全 文 ： 土 壤 (Soils), 2005, 37 (4): 382~387

非豆科植物固氮菌—Frankia 的基因组研究进展

王树凤 陈益泰
（中国林业科学研究院亚热带林业研究所 浙江富阳 311400）

摘 要 弗兰克氏菌（Frankia）能够与大约 25个属的非豆科植物共生进行结瘤固氮，在生态系统中具有
重要意义。本文对 Frankia 的基因组学研究进展进行了综述，包括 Frankia 基因组的结构、功能及其表达特点，
同时比较了来源于不同菌株的固氮基因的差异，并提出今后的发展趋势。
关键词 弗兰克氏菌；固氮酶基因簇；谷氨酰胺合成酶基因；rRNA基因；质粒
中图分类号 S154

弗兰克氏菌（Frankia）是与许多木本非豆科植
物共生的固氮菌，属于放线菌类，与 Frankia 共生
的植物称放线菌结瘤植物，是森林生态系统中占
优势的固氮树种。迄今为止，已查明能够进行放线
菌结瘤固氮的植物有 8 个科 25 个属 200 多种被子
植物[1]。Frankia 与宿主植物所形成的共生固氮体
系不仅可以固定自然界中的 N素，而且能够改善周
围土壤的肥力，增强植物抗逆性[2]等，因此在绿化
造林、水土保持、改善生态环境等方面起着巨大作
用。
对 Frankia 的研究最早开始于 19 世纪，1978
年 Callaham[1]首次从香蕨木的根瘤中分离出内生
菌 Frankia的纯培养，使研究工作获得突破性进展，
成为生物固氮研究中的一个活跃领域。随着生物技
术手段的发展，对 Frankia 的生物学特性、固氮机
理等方面的研究已有许多报道[3~5]。近年来，人们逐
渐将分子生物学技术应用到该领域，通过分析
Frankia的基因组序列，从分子水平探索 Frankia的
各种生理功能的基础。本文概述了近年来国内外在
Frankia遗传学方面的研究进展，特别是 Frankia基
因组的结构、功能以及其他在分子水平研究的新进
展等。

1 Frankia的基因组概况

DNA重组动力学研究[6]表明：Frankia的基因组
大约有 8700 ~ 12000 kbp，它的 DNA含 G+C大约
68 % ~ 72 %。到 2001年 7月底，有大约 293 kbp的
DNA序列被测出，根据这些基因的序列长度，可分
成 9组（表 1）。














2 rRNA和 tRNA基因

2.1 rRNA基因
Frankia 的 rRNA 基因序列是在木麻黄 Frankia
的CeD菌株里被鉴定的[7]。CeD菌株包含两个 rRNA
操纵子（分别记为 rrnA和 rrnB），其中 rrnA 操纵子
有正常的 16S-23S-5S 结构，这些基因的长度与链
霉菌的基因长度相似[8]。rrnA的 16S rRNA 基因上
游有两个启动子序列（rrnA P1和 rrnA P2），其中 rrnA
P2 在大肠杆菌和链霉菌中也起作用。出现两个或多
个启动子可能是一个正常的特征，这在大肠杆菌和
链霉菌中也曾报道过[8,9]。5S rRNA 基因的下游有一
个依赖于 ρ-因子的强终止子。位于 16S 和 23S 之
间的第 1个基因间隔区（intergenic spacer，IGS）有
411 bp，比链霉菌（303 bp）和枯草杆菌（169 bp）
的 IGS都要长，而第 2个 IGS只有 68 bp长，在这
些基因间隔区中未发现 tRNA基因。
表 1 已知序列的 Frankia基因
Table 1 Groups of sequenced Frankia DNA
序列 其因组 长度
（kbp）
占总 DNA
比例（%）
1 rRNA genes 162 55.3
2 nif cluster 63.5 21.7
3 GSⅠgene: glnA 16 5.5
4 GSⅡ gene: glnⅡ 3.7 1.3
5 recA 2 0.7
6 Proteasome gene cluster 4.7 1.6
7 tRNApro genes 0.3 0.1
8 Frankia plasmids genes 39.4 13.4
9 Promoter sequences 1.2 0.4
第 4期 王树凤等：非豆科植物固氮菌─Frankia的基因组研究进展 383

2.2 tRNA 基因
tRNA基因是在桤木弗兰克氏菌（Frankia alni）
的 Ar13菌株中鉴定的[10]，这个基因在 Ar13菌株、
M2 菌株（来源于木麻黄植物）和 ACN14a 菌株中
是单拷贝，在其下游存在典型的依赖于 ρ-因子的发
夹环状结构终止子。tRNApro基因可作为 pSAM2载
体的结合位点。

3 蛋白质降解体基因

蛋白质降解体是蛋白质水解过程中的一个 20S
的桶状复合物，其在真核生物中普遍存在。 Benoist
等 [6]在木麻黄 Frankia 的细胞提取物和培养基浓
缩物中发现了类似蛋白质降解体的复合物，这个
复合物可能在侵染寄主过程中通过分解细胞壁
蛋白质而起作用。最近在红串红球菌（Rhodococcus
erythropolis）、结核杆菌（Mycobacteria tuberculosis）
和天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）中也发现
了类似的复合物。
编码 Frankia蛋白质降解体的基因有 2个：pcrA
和 pcrB，分别编码 20S 蛋白质降解体的 α-和 β-亚
基，这2个基因是在Frankia ACN14a菌株中鉴定的，
并在 E.coli 体内成功表达[11]。表达的蛋白质经纯化
分析，得到一个规则的复合体，该复合体由 4 个环
状物构成，2个由 β-亚基组成的并列环与 2个由 α-
亚基组成的环从侧面相接，每个环有 7 个亚基。另
外在 pcrB的基因上游，有 2个开放可读框（orf6和
orf7），这些开放可读框在放线菌中是保守的，其功
能目前还不清楚。

4 谷氨酰胺合成酶基因 glnA和 glnⅡ

谷氨酰胺合成酶出现在氨同化的初始阶段，
为蛋白质合成提供谷氨酸盐。Edmands 等人[12]在
Frankia 中发现了两种谷氨酸盐合成酶 : GSⅠ和
GSⅡ，GSⅠ是 12亚基酶，每个亚基分子量 54 kDa，
它的结构表达受亚基的腺苷化控制并受来源于谷氨
酰胺代谢物的反馈抑制。GSⅡ有 8 个与 GSⅠ相同
的亚基，但它的表达不受亚基的腺苷化控制，而是
由 N素缺乏诱导。
编码 GSⅠ和GSⅡ的基因分别是 glnA 和
glnⅡ，它们的序列已在 Franki alni 的CpI1和
ACN14a 菌株中被测出[13, 14]。研究发现，ACN14a
和 CpI1 菌株的 glnⅡ 有93 %的一致性，glnA 序
列有.95 %的一致性。glnA 位于glnⅡ的上游，2个基
因转录方向相同。Hosted 等[13]还发现有一个18 aa
的腺苷化区域起始于 CpI1 菌株 glnA 基因的.391
bp 处。另外对 CpI1 基因的引物延伸分析表明，
glnA 和 glnⅡ 的启动子序列存在差异，glnA 的启
动子区位于-35 和-10，可以被σ54 识别，而 glnⅡ
的启动子区与 σ54 的结合区序列存在很大差异，因
此推测可能在另外的区域存在 σ54 识别启动子序
列。但也有研究发现两者具有相似的基因结构[15]。

5 超氧岐化酶基因sodF

在放线菌共生过程中，超氧化物能够影响铁氧
还蛋白、固氮酶复合体等酶的结构并吸收氢化酶，
超氧岐化酶（SOD）是保护细胞免受活性氧损伤的
的保护酶之一。Puppo 等[16]很早就发现 Frankia 纯
培养物中含有 SOD，而且其活性要比其他细菌的酶
活性高。1997年，Alskog等[3] 发现 Frankia的泡囊
中含 Fe-SOD；最近，在 ACN14a- tsr菌株中得到了
编码 Fe-SOD 的基因（sodF）[17]。这种 Fe-SOD 是
一组由 5 种蛋白质组成的复合蛋白，由桤木根部分
泌物诱导产生。从 sodF 编码的蛋白微序列分析和
DNA 序列分析得知，sodF 共有 621 bp。Marechal
等[18]发现有大约 9 kb的基因区（genitic island）环
绕在 sodF周围，研究表明这个基因区与基因激活因
子─乙酰-CoA 转移酶的基因序列相似，在这个基
因区还发现了细菌铁蛋白的基因。该基因区的 DNA
链与大肠杆菌 sodABrecA突变体（厌氧生长）的序
列完全互补。

6 Frankia固氮酶基因簇 nif

到目前为止，人们在 Frankia的 nif基因簇中确
定了 16个基因和 5个开放可读框（orfA、B、1、2、
3），包括固氮酶复合体的 3 个结构基因，还有与铁
钼辅助因子（FeMo-co）合成和组装相关的 10个基
因以及某些与固氮密切相关的基因。它们均以相同
的方向转录，
6.1 固氮酶复合体的结构基因
Frankia 能够固定大气中的 N 素并将固定的 N
转移到寄主植物和土壤，它的固氮作用依赖于固氮
酶复合体和 FeMo-co的表达，该酶由 nifHDK结构
基因编码。nifH 基因编码 N2O4还原酶，而 nifD和
nifK分别编码 N2O4还原酶的 α-和 β-亚基。第一个
报道的 Frankia 固氮基因是 Ar13 菌株的 nifH 基因
[19]，而完整的 nifHDK 序列则是在 Ar13 和 EuIK1
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菌株中得到的[20]。
6.2 与 FeMo-co相关的基因
FeMo-co包括一个金属硫中心（Fe7S9Mo）和一
个柠檬酸盐分子[21]，与 FeMo-co相关的基因共有 10
个：nifV，nifH，nifE，nifN，nifX，nifW，nifZ，
nifB，nifU和 nifS，所有这些基因都在 nif基因簇中，
而且这些基因在 Frankia中很可能是保守的。
nifE 和 nifN 分别编码 NifEN 复合体的 α-和 β-
亚基，NifEN 复合体是一个四聚物，是固氮酶
FeMo-co生物合成所必需的[22]。nifB表达的产物是
铁硫实体（NifB-co），它是 FeMo-co 的前体，这个
前体与 NifEN复合体结合，在 FeMo-co合成过程中
发挥作用。nifU和 nifS的基因产物对于 Fe和 S元
素在 Fe-S实体中的出现是必不可少的，对修复损伤
的 Fe-S簇也可能起作用，NifU可能为 Fe-S簇的组
装提供媒介[23]。
柠檬酸盐是 FeMo-co中的有机成分，它的合成
是由 nifV基因控制的。nifV基因的产物可以通过浓
缩乙酰-CoA 和 α-酮戊二酸盐催化柠檬酸盐形成[24],
另外 nifW也可能在此过程中发挥作用。nifZ的作用
在 Frankia中虽不明确，但 Jacobson 等[25]发现棕色
固氮菌（Azotobacter vinelandii）的 nifZ对于 FeMo
蛋白的分解或活化是必需的。而Shah等[26]发现 nifW
和 nifZ 在柠檬酸盐和 FeMo 前体（NifEN、NifX）
的结合过程中起重要作用。
6.3 其他与固氮有关的基因
除了上述编码固氮酶复合体和 FeMo-co的基因
以外，在 Frankia EUIK1菌株的 nifS序列下游还发
现了 3个与固氮相关的基因。其中前两个与编码 2-
氧酸基铁氧还蛋白还原酶亚单位（ora和 orb）的基
因具有序列相似性，最后一个与编码七铁型铁氧还
蛋白（fdxI）的序列相似[27]。铁氧还蛋白是 2-氧酸
基铁氧还蛋白还原酶的电子受体，在离体状态下可
以给固氮酶提供电子，另外铁氧还蛋白和 2-氧酸基
铁氧还蛋白还原酶在丙酮酸盐生成乙酰-CoA 的过
程中也发挥作用。fdx基因通常存在于 nif基因簇中，
与 nifHDK共转录[28]，而 ora和 orb与固氮基因簇的
相关性却只是在 Frankia中发现。
尽管 ora、orb和 fdxI基因与 nif基因簇存在联
系，但在 Frankia 这些基因的上游并没有发现明显
的 nif-启动子，研究表明这些基因也并非共转录[27]。
6.4 nif 基因簇的结构
在 Frankia 基因组中，与 FeMo-co 组装和合成
有关的大部分基因都与 nifHDK 基因聚集或临近
（图 1）[29]。
在 Frankia CpI1 菌株的 nif 基因簇中，Harriot
等 [30]为 nifB 下游的开放可读框命名为 orf2，
MacEwan和 Gatherer[31]发现 CpI1菌株的 Orf2与来
源于 Anabaena和Cyanothece的HesB具有序列相似
性，因此将 CpI1菌株的这个 orf命名为 hesB，以此
区别于 EUIK1菌株的 orf2，因为 EUIK1菌株的 orf2
与 hesB 序列是没有相似性的。hesB 的功能目前还
不清楚，但 Huang 等[28]发现蓝藻的 hesB 基因只在
固氮状态下才能表达。
最后一个 orf 的序列是在 CpI1 菌株中被鉴定的
[30]，命名为 nifU，因为这个序列与编码某些二氮营
养物的 nifU的 C-末端结构域相似。为了与来源于其
他细菌的 nifU 完整序列相区分，有人建议以 nifUF
表示[32]。EUIK1的 nifUF与 CpI1不同，它有 629 nt
长，而 CpI1 的 nifUF只有 215 nt；EUIK1 的 nifUF
与 hesB是融合在一起的，因此检测不到独立的 hesB
基因。












图1 来源于Frankia不同菌株（种）的nif 基因簇的结构[29]
Fig. 1 Structure of nif cluster of Frankia from different strains/species
(1) EUIK1
(2) CPI1
(3) ArI3
(4) Pocl
(5) HPN180
(6) CcI3
H D K E N X orf3 orf3 W Z R fuced hasrniur or13 s orb orb idxt
X orf3 orf3 W Z R fuced hasrniur
V N D K E2
orfA orfB V H D K2
H
K
第 4期 王树凤等：非豆科植物固氮菌─Frankia的基因组研究进展 385


7 Frankia质粒及其复制

7.1 Frankia质粒的结构
在 Frankia中，存在大约 7 ~ 190 kbp长度不等
的质粒，对这些质粒进行 RFLP（Restriction fragment
length polymorphisms）分析发现，共有 4组：8 kb、
18 kb、35 kb和 55 kb。另外还发现有一个 190 kb的
质粒，DNA 印迹分析表明后者有完整的 nifHDK
簇[32]。
目前已明确序列的质粒有 3个：其中 8 kb质粒
组的 2个，分别是 ArI3菌株的 pFQ31和 CpI1菌株
的 pFQ11；18 kb 质粒组的 1 个，即 CpI1 菌株的
pFQ12[15, 33, 34]。pFQ31和 pFQ11都是 8.5 kb，pFQ12
是 22.4 kb；pFQ12的 GC含量为 76 %，pFQ31是
72 %； pFQ11和 pFQ31有 99.7 %的相似性，而 8 kb
质粒和 18 kb 质粒之间不存在序列相似性。最近的
研究[35]也表明 pFQ11 和 pFQ12 只在 4 个很短的区
域（不到 100 bp）具有相同的序列，但这些质粒上
都有一个 korSA相似序列，所表达的氨基酸序列有
很强的相似性。
7.2 质粒基因的功能
pFQ12大约有 50多个开放可读框，其中 20个
是编码序列；pFQ31有 17个，pFQ11只有 4个。研
究表明，由这些可读框推测的蛋白质序列与在质粒
复制、遗传及转化中出现的蛋白质序列相似[15]，但
至今还没有在蛋白质表达水平上的研究来证实这些
推断。
repFA 是 pFQ31 的一个 orf，编码类似于 Rep
蛋白的复制起始蛋白。pFQ12 有 2 个 orf 编码类似
于质粒转化相关的蛋白质：其中 Orf3 与 pRK2 的
TrbL转移因子类似，Orf6与 pR751的 KfrA相似，
该蛋白是一种内源抑制因子。
Frankia 的这 3 个质粒都包含一个编码类似于
分割蛋白的序列：pFQ31的 parFA基因和 pFQ11的
orf3 编码的蛋白质类似于假单孢菌 Pseudomonas
alcaligenes的 ParA蛋白质，pFQ12的 orf11编码类
似枯草杆菌的 SpoJ蛋白质。分割蛋白质的作用是在
细胞分裂过程中将 DNA 分子等分，产生相等的遗
传物质，从而保证质粒遗传的稳定性。
另外，这 3 个质粒还包含一个类似链霉菌
pSAM2的 KorSA蛋白质基因，KorSA是 kil-kor系
统 GntR家族的一个转录抑制因子，控制 pSAM2的
复制、融合和剪切。在 kil-kor系统中，当细胞不受
kor（kill override）基因调控时，kil基因便发挥作用
使细胞致死。Frankia 的 KorSA 相似序列可能会干
涉 pSAM2 的融合特性，因此，在以 pSAM2 转化
Frankia时应该考虑到这一点。
7.3 质粒的复制
目前已有研究者通过 Oriloc分析推测出了上述
3 个质粒复制的起点，并发现这 3 个质粒均以类似
于 θ-模型的方式复制[33~35]。pFQ31的复制起点是以
ptrFA和 repFA序列之间的DNA回文结构为基础的，
这个区域包含 θ-型复制特有的起始结构骨架（类似
iteron 的重复序列，富含 AT 区和其他一些重复序
列）。pFQ11和 pFQ12虽然也是以类似 θ-模型的方
式复制，但未发现 θ-模型复制的保守序列[35]。

8 存在的问题及展望

在共生固氮过程中，宿主植物的结瘤是固氮菌
进行固氮的第一步，目前人们已经在豆科植物的根
瘤菌中分离克隆到了结瘤基因（nod），放线菌结瘤
植物的结瘤过程虽与根瘤菌存在许多共同之处，但
到目前为止，还未找到 Frankia 的结瘤基因，只是
发现了某些类似于根瘤菌结瘤基因的类 nod 基因
[36]，因此对 Frankia 结瘤的分子生物学基础还有待
于进一步探索。已经确定的 Frankia 基因序列在
Frankia总的 DNA中还不到 3 %，很多未知功能的
基因还有待于分析，因此序列分析工作仍需进行。
Frankia 遗传转化和抗性突变体的研究对于深
入了解 Frankia 对寄主的侵染机制和固氮作用具有
重要意义，目前已初步获得 Frankia 蛋白质在大肠
杆菌的表达，mRNA转录分析工作也取得一定进展。
但由于受 Frankia启动子的限制，Frankia遗传转化
工作遇到了很多困难，因此，下一步的工作是尽可
能找到更有效的转化工具。最近在 Frankia 基因组
中发现 6 个拷贝的插入序列 [34]以及共轭转座子
Tn916 可能具有转化 Frankia 细胞的潜力[37]，为进
一步研究基因在 Frankia细胞中的表达提供了依据。
林木生物固氮研究是生物技术在林业中应用的
一个方面，对于我国的林业发展具有重要意义。我
国对 Frankia共生固氮的遗传学研究起步相对较晚，
又加上目前我国在林业生物技术方面投入不足、研
究手段相对滞后等原因，使得对共生固氮的分子基
础研究远远低于国际水平，很多研究都是国外工作
的重复。但随着我国对林业生物技术重视程度的增
加，这些问题必将得到一定程度的解决，相应的研
386 土 壤 第 37卷
究水平也将有所提高。

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ADVANCES IN RESEARCH ON GENOMES OF FRANKIA

WANG Shu-feng CHEN Yi-tai
( Research Institute of Subtropical Forestry, China Academy of Forestry, Fuyang, Zhejiang 311400 )

Abstract Nitrogen-fixation symbiosis between non-legume plants and Frankia strains is the predominant N2-
fixing system in forests. Actinomycete Frankia is of fundamental and ecological importance for its ability to fix
nitrogen and to nodulate about 25 genera of plants. Here is a review on genomes of Frankia, including the organization,
function, localization and some particular properties of its genes. Also a comparative analysis of Frankia nif genes from
various strains and species was carried out. Novel trends in research on Frankia genetics were given in the end.
Key words Frankia, Nif gene cluster, Gln, Rrn, Plasmid