全 文 ：热带亚热带植物学报　2009, 17(2):205 ～ 210
JournalofTropicalandSubtropicalBotany
收稿日期:2008-08-04　　　接受日期:2008-10-13
基金项目:十一五林业科技支撑计划专题项目(2006BAD01A1605);科技部农业转化基金项目(2007GB24320424);法国发展研究院资
助科技交流与培训项目 BESCDPROJECT(17334)资助
＊通讯作者 Corespondingauthor
木麻黄科植物共生基因遗传转化研究进展
姜清彬 1, 2 ,仲崇禄 1＊,张　勇 1,黄桂华 1, ClandineFRANCHE3
(1.中国林业科学研究院热带林业研究所 , 广州 510520;2.中国林业科学研究院研究生院 , 北京 100091;
3.InstitutdeRecherchepourleDèveloppment(IRD), 911, AvencdAgropolis, 34394Mantpelier, France)
摘要:木麻黄科(Casuarinaceae)植物是世界热带和亚热带地区的造林先锋树种 , 它能与 Frankia放线菌共生形成固氮
根瘤 , 使其具有能够适应各种恶劣环境的优良特性。对木麻黄科植物的共生基因遗传转化研究方法和进展进行了
综述 , 并对今后木麻黄科植物共生基因研究进行了探讨和展望。
关键字:木麻黄;共生基因;遗传转化;进展
中图分类号:Q943.2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1005-3395(2009)02-0205-06
TheProgressofSymbioticGeneticTransformationinCasuarinaceae
JIANGQing-bin1, 2 , ZHONGChong-lu1＊, ZHANGYong1 , HUANGGui-hua1 , ClandineFRABCHE3
(1.ResearchInstituteofTropicalForestry, ChineseAcademyofForestry, Guangzhou510520, China;
2.GraduateSchool, ChineseAcademyofForestry, Beijing100091, China;
3.InstitutdeRecherchepourleDèveloppment(IRD), 911, AvencdAgropolis, 34394Mantpelier, France)
Abstract:CasuarinaceaeispioneerplantintropicalandsubtropicalareasintheWorld.Itcanadapttovarious
badenvironmentsduetoformationofnitrogenfixationnodulebysymbiosiswithactinomycesFrankia.The
advancesinstudiesonsymbioticgenetictransformationofCasuarinaceaewasreviewed, andtheprospectinthe
futurestudywerediscussed.
Keywords:Casuarinaceae;Symbioticgene;Genetictransformation;Progress
木麻黄科(Casuarinaceae)植物有 96种 , 为常绿
乔木或灌木 , 有 4属:裸孔木麻黄属(GymnostomaL.
Johnson)、异木麻黄属(AlocasuarinaL.Johnson)、木
麻黄属 (CasuarinaL.Johnson)和隐孔木麻黄属
(CeuthostomaL.Johnson)[ 1] 。木麻黄的叶高度退
化 , 能减少水分流失 , 具有很强的抗旱能力 , 天然
分布于澳大利亚 、东南亚热带和亚热带海岸及干旱
地区 。木麻黄具速生 、耐盐碱 、耐贫瘠 、抗干旱等特
点 , 对滨海防风固沙 、沿海陆地生态系统的恢复等均
有重要作用 , 已成为重要的沿海防护林和退化地的
改造树种 , 也是薪炭材和造纸等多用途树种[ 2-3] , 木
麻黄有发达的根系 , 能在各种恶劣环境下生长 , 有
固氮改土和改善土壤退化的作用 , 其根系能与
Frankia放线菌共生形成固氮根瘤 ,固定游离氮 , 供
植物生长;吸收磷等重要的矿质营养;还可以产生抗
生物质及生长素 , 改善木麻黄的营养供应 , 提高木
麻黄对干旱 、盐碱 、金属毒害的抗性 [ 4-6] 。 1932年
Aldrich-Blake[ 7]和 1933年 Mowry[ 8] 开始对木麻黄
Frankia放线菌根瘤共生固氮进行研究。自开展了
木麻黄基因工程研究之后 , 越来越多的研究者从分
子和基因水平上去探索木麻黄与 Frankia菌的共生
关系[ 9-10] 。本文旨在总结和归纳当前木麻黄共生基
因遗传转化的研究进展 , 分析未来研究方向和趋势 ,
有助于我们从分子生物学水平更加清楚地认识木麻
黄放线菌根瘤共生原理 , 还能为其他植物生物固氮
研究提供理论参考。
206　 热带亚热带植物学报 第 17卷
1木麻黄基因遗传转化体系
1991年 Phelep等[ 11] 首 次 对 轮 生 木麻 黄
(Alocauarinaverticilata)进行基因遗传转化研究便
获得了成功 。之后 , 木麻黄基因遗传转化研究
得到了快速发展 , 为木麻黄根瘤菌固氮共生研
究提供了 1种分子生物学方法 [ 1 2] 。目前 , 对木
麻黄科的粗枝木麻黄(Casuarinaglauca)和轮生
木麻黄已进行了遗传转化研究 , 并建立了植株
再生和遗传转化体系 , 它们已成为木麻黄科植
物基因遗传转化研究的模式植物 。
1.1植株再生研究
有关木麻黄的试管无性繁殖研究已有许多报
道 [ 13-15] , 但直到 1987年通过诱导短枝木麻黄(C.
equisetifolia)愈伤组织获得再生植物的研究才获得
成功[ 16] , 此后 ,山地木麻黄(C.junghuhniana)、粗
枝木麻黄和轮生木麻黄的再生研究也获得成功 。
粗枝木麻黄 [ 17]和轮生木麻黄[ 18]的离体再生培养
都能够获得再生芽和再生根 ,根再生率高达 96%。
但遗传转化后的芽再生率还存在偏低的问题 , 这
一方面可能是外植体材料的基因型不同 , 培养条
件不一致;另一方面是添加了抗生素的筛选培养基
影响了芽分化。所以离体材料经过遗传转化后如
何获得更高的芽再生率还有待进一步研究。此外 ,
Surendran等[ 19]对山地木麻黄愈伤组织诱导研究表
明 , 愈伤组织诱导率高达 84%, 若愈伤组织继续
培养会出现转黄变黑现象 , 不能分化出芽 。短枝
木麻黄经愈伤组织培养能够获得再生芽 , 且芽能
伸长生长[ 20] 。
木麻黄科 4种植物的愈伤组织再生研究主要
集中在 20世纪 90年代 , 之后由于木麻黄水培繁殖
法的兴起 , 使得木麻黄的愈伤组织再生研究停滞
不前。而对木麻黄基因工程的研究重点转向了愈
伤组织再生技术体系相对成功的粗枝木麻黄和轮
生木麻黄。
1.2遗传转化体系研究
植株再生为转化基因在转化材料中成功表达
提供了基础 , 而建立有效的遗传转化体系 , 为导入
有价值的目的基因创造了条件 。用于木麻黄科植
物基因遗传转化研究的主要方法有农杆菌介导法 ,
包括根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根
农杆菌 (Agrobacteriumrhizogenes)。此外 , 还有基
因枪转化法 , 但转化率明显低于农杆菌介导法 [ 17] 。
采用根癌农杆菌介导 ,通过转入 GUS、GFP等报告
基因对木麻黄进行遗传转化试验[ 17-18, 21] , 获得高
的转化率 , 为研究转入外源目的基因打下坚实基
础 。同时 , Dionf等 [ 22]也报道通过携带有 GUS基
因结构的发根农杆菌 , 侵染木麻黄幼苗下胚轴 , 促
使其生根 , 从而获得成功转化的根系 , 达到转基因
的目的 , 这一方法为研究木麻黄 Frankia放线菌共
生提供了有利条件。
以粗枝木麻黄和轮生木麻黄为材料 , 通过根
癌农杆菌和发根农杆菌介导进行共生基因转化研
究 , 一方面将克隆到的与木麻黄共生有关的基因
通过根癌农杆菌介导转入其他模式植物中 , 对共
生基因进行表达分析和功能研究;另一方面将其他
已知有共生关系的基因通过发根农杆菌介导转入
木麻黄根系中 , 分析这些基因与木麻黄共生体的
表达作用。有科学家提出将发根农杆菌通过感染
木麻黄小枝条的新鲜切口 , 利用木麻黄枝条容易
水培生根的特点 , 从感染的伤口处水培出大量的
根 , 从而能够获得转化根[ 21, 23] 。
2木麻黄共生基因遗传转化
用 Frankia放线菌感染木麻黄根能形成共生根
瘤 , 通过分子生物学手段 , 从基因水平上研究共生
根瘤的形成过程和共生根瘤固氮作用机理 , 克隆
与根瘤共生的有关基因 , 并将这些共生基因进行
遗传转化 , 在木麻黄科植物和其他模式植物中表
达 , 从而分析共生基因在木麻黄 Frankia共生体中
的表达作用 。
2.1建立共生基因表达系统
Dionf等 [ 22]构建了 1个共生基因的表达系统 ,
用携带有报告基因的发根农杆菌 , 侵染木麻黄幼
苗下胚轴 , 促使其生根 , 3周后 , 切去原来的根系 ,
把带有转基因根的幼苗转移到试管中接种 Frankia
放线菌 。经检测 , 这些转基因根上所长出的根瘤 ,
具有固氮酶的活性和非转基因根瘤的形态 。通过
荧光分析和组织化学分析 , 在转基因的根和根瘤
上检测到 β -葡萄糖苷酸酶(GUS)的活性 。
此外 , 研究者们利用豆科 (Legume)-根瘤菌
(Rhizobium)能够形成共生根瘤的特点 , 将一些在
木麻黄植物中高效表达的共生和非共生基因转入
豆科植物中 , 以此推断木麻黄共生基因的调控表
达形式。 Karin等 [ 24] 报道木麻黄血色素 (cashb-
sym)共生基因的调控表达 , 类似于豆科 -根瘤菌形
第 2期 　姜清彬等:木麻黄科植物共生基因遗传转化研究进展 207　
成的根瘤中豆血红蛋白基因 。这有助于深入研究
与木麻黄共生有关的基因 。
豆科 -根瘤菌与木麻黄-Frankia作为植物与土壤
中细菌共生形成固氮根瘤的两种形式有类似之处 ,
豆科 -根瘤菌共生模式 , 也是研究木麻黄 Frankia共
生基因表达的 1种方式。 Franche等[ 25] 将大豆
(Glycinemax)lbc3基因 、榆科山麻黄(Parasponia
andersoni)和山黄麻(Trematomentosa)的血色素启
动子转入不同共生体系 ,为根瘤发生和共生基因的
研究开辟新的途径。
2.2共生基因的克隆
共生基因在根瘤的各个时期的表达存在差异 ,
利用差异显示法从木麻黄放线菌根瘤植物和非豆
科植物根及根瘤 cDNA文库中 , 分离出根瘤特异性
基因和启动子 , 以研究它们的表达形式 、功能和应
用前景 。 1996年 Bogusz等 [ 26] 构建了 1个粗枝木
麻黄根瘤 cDNA文库 , 在用根和根瘤 cDNA作探针
时显示了差异 ,通过分析 cDNA的克隆序列得到了
几个木麻黄转录子 , 分离克隆出多个与根瘤共生
有关的基因 。到目前为止 , 从粗枝木麻黄 cDNA文
库中克隆的共生基因有 cg12[ 27-28] 、cgenod40[ 29] 、
symrk[ 30] 、 cgMT1[ 31-32] 、 hb-cg1F[ 33] 、 cgCHS1[ 34] 和
hb-sym[ 35] 。
从其他非木麻黄科植物中克隆的共生基因 , 在
木麻黄科植物上进行遗传转化试验 , 为研究木麻黄
Frankia共生根瘤的机理提供参考。从赤杨(Alnus
glutinosa)中克隆的 ag12基因 [ 36] , 与从粗枝木麻黄
cDNA文库中克隆的 cg12基因十分相似 , 都是编码
枯草杆菌蛋白酶的基因 , 在氨基酸序列上有 85%的
相同之处[ 27] 。此外 ,用于转化木麻黄科植物的非木
麻黄根瘤共生基因有 13个(表 1)。
这些共生基因的克隆 , 使木麻黄 Frankia放线
菌根瘤共生研究可以定位到某个特定的基因 , 而特
定基因在共生根瘤中特异性表达 , 通过对其功能表
达的分析 , 为获得有价值的共生固氮基因提供了一
条重要途径。
2.3共生基因在共生根瘤中的表达研究
木麻黄 Frankia放线菌根瘤共生体的形成 , 是
由 Frankia放线菌感染木麻黄根部细胞引起的 , 细
菌与细胞在感染初期紧密接触 , 接触面成了共生体
之间信号传导和营养交换的重要区域[ 43] 。Laplaze
等 [ 27]和 Svistoonof等[ 44-45]将含有 cg12的启动子报
表 1　应用于木麻黄科植物遗传转化研究的其他共生基因
Table1　SymbioticgenesisolatedformotherhostsintroducedintoCasuarinaceae
基因
Symbioticgene
宿主
Host
特征
Description
参考文献
Reference
ag12 赤杨 Alnusglutinosa 类似于植物枯草杆菌蛋白酶基因
Similartoplantsubtilisin-likeproteasesgene
27, 36
agenod40 赤杨 A.glutinosa 类似于豆科植物早期根瘤 enod40基因
Similartolegumeearlynodulingeneenod40
29
gmenod40 大豆 Glycinemax 类似于豆科植物早期根瘤 enod40基因
Similartolegumeearlynodulingeneenod40
29
agNt84
ag164
赤杨 A.glutinosa 编码氨基乙酸和组氨酸蛋白酶基因 , 可能与
含金属蛋白酶编码有关 Glycine-andhistidine-rich
proteingene, possiblyametalbindingprotein
37
nifH 弗兰克氏菌 Frankia 固氮酶基因 Nitrogenasestructuralgene 38
psenod12B 豌豆 Pisumsativun 类似豆科植物早期根瘤 enod40基因
Similartolegumeearlynodulingeneenod40
39
euSAMS1
euSAMS2
牛奶子
Eleagnusumbelata
S-腺苷-L-蛋氨酸合成酶基因
S-adenosyl-L-methioninesynthetasegene
40
ag-NOD-CP1 赤杨 A.glutinosa 半胱氨酸蛋白酶基因 Cysteinproteasegene 41
ag13 赤杨 A.glutinosa 脯氨酸和古氨酸蛋白酶基因
Proline-andglutamicacidrichProteingene
41
euNOD-CHT1
euNOD-CHT2
牛奶子
E.umbelata
几丁质酶基因 Chitinasegene 42
208　 热带亚热带植物学报 第 17卷
告基因融合体转入轮生木麻黄 , 结果显示基因表达
是在最初的感染过程中 , 也就是 Frankia侵染根毛
的时候 , 表明这些基因是在根部细胞被共生菌侵
染后表达 , 与 Frankia感染初期的共生体之间信号
传导和营养交换有关 。这也证实了 cg12在粗枝木
麻黄根瘤发生过程中的表达形式类似于 Frankia侵
染赤杨的过程。 Pawlowski等 [ 37]还报道从赤杨中克
隆的 agNt84和 ag164基因也在 Frankia感染初期
快速表达 , 分别编码氨基乙酸和组氨酸蛋白 , 推测
可能作用于共生体细菌感染的接触面上。
当 Frankia放线菌感染根部细胞后 , 触发靠近
感染部位的皮层细胞产生分化 , 这些分化的细胞
突起形成初结瘤 (prenodule), 内共生体再侵染初
结瘤 ,使其扩大形成根瘤(nodule), 初结瘤是根部
细胞内感染的第一步 , 并不直接形成根瘤 。
Laplaze等 [ 38] 将固氮酶基因 nifH转入粗枝木麻黄
中 , 经 Frankia放线菌感染形成初结瘤后 , nifH基
因能够在初结瘤中表达 , 说明初结瘤能够产生固
氮作用 。且初结瘤细胞进行固氮作用时共生血色
素基因 cghb也获得了表达 , 说明初结瘤细胞的一
些生理形态功能接近根瘤 。
enod40基因是豆科植物根瘤器官形成的一个
关键基因 , 在原基细胞形成根瘤时 , 它在根毛 、根
茎和成熟根瘤的维管组织中表达 [ 46-47] 。而在木麻
黄 -放线菌根瘤中 , enod40基因是否也起着同样的
作用? Santi等 [ 29]从粗枝木麻黄中克隆了与 enod40
同族的 cgenod40基因 ,比较了 cgenod40-GUS融合
体在豆科植物 Lotusjaponicus和大豆 gmenod40-2-
GUS基因在轮生木麻黄中的表达 , 结果它们的表
达相似 , 都能在根毛和根瘤的维管组织中表达 , 但
cgenod40-GUS没有在 Frankia感染初期 、初结瘤形
成和原基细胞形成根瘤的过程中表达 , 所以
enod40只在豆科植物的根瘤形成过程中表达 , 并
不是木麻黄根瘤形成过程中的一个关键基因 。此
外 Sy等[ 39] 利用 豌 豆 (Pisum sativun)中 的
psenod12B基因转化轮生木麻黄和粗枝木麻黄 ,在
与 Frankia共生早期的发根和初结瘤中不表达 , 可
能轮生木麻黄和粗枝木麻黄的一些转录因子与
psenod12B启动子产生影响 , 这不同于非豆科植物
根瘤的形成 。此外 , Hassen等 [ 30]从粗枝木麻黄中
分离了共生受体蛋白激酶(symbiosisreceptor-like
kinase)基因 symrk, 结果表明 , symrk也是放线菌根
瘤形成的一个重要基因。
共生根瘤形成后具有固氮作用 , 有一种叫做
金属硫因(metalothionein)的 cgMT1基因在根瘤固
氮部位高效表达 [ 31] , 推断 cgMT1基因可能与根瘤
固氮时金属离子转运有关 , 也可能在根瘤形成期
间起到抗活性氧的作用。为了进一步明确 cgMT1
基因的功能 , Obertelo等 [ 32]将 PcgMT1-GUS融合
体转入拟南芥(Arabidopsisthaliana)中 , 结果表明
一些金属离子如铜 、锌和镉并不是调控 cgMT1基因
表达的关键因素 , 而伤口和 H2O2是基因高效表达的
因素 , 因为 H2O2积累物的减少和伤口的敏感性导致
细菌病原体(甘蓝黑腐黄单胞杆菌 Xanthomonas
ampestrispv.Campestris)侵染转化植株 , 引起 cgMT1
基因的表达 , 由此推断 cgMT1可能是与连接生物体
与非生物之间的抗氧化作用有关 , 参与根瘤固氮作
用 。而在根瘤固氮后 , euSAMS1和 euSAMS2参与了
氮素代谢和细胞壁甲基化 [ 40] 。
当共生根瘤中细胞质和放线细菌退化衰亡 ,
与衰亡响应有关的一些编码蛋白酶基因获得表达 ,
如 ag13和 ag-NOD-CP1分别编码古氨酸 、脯氨酸
和半光氨酸蛋白酶[ 41] 、 euNOD-CHT1和 euNOD-
CHT2基因编码几丁质酶基因 [ 42] 。这些基因的表
达同样为共生根瘤的存在起到了不可或缺的作用 。
3展望
3.1建立共生基因遗传转化研究模式系统
木麻黄科植物中 , 轮生木麻黄和粗枝木麻黄
都能够通过根癌农杆菌和发根农杆菌介导进行遗
传转化 , 且成功获得再生的转化芽和转化根 , 但轮
生木麻黄获得转化芽和根要比粗枝木麻黄容易和
所需时间短 。粗枝木麻黄的染色体组要比轮生木
麻黄小 , 分别为 2C=0.7 pg和 2C=1.9 pg,且粗枝
木麻黄根瘤的 cDNA文库已经建立 , 从中克隆出与
共生相关的基因 , 再通过其他植物 , 如模式植物拟
南芥等进行表达分析 。所以 , 沿着这条主线 , 共生
基因遗传转化研究模式系统将逐步建立 。
3.2开展共生基因 EST和基因组学研究
EST(randomsequencingofexpressedsequences
tag)可以代表生物体某种组织某一事件的一个表达
基因[ 48] 。利用 EST技术 , 可以对木麻黄科植物的根
和根瘤进行比较基因组学研究 , 寻找出与根瘤共生
有关的全部基因 , 建立共生根瘤 EST数据库 , 将为
发现新的共生基因和基因表达研究提供大量的信息
和分析材料。目前 , 法国发展研究院根际发生实验
第 2期 　姜清彬等:木麻黄科植物共生基因遗传转化研究进展 209　
室和热带植物基因组实验室已着手这方面的研究 ,
但还处于初步阶段。
3.3探索共生基因在经济类作物中表达
近年来 , 人们已经掌握了经济类作物水稻的许
多生物学信息 , 且其基因组小 , 已经成为研究谷类
的模式植物[ 49] 。科学家们一直致力于使其具有生
物固氮能力的研究。早期 , 曾将根瘤菌接种到根部
进行生物固氮实验 , 没有获得成功。但是 , 将一些
与共生根瘤形成相关的基因 (如 Msenod12A和
Msenod12B)连同 GUS报告基因转入非豆科植物中 ,
结果 GUS在转化根有表达[ 50] , 这使研究者们充满
了信心 , 相信实现水稻等经济类作物具有生物固氮
能力指日可待。
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