨化
过程中 ,影响伏马菌素降低的其他因素如螺旋转速
没有进行单因素实验 ,温度对伏马菌素的影响也有
待进一步的验证 。
3.2　氢氧化钙浸泡湿磨去除玉米中的伏马菌素
通过氢氧化钙浸泡湿磨法去除玉米中的伏马菌
素实验得知 ,氢氧化钙浸泡能够降低玉米中伏马菌
素的含量 ,但是氢氧化钙浓度对于去除伏马菌素 FB1
影响不大 ,而浸泡时间则对去除伏马菌素影响较大 ,
伏马菌素 FB1的浓度随着浸泡时间的延长而逐渐降
低 ,但当浸泡时间达到 16h后 ,伏马菌素 FB1 浓度的
降低趋势变缓。
虽然该方法在一定程度上能去除伏马菌素 ,容
易进行大规模的操作 ,能广泛应用于实际生产中 ,但
也有一定的不足:可能造成营养物质的少量丢失 ,并
且比较耗时。另外 ,该方法去除伏马菌素 FB1的条
件还需要进一步进行优化和工业化验证。
参考文献
[ 1] GelderblomW C, MarasasWF, JaskiewiczK, etal.Cancer
PromotingPotentialofDifferentStrainsofFusariummoniliforme
inA ShortTerm CancerInitiationPromotionAssay[ J] .
Carcinogenesis, 1988, 9(8):1405-1409.
[ 2] NelsonPE, DesjardinsAE, PlattnerRD.Fumonisins,
MycotoxinsProducedbyFusariumSpecies:Biology, Chemistry,
andSignificance[ J] .AnnualReviewofPhytopathology, 1993, 31:
233-252.
[ 3] Bowen.EnvironmentChemistryoftheElement[ M] .Boston:
AcademicPress, 1979:13-46.
[ 4] 王少康 , 孙挂菊 .伏马菌素污染情况及其毒性研究进展
[ J] .环境与职业医学 , 2003, 20(2):129-131.
[ 5] 许汉英 ,刘志研 ,于元祥 .伏马毒素的研究及其对玉米产
业的影响 [ J] .世界农业 , 2003(8):42-44.
[ 6] HanneRC, YuF, FunS, etal.DevelopmentofAPolyclonal
Antibody-basedSensitiveEnzymeLinkedImmunosorbentAssay
forFumonisinB4 [ J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,
2000, 48(5):1977-1984.
[ 7] LuZ, DantzerW R, HopmansEC, etal.Reactionwith
FructoseDetoxifiesFumonisinB1 whileStimulatingLiver-
AssociatedNaturalKillerCelActivityinRats[ J] .Journalof
AgriculturalandFoodChemistry, 1997, 45(3):803-809.
[ 8] 张 笑 ,侯红漫 ,刘阳 , 等 .食品中伏马菌素的污染及污染
控制 [ J] .食品研究与开发 , 2006, 27(3):127-130.
[ 9] CasteloM M, JacksonLS, HannaM A, etal.Lossof
FumonisinB1 inExtrudedandBakedCorn-basedFoodswith
Sugar[ J] .JournalofFoodScience, 2001, 66(3):416-421.
(上接第 85页)
的 AChE分布较少 ,黄豆和蚕豆在发芽 4d后的幼芽
根部未检测到 AChE活性。幼苗期 ,不同种类的豆科
植物 AChE活性也存在差异性 ,在叶 、茎处 AChE分
布较多 ,根中的 AChE分布较少 ,其中豇豆叶中的
AChE活性最高为 9.03±0.09U/g干重 ,仅次于干种
子期的猪腰豆和菜豆 ,同时菜豆叶 、菜豆茎 、绿豆茎 、
黄豆茎中也有较高的 AChE活性 ,但在黄豆和蚕豆根
部仍未检测到 AChE的存在 。
综合分析豆类不同种类 、不同发育阶段和幼苗
不同部位 AChE活性的变化趋势可以看出 ,猪腰豆 、
菜豆 、红小豆 、蚕豆在干种子期 AChE活性较高 ,绿豆
在 4d幼芽胚根处的 AChE活性较高达到 4.05 ±
0.07U/g干重 ,而豇豆 、黄豆在幼苗的叶 、茎部位具有
较高的 AChE活性 。在本实验的研究范围内 ,猪腰豆
干种子中 AChE活性最高 ,达 10.28±0.24U/g干重 。
3　结论
本实验对不同种类豆科植物于不同发育阶段 、
不同部位乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的分析比较 ,以
及总酯酶活性 、蛋白质含量 ,水分含量的测定结果表
明 ,在不同种类的豆科植物中均检测到 AChE活性 ,
但不同种类豆科植物存在差异 ,其中干种子期猪腰
豆(WhitfordiodendronfilipesDunn)中的 AChE活性最
高为 10.28U/g干重 ,比活力达到 0.106U· mg-1 。此
结果稍高于裴瑞瑞 [ 7 ]等报道的牛血清中 AChE活性
0.099U· mg-1 ,由此可见 ,植物 AChE酶原不仅活性
较高 ,而且来源广泛 ,价廉易得 ,具有很大优势和开
发潜力 ,因此本实验为植物 AChE酶原的分离纯化及
酶学性质的研究奠定了一定的基础 ,关于植物 AChE
酶的分离纯化及其在农药残留检测中的应用有待于
进一步探索。
参考文献
[ 1]王恒彬 ,王学臣 , 张蜀秋 ,等 .乙酰胆碱酯酶在蚕豆保卫细
胞中集中分布 [ J] .植物学报 , 1999, 41 (4):364-368
[ 2] YoshimasaSagane, etal.MolecularCharacterizationofMaize
Acetylcholinesterase.A NovelEnzyme Family in thePlant
KingdomPlant[ J] .Physiol, 2005, 138:1359-1371.
[ 3] TretynA, KendrickRE.Acetylcholineinplants:presence,
metabolismandmechanismofaction[ J] .BotRev, 1991, 57:
33-73.
[ 4] Kosuke Yamamoto, Suguru Oguri, Yoshie S
Momonoki.Characterizationoftrimericacetylcholinesterasefroma
legumeplant, Macropt-ilium atropurpureum Urb[ C] .Plant
Springer:Verlag, 2008, 227:809-822.
[ 5]李绍中 ,黄晓东 , 高新义 ,等 .植物胆碱酯酶提取新工艺的
研究 [ J] .食品科技 , 2007(4):41-43.
[ 6]兰平 ,张蜀秋 , 娄成后 .玉米幼苗节和节间中乙酰胆碱酯
酶测定 [ J]中国农业大学学报 , 2003, 8(5):1-3.
[ 7]裴瑞瑞 ,黄永春 , 何丽丽 ,等 .牛血清乙酰胆碱酯酶的分离
纯化 [ J] .农业环境科学学报 , 2006, 25(5):1281-1284.