全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis 19(2):123 ～ 126 , 2007
浙江省茄科蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗性
印利梅 ,礼　茜 ,李红叶＊
(浙江大学 农业与生物技术学院生物技术研究所 ,浙江杭州 310029)
摘　要:用菌丝生长速率法测定了来自浙江宁波 、金华 、嘉兴等不同地区保护地蔬菜上采集分离的 48 个灰霉
病菌(Botrytis cinerea Pers.)菌株对嘧霉胺(pyrimethanil)的抗性 , 发现高抗菌株 4个(占 8.33%), 中抗菌株 2 个
(占 4.17%), 低抗菌株 6个(占 12.5%), 敏感菌株 36 个(占 75%)。抗性菌株在无药培养基上经 10 代继代培
养后 , 再进行抗性评价 , 发现其抗嘧霉胺特性能稳定遗传。比较抗性水平不同菌株间的菌丝生长情况 ,发现
菌丝生长量和抗性水平无相关性。研究表明 ,抗嘧霉胺的灰霉菌亚群体已在浙江省茄科蔬菜中形成 , 各地应
根据抗性水平和用药历史 ,合理更换或轮换使用与嘧霉胺无交互抗性的药剂 ,以确保病害的有效控制。
关键词:茄科蔬菜;灰霉病;嘧霉胺;抗药性
中图分类号:S432.2+6　　　　　　　　文献标识码:A 文章编号:1004-1524(2007)02-0123-04
Resistance of Botrytis cinerea to fungicide pyrimethanil from Solanaceae vegetables in
Zhejiang Province
YIN Li-mei ,LI Qian , LI Hong-ye＊
(Institute of Biotechnology , College of Agriculture and Biotechnology , Zhejiang University , Hangzhou 310029 , China)
Abstract:Forty-eight strains of Botrytis cinerea Pers.isolated from Solanaceae vegetables in Ningbo , Jinhua , Jiaxing and
etc.were evaluated by the method of mycelial growth inhibition for the resistance to fungicide pyrimethanil.The results
demonstrated that the resistant strains to pyrimethanil has been found in Zhejiang Province , China, and the frequency for
high , middle , and low resistance were 8.33%, 4.17%, and 12.5%, respectively.Resistance to pyrimethanil for B.
cinerea was stable after 10 successive subcultures in fungicide free media.There was no significant correlation between the
mycelium growth and pyrimethanil-resistance or sensitivity.Strategies to avoid the further development and spread of B.
cinerea with resistance to pyrimethanil fungicide were discussed.
Key words:Solanaceae vegetables;Botrytis cinerea;pyrimethanil;fungicide resistance
　　灰霉病是由灰葡萄孢 (Botrytis cinerea
Pers.)引起的一种重要病害 ,是番茄 、辣椒和茄
子等茄科作物上的主要病害之一 。对灰霉病的
防治主要是以化学防治为主 ,由于灰葡萄孢菌在
遗传上存在异核现象 ,在自然种群中存在十分丰
富的多样性[ 1] ,在药剂选择压作用下 ,自然存在
收稿日期:2006-05-09
基金项目:国家自然科学基金资助(30571236)
作者简介:印利梅(1983-),女 ,湖北仙桃人 ,硕士 ,主要从事植
物病害抗药性方面研究。
＊通讯作者 ,李红叶 , E-mail:hyli@zju.edu.cn
的抗药性个体极易被筛选而形成抗药性的亚群
体 ,从而导致防治效果下降甚至失效[ 2] 。
目前国内用于灰霉病防治的药剂主要是二
甲酰亚胺类(如菌核利 、乙烯菌核利 、扑海因和腐
霉利等)和胺基嘧啶类(如嘧霉胺 、甲基嘧菌胺 、
环丙嘧菌胺和氟嘧菌胺等)杀菌剂。据已有的研
究报道认为 ,胺基嘧啶类杀菌剂的杀菌机理在于
抑制病菌蛋氨酸的生物合成[ 3]和细胞壁降解酶
的分泌[ 4] 。灰葡萄孢菌对嘧霉胺的抗药性是由
单基因控制的[ 5 , 6] ,理论上极易形成抗药性的亚
群体 ,这种现象在现实应用中已得到证实。瑞
士[ 7] 、法国[ 5] 、英国[ 8] 、智利[ 9]相继报道了各地灰
霉病菌对该类药剂产生抗性问题。在国内 ,虽然
嘧霉胺的使用年限不长 ,但抗嘧霉胺的灰霉病菌
株在沈阳和江苏等地已经有了报道[ 10 ,11] 。嘧霉
胺作为单剂或混剂在浙江省已有近 5 年的使用
历史 ,本研究旨在了解浙江省灰霉菌对嘧霉胺的
抗性现状 ,以期对生产上合理用药提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌株采集分离
2005年4 ～ 5月 ,在浙江省宁波 、杭州 、金华 、
嘉兴 、温州和常山等地区 ,共采集分离得到灰霉
病菌株若干 ,用斜面培养基保存到 4℃备用。
1.1.2　供试药剂与培养基
95.5%的嘧霉胺原药(沈阳农业大学纪明山
先生提供)溶于丙酮 ,配制成 10 mg/L 的母液;链
霉素购买自上海生物工程有限公司 ,氨苄青霉素
购买自北京鼎国生物技术有限公司 。
菌株分离采用 PDA 培养基配方为:马铃薯
200 g ,葡萄糖 20 g ,琼脂条 15 g ,加蒸馏水至1 000
ml。抗性测定的培养基依照 Chapenlnd(1999)的
培养基配方配制:葡萄糖 10 g ,琼脂 15 g ,KH2PO4
2 g ,K2HPO4 1.5 g ,MgSO4·7H2O 5 g ,(NH4)2SO41 g
加水至1 000 ml。
1.2　方法
1.2.1　灰霉菌株的分离
从浙江省不同地区的田块采集发病的番茄 、
茄子和辣椒的病果 ,分别用小塑料袋装好 ,带回
实验室分离 。分离时 ,先用 75%的酒精进行表
面消毒 ,然后挑取病健交界处小块组织 ,接到含
有 30 μg/ml链霉素和 100 μg/ml氨苄青霉素的
PDA培养基上培养 ,3 d后待菌丝长出以后转接
到斜面上 , 4℃下保存 ,并镜检确定其为灰霉菌
株。
1.2.2　灰霉菌株抗性测定及抗性程度确定
采用菌丝生长法进行抗药性测定 ,即测定抑
制菌丝生长 50%时杀菌剂的有效浓度(EC50),通
过比较 EC50 ,确定抗性水平 。具体方法为:根据
所设定的 6个浓度梯度 ,将母液(10 mg/L)按一
定的比率加入到培养基中 ,制成浓度不同的含药
培养基(药剂在培养基灭菌后 ,温度降到 40℃左
右时加入),然后将生长活力一致的菌丝块接种
到含药平板上 ,6 d后量取菌落直径 ,根据所得直
径求得毒力回归方程 ,并进一步求出 EC50值。抗
性水平依据纪明山(2003)文中所报道的敏感基
线值(0.09110μg/ml)进行判别 ,当菌株 EC50值小
于敏感基线的 5倍时 ,即 EC50小于 0.4555μg/ml
时为敏感菌株;当菌株的 EC50值处于敏感基线的
5倍和 10 倍之间时 ,即 EC50在 0.4555 ～ 0.9110
μg/ml之间时为低抗菌株;当菌株的 EC50值处于
敏感基线 10倍和 40倍之间 ,即 EC50在0.911 ～
3.644μg/ml时为中抗菌株;当某菌株的 EC50值
大于敏感基线的 40倍 ,即 EC50高于 3.644μg/ml
时为高抗菌株。
1.2.3　抗性稳定性测定
从已经测定出 EC50的菌株中 ,选取高抗菌株
BC-T-1-37(EC50=19.9 μg/ml)和敏感菌株 BC-T-
4-69(EC50=2.88 μg/ml)进行继代培养 ,在无药
培养基上连续转接 10代以后 ,再在含药培养基
上比较继代前和继代后的菌株间抗药性水平
(EC50)差异。
1.2.4　抗性不同的菌株菌丝生长情况
菌丝生长速度:首先将抗性不同的菌株 BC-
T-1-37(EC50 =19.9 μg/ml)、BC-T-4-69(EC50 =
2.88μg/ml)和 BC-T-4-28(注明 EC50=0.021 μg/
ml)从斜面上挑出 ,在 PDA 平板上活化 ,待菌落
长到一定大小后 ,用打孔器在生长活力一致菌落
处打取大小相同的菌碟接种到不含药剂的平板
上 ,观察菌落生长情况 。
菌丝干重:将菌碟放入装有 120 ml 液体培
养基的三角瓶中 , 21℃170 r/min振荡培养 12 d
以后 ,过滤菌丝烘干称量菌丝干重。
2　结果与分析
2.1　抗性亚群体的存在
通过48个菌株EC50的测定结果(表1),我们
发现在浙江省内灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性亚
群体已经产生 ,抗性频率目前比例较低 ,抗性菌
株出现的比例为 25%,其中 ,高 、中 、低抗菌株比
例分别为 8.33%,4.17%,12.5%。
·124· 浙江农业学报　第 19卷(2007)
表 1　浙江省各地灰霉菌对嘧霉胺的抗性频率和抗性水平
Table 1　Resistant frequencies and levels of Botrytis cinerea to pyrimethanil form solanaceae vegetables in Zhejiang Province
采集地点 代码 EC50/μg·ml-1 抗性表型 采集地点 代码 EC50/μg·ml-1 抗性表型
宁波农科院大棚 BC-T-1-37 19.9000 HR 宁波邱隘 BC-T-4-26 0.1400 S
宁波农科院大棚 BC-T-1-8 4.8800 HR 宁波邱隘 BC-T-4-36 0.1132 S
宁波农科院大棚 BC-T-1-28 0.9315 MR 宁波邱隘 BC-T-4-49 0.1100 S
宁波农科院大棚 BC-T-1-11 0.3759 S 宁波邱隘 BC-T-4-45 0.1050 S
宁波农科院大棚 BC-T-1-26 0.1560 S 宁波邱隘 BC-T-4-12 0.1023 S
宁波农科院大棚 BC-T-1-32 0.0444 S 宁波邱隘 BC-T-4-43 0.0433 S
宁波农科院大棚 BC-T-1-31 0.0238 S 宁波邱隘 BC-T-4-28 0.0210 S
宁波鄞县　梅墟 BC-T-3-27 0.8070 LR 宁波邱隘 BC-T-4-40 0.0020 S
宁波鄞县　梅墟 BC-T-3-20 0.2861 S 宁波邱隘 BC-EP-4-15 0.1881 S
宁波鄞县　梅墟 BC-T-3-10 0.1517 S 宁波邱隘 BC-EP-4-16 0.0790 S
宁波鄞县　梅墟 BC-T-3-2 0.1194 S 宁波邱隘 BC-EP-4-13 0.0112 S
宁波鄞县　梅墟 BC-T-3-16 0.1142 S 宁波北轮柴桥 BC-EP-5-1 0.1818 S
宁波鄞县　梅墟 BC-T-3-26 0.0990 S 金华 BC-EP-7-10 0.4262 S
宁波鄞县　梅墟 BC-T-3-8 0.0581 S 金华 BC-EP-7-2 0.2216 S
宁波鄞县　梅墟 BC-T-3-6 0.1142 S 金华 BC-T-7-5 0.0650 S
宁波邱隘 BC-T-4-9 11.3700 HR 金华 BC-T-7-3 0.0262 S
宁波邱隘 BC-T-4-64 4.7620 HR 金华 BC-T-7-4 0.0093 S
宁波邱隘 BC-T-4-69 2.8800 MR 嘉兴 BC-EP-9-2 0.7690 LR
宁波邱隘 BC-T-4-47 0.5160 LR 嘉兴 BC-XG-9-1 0.1605 S
宁波邱隘 BC-T-4-46 0.4814 LR 嘉兴 BC-T-9-1 0.1347 S
宁波邱隘 BC-T-4-11 0.4547 LR 常山 BC-P-1 0.8320 LR
宁波邱隘 BC-T-4-25 0.3974 S 常山 BC-T-3 0.1320 S
宁波邱隘 BC-T-4-32 0.2674 S 杭州 BC-T-2-2 0.1760 S
宁波邱隘 BC-T-4-6 0.2310 S 温州 BC-T-10-7 0.0918 S
注:HR表示高抗菌株 , MR表示中抗菌株 , LR表示低抗菌株 , S表示敏感菌株
2.2　抗性频率和抗性水平在地区之间的差异
比较来自不同地区抗嘧霉胺灰霉菌菌株的
频率和程度的结果显示 ,宁波地区存在的抗性问
题较为突出 ,抗性菌株发生频率和抗性程度均高
于其他地区 ,高抗菌株均来自宁波(表 2)。而来
自金华的 5个菌株均为嘧霉胺敏感菌株。
表 2　抗性的地区分布
Table 2 　Distribution of resistant strains of B.cinerea to
pyrimethanil in Zhejiang Province
采集
地点
菌株
数
抗性菌株所占的比例/ %
高抗 中抗 低抗 敏感
宁波 36 10.81 5.41 10.81 72.97
金华 5 0 0 0 100
嘉兴 3 0 0 33.33 66.67
常山 2 0 0 50 50
2.3　抗性性状的遗传稳定性
转接 10代以后 ,再次用菌丝直径法测定第
10 代菌株的抗药性情况。抗性菌株 BC-T-1-37
的EC50值为 17.88μg/ml ,敏感菌株 BC-T-4-69的
EC50值为1.525μg/ml ,而转接前两者的 EC50分别
为 19.90和 2.88 μg/ml。结果通过 SAS系统 t测
验分析得知 ,转接 10代以后菌株抗药性与转接
前比较在 0.05水平上差异不显著 ,即抗嘧霉胺
特性能稳定遗传 。
2.4　抗性菌株在适应性的差异
从图1可以得到:敏感性不同的灰霉菌株之
间 ,菌丝生长差异不显著。说明灰霉菌株菌丝生
长与抗药性之间无相关性 。
3　结论与讨论
结果表明:虽然从整体水平来看 ,浙江省内
的几个地区灰霉病菌对嘧霉胺的抗性水平还不
高 ,但在宁波 、嘉兴 、常山等地已经出现了抗嘧霉
胺的灰霉菌亚群体 ,其中宁波已检测到抗性倍数
达 155倍的高抗菌株 ,必须引起重视 。
从测定的菌株看 ,浙江省的金华 、杭州 、温州
等地尚未出现抗性菌株 ,但由于本试验测定对来
·125·印利梅等:浙江省茄科蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗性
注:柱形图上面的字母 a 是通过 SAS 系统经 LSD测验所得
图 1　不同敏感性菌株菌丝生长比较
Fig.1　Comparison of the mycelium growth for B .cinerea
with different sensitivities to pyrimethanil
自这几个地区的的菌株数较少 ,不能完全代表这
些地区的实际抗性情况 ,需要通过收集测定更多
的菌株进一步加以证实。同时 ,研究还表明 ,高
抗菌株菌丝生长力并不比敏感菌株弱 ,抗性可稳
定遗传 。这说明抗性菌株很可能具有与敏感菌
株相当的适应性 ,抗性亚群体一旦产生 ,即使通
过停止用药 ,或与其他药剂轮换使用也难于消
除。为了更好的控制灰霉病害 ,减少经济损失 ,
应该根据抗性的地区差异 ,针对性地用药。对于
已经出现高抗菌株的地区 ,应该有意识的进行轮
作或选用其他与嘧霉胺无交互抗性的药剂进行
防治 。
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(责任编辑　陈华平)
·126· 浙江农业学报　第 19卷(2007)