全 文 ：第 28卷　第 3期
　2010 年 9 月　 　 　
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Ag ricultur al Unive rsity
　 　 Vol.28　No.3
Sep.2010
　　收稿日期:2010- 08- 25
基金项目:国家自然科学基金(30870154 , 30900087);　四川省教育厅项目。
责任作者:周永红(E-mail:zhouyh@sicau.edu.cn)
青藏高原仲彬草属植物叶绿体 rbcL序列的谱系分析
凡　星 , 罗小梅 , 罗春莲 , 沙莉娜 , 周永红
(四川农业大学 小麦研究所 , 四川 温江　611130)
摘要:对 9 个青藏高原植被区的仲彬草属(StYP 基因组组成)植物及 2 个拟鹅观草属(St基因组)物种和 2 个冰草
属(P 基因组)植物共 13 个类群的叶绿体 rbcL序列进行遗传和基因谱系分析 ,探讨青藏高原仲彬草属植物的系统
关系及其物种形成的母本供体来源。结果表明:①Kengy ilia stenachy ra 、K engy i lia kokonorica 、Kengy ilia hirsuta 、
K engy i lia rigid ula 和Kengy ilia grandig lumis的种间关系较近;②Keng yi lia stenachy ra 和 Kengy ilia geminata
在 rbcL 序列上发生了一定程度的分化;③拟鹅观草属和冰草属植物均可能作为母本供体参与青藏高原植被区不同
仲彬草属植物的物种形成。
关键词:仲彬草属;叶绿体 rbcL;谱系分析;母本供体
中图分类号:S543　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2650(2010)03-0271-05
Genealogical Analysis of the rbcL Sequences of Kengyilia (Triticeae:
Poaceae)Species from the Qinghai-Tibetan Plateau
F AN Xing , LUO Xiao-mei , L UO Chun-lian , SHA L i-na , ZHOU Y ong-hong
(T riticeae Resea rch Institute , Sichuan Ag ricultural Univer sity , Wenjiang 611130 , Sichuan , China)
Abstract:To est imate phylog enetic relationships o f the Qinghai-Tibetan Plateau Keng yi l ia (St-
YP)specie s and the maternal donor during its speciat ion events , chlo roplast rbcL sequences of
nine Keng y il ia taxa w ere analy zed , to gether w ith tw o P seudoroegneria(St)and tw o Agropy ron
(P)taxa.Genet ic and genealo gical analysis suggested that:①the re is a clo se relationship among
K engy i lia stenachyra , K engy i lia kokonorica , K engy i lia hirsute , Keng yi l ia rig idula and
K engy i lia grandiglumis;②the rbcL sequences of Kengy i lia stenachyra and K engy i lia geminate
are evolutionarily distinct;③both Pseudoroegneria and Agropy ron could se rve as the maternal
donor during the specia tion of allotet raploid Kengy i l ia species f rom the Qinghai-Tibetan Plateau.
Key words:Kengy i lia;chloroplast rbcL sequence;genealogical analy sis;maternal dono r
　　仲彬草属(K engy i lia Yen et J.L .Yang)是
Yen和 Yang[ 1]以生长于石质戈壁中的戈壁仲彬草
(Kengy il ia gobicola C.Yen e t J.L.Yang)为模式
种建立的禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)多年
生属 。该属全世界约 26种 ,具有两个分布区:一个
是中亚半荒漠-草原植被区;另一个是青藏高原高
山植被区[ 2] 。形态上 ,仲彬草属植物介于鹅观草属
(Roegneria C.Koch)和 冰 草 属 (Agropyron
Gaertn.)之间 。仲彬草属植物穗状花序的穗轴短
缩 ,排列紧密 ,顶端小穗有时发育不全 ,外稃密生柔
毛或糙毛 ,顶端具短芒或无芒是区别于鹅观草属显
著的形态特征 。而与冰草属的形态区别仅在于仲彬
草属植物颖与外稃扁平或背部呈圆形无显著之脊。
仲彬草属植物的多数物种为草原和草甸的主要组成
成分 ,许多种类是优良的牧草(如 K engy i lia melan-
thera 等),有些物种(如 K engy i l ia hirsuta 等)具有
抗病虫 、抗逆 、高光效等优良特性 。作为麦类作物和
牧草育种的基因资源 ,仲彬草属植物具有重要意义。
　　　 四川农业大学学报 第 28卷
细胞遗传学研究表明所有仲彬草属植物均为异
源六倍体(2n =6x =42), 含有 StYP 基因组组
成[ 2-5] 。Yang 等[ 4] 认为仲彬草属植物由含 StY 基
因组组成的鹅观草属植物和含 P 基因组的冰草属
植物经过天然杂交形成。颜济等[ 2]根据形态特征推
测此天然杂交事件中 ,冰草属植物作为母本 ,而鹅观
草属植物作为父本。基于叶绿体 trnL-F 序列的系
统发育分析 , Liu 等[ 6] 认为拟鹅观草属(St 基因组)
[ Pseudoroegneria(Nevski) .Löve]在一些含 S t-
YP 基因组的披碱草属植物(按基因组分类系统 ,含
S tYP 基因组的物种应归为仲彬草属植物)的物种形
成中作为母本供体。近来根据线粒体 CoX I I 序列
的系统发育分析表明 St 和 P 基因组供体都可能作
为母本供体参与仲彬草属植物的物种形成[ 7] 。因
此 ,关于仲彬草属植物物种形成的母本供体来源仍
处于争论中 。
在植物分子系统学上 ,叶绿体 DNA 作为重要
的分子标记广泛用于探讨植物不同分类单元的系统
关系 、物种种间遗传多态性和物种形成的母本供体
来源[ 8-9] 。编码核糖体 1 ,5-二磷酸羧化酶的 rbcL
基因是植物叶绿体基因组中相对保守的基因 ,常用
于较低分类单元的系统发育研究[ 10] ,也是 DNA 条
形码研究中的核心标记之一[ 11] 。在小麦族植物系
统学研究上 , rbcL 基因已被成功用于属间[ 10] 和属内
种间[ 9] 系统关系的研究 ,以及用于探讨 Hordely-
mus属植物物种形成的母本供体来源[ 12] 。本研究
对来自青藏高原仲彬草属及其近缘属植物的 rbcL
基因片段进行克隆和测序 ,目的在于:①分析青藏高
原仲彬草属植物的种间系统关系;②探讨青藏高原
仲彬草属植物物种形成的母本供体来源。
1　材料和方法
1.1　供试材料
本研究选用了分布于青藏高原的仲彬草属 8种
1变种 、2个含 St 基因组的拟鹅观草属植物和 2个
含 P 基因组的冰草属植物作为供试材料。所有材
料的物种名称 、采集编号 、及来源列于表 1中。凭证
标本藏于四川农业大学小麦研究所标本室(SAU-
TI)。
1.2　方　法
1.2.1　DNA 提取 、扩增和测序
DNA 提取采用 CTAB 法[ 13] 。PCR扩增引物
序 列 为 rbcL1: 5′-A TG TCACCACAAA-
CAGAAAC-3′和 rbcL2:5′-TCGCATG TACCTG-
CAG TAGC-3′[ 14] 。PCR扩增反应在 ABI 9700 型
PCR仪上进行。反应体积为 50 μL , 包括 30 ng
DNA 模板 , 10 × ExTaq 缓冲液 , 2.5 mmo l/L
M gCl2 ,2.5 mmo l/L 4种 dNTP 混合液(pH 8.0),
0.5 μmo l/L 正 、反向引物 , 2.5 U ExTaq 酶和
ddH 2O 。PCR反应条件为:95 ℃预变性 4 min;94
℃变性 1 min ,55 ℃复性 1 min ,72 ℃延伸 1 min 30
s , 35个循环 ;最后7 2℃延伸10min 。PCR产物用
表 1　供试材料
Table 1　The materials used in this study
种名
S pecies
缩写
Abbreviation
基因组
Genome
编号
Accession No. 来源Orig in
Kengy ilia Yen et Yang
K.geminata KGEMI StYP ZY3096 青海门源
K.grandig lumis KGRAN StYP Y2857 青海共和
K.hirsuta KH IRS StYP ZY3068 青海格尔木
K.kokonorica KKOKO StYP Y2880 青海都兰
K.melanthera KMELA StYP ZY3044 四川红原
K.melanthera var.tahopaica KMELT StYP Y2885 青海兴海
K.mutica KMUTI StYP Y2889 青海贵德
K.rigidula KRIGI StYP ZY3111 四川若尔盖
K.stenachy ra KSTEN StYP ZY09023 青海兴海
A gopy ron Gaertn.
A.cristatum ACRISa P ZY09003 青海西宁
A.cristatum ACRISb P ZY09005 甘肃肃南
Pseudoroegneria (Nevski) .Löve
P.spicata PSPIC St - 美国
P.stipi f olia PST IP St PI 440095 俄罗斯
272
第 3 期 凡　星(等):青藏高原仲彬草属植物叶绿体 rbcL 序列的谱系分析 　　　
1.2%的琼脂糖进行电泳 ,用 OMEGA 试剂盒(O-
MEGA Bio-Tek)进行割胶回收。然后 ,以 pMD18-
T (Takara)为连接载体 ,以 DH10B 作为宿主菌 ,对
目的片段进行克隆。每份材料选取 2 ～ 3个阳性克
隆用于 DNA 序列测序。序列测定由北京三博远志
生物技术有限公司完成。所有序列均进行双向测
序。
1.2.2　数据分析
获得的 rbcL 序列用 Clustal X(V1.83)[ 15] 进行
多重排定 ,并对排列序列进行手工校正 。 rbcL 序列
碱基组成及替代用 MEGA 4[ 16] 进行统计 ,并基于 p-
distance参数模型计算各个 rbcL 序列的遗传距离
和序列变异 。基于转换和颠换与遗传距离的线性关
系 ,采用 DAMBE (V4.1.33)[ 17] 进行碱基替代饱和
性分析 ,选用的进化模型是 TN93。为了评估 rbcL
序列单倍型的数目及基因谱系关系 ,我们利用 Ne t-
wo rk 4.1.1.2 软件(Fluxus Technolo gy Ltd ,
C lare , Suf fo lk , UK)的 Median-joining (MJ)算法
对 rbcL 序列进行网状支系分析。
2　结果与分析
本研究从 13份供试材料中获得 13个 rbcL 序
列。所有 13个 rbcL 序列长度均为 743 bp。序列排
列后 ,获得保守位点 722个 ,可变位点 21个 ,简约信
息位点 6个 。碱基转换(si)和颠换(sv)均为 2;碱基
频率 A =0.285 , T =0.287 ,C =0.227 ,G =0.201;
转换和颠换偏向比为 1.206。序列饱和性分析显示
转换和颠换与遗传距离 TN93呈线性关系(图 1),
表明不同序列和不同位点间突变没有达到饱和 ,可
用于系统发育分析。
图 1　rbcL 序列的饱和性检测
Figure 1　Test of substitution saturation of rbcL sequence
基于 p-distance 模型计算各个 rbcL 序列间遗
传距离的三维模式分析表明 Agropy ron cristatum
a (ACRISa)、Agropy ron cristatum b (ACRISb)、
K engy i lia melanthera (KMELA)、Kengy il ia mu-
t ica (KM UTI)和 Keng yi l ia melanthera var.taho-
paica (KMELT)间的遗传距离较近 , Kengy il ia
stenachy ra (KSTEN)、 Kengy i lia kokonorica
(KKOKO)、Kengy i lia hirsuta (KHIRS)、K engy-
i l ia rigidula (KRIGI)、Keng yi l ia grandiglum is
(KGRAN)和 Pseudoroegneria stipi f ol ia (PSTIP)
间的遗传距离较近 ,而 Kengy i l ia geminata (KGE-
M I)与 Pseudoroegneria spicata (PSPIC)的遗传距
离较近(图 2)。
网状支系分析将 13 个 rbcL 序列分成 11个单
倍型 ,并形成两个分支(St和 P 分支)(图 3)。S t分
支包括K .stenachyra 、K .kokonorica 、K .hirsuta 、
图 2　rbcL序列间遗传距离的三维模式分析
Figure 2　3-D analysis of genetic distance
among rbcL sequences
图 3　rbcL 序列的MJ网状支系分析
Figure 3　MJ network analysis of rbcL sequences
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　　　 四川农业大学学报 第 28卷
K.rigidula 、K.grandig lumis 、K .geminata 、P.
stipi f ol ia 和 P .spicata 。其中 K .stenachy ra 、K .
kokonorica和 K .hirsuta 分享相同的单倍型 ,并位
于该分支的中心位置 。K.geminata 和 P .spicata
与中心位置的单倍型分别发生 5和 6个最少突变位
点数 。P 分支包括 K .melanthera 、K.mutica 、K .
melanthera var.tahopaica 、A.cristatum a 和 A.
cristatum b。S t和 P 分支间发生的最少突变数为
4 ,分别位于排列位点的 48 、453 、454和 460处 。
3　讨　论
根据形态 , Cai和Zhi[ 18] 将仲彬草属划分为 3个
组:狭穗组 K engy i lia;阔穗组 Stenachy ra和短穗组
Hyalolep is ,其中阔穗组与短穗组互为姐妹群 。对
仲彬 草 属 Keng yi l ia 物 种进 行的 RAPD[ 19] 、
RAMP
[ 20] 和 I TS[ 21] 序列分析表明仲彬草属物种间
形态相似 、地理分布一致的物种有一定的亲缘关系 。
本研 究的 rbcL 序列网 状支系 分析显 示 K .
stenachy ra(KSTEN)、K .kokonorica (KKOKO)、
K.hirsuta (KHIRS)、K.rigidula (KRIGI)、K .
grand ig lumis(KGRAN)聚在一起 ,且它们之间的
遗传距离较近 ,暗示这些物种的亲缘关系较近 。按
Cai 和 Zhi[ 18] 对仲彬草属的形态分类依据 , K .
stenachy ra 、K .rigid ula 和 K .grandig lumis 属于
阔穗组 , K.kokonorica 和 K .hirsuta 属于短穗组 。
这 5个物种共同的形态特征在于:小穗与穗轴离生 ,
披针形卵圆形的颖 ,花药黑色 。因此 , rbcL 序列数
据支持阔穗组与短穗组物种的亲缘关系较近 。
颜济等[ 2] 从形态上将 K .stenachyra分成两种
生态类型 ,一种类型每穗轴节上着生两个小穗 ,另一
种类型每穗轴节上着生一个小穗 。《中国植物志》
(2006年英文版)将着生两个小穗的 K .stenachyra
处理为K .geminata。本研究的 rbcL 序列网状支系
分析显示在 S t分支中K .stenachy ra与K .gemina-
ta发生的碱基最少突变位点数为 5 ,明显高于 K .
stenachy ra与其他仲彬草属物种发生的最少突变位
点数 。基于 p-distance 遗传距离分析也显示 K .
stenachy ra和 K .geminata 的遗传距离相对较远 。
这些结果表明 K.stenachy ra和 K .geminata已在
rbcL 序列上发生了一定程度的分化 。
细胞质基因组在高等植物中以单亲母系遗传方
式进行遗传物质传递。因此 ,对细胞质 DNA 进行
基因谱系分析可以帮助解释多倍体植物物种形成的
母本供体。叶绿体 rpoA 和 trnL-F 序列的系统发
育分析表明少数含 StYP 基因组的披碱草属植物
(仲彬草属物种)的物种形成以含 St 基因组的
P seudoroegneria作为母本供体[ 6-8] 。基于叶绿体
t rnL-F 序列分析 , Zhang 等[ 22] 推测 Agropy ron 和
Roegneria都可能作为母本供体参与仲彬草属多倍
体植物的物种形成 。线粒体 CoX I I 序列分析表明
Agropy ron 和 Pseudoroegneria 均在仲彬草属植物
物种形成中作为母本供体[ 7] 。本研究中 , rbcL 网状
支系分析显示仲彬草属的 K .stenachy ra 、K.
kokonorica 、K .hirsuta 、K .rigidula 、K .grandiglu-
mis 、K.geminata与两个 Pseudoroegneria 植物 P .
st ipi folia和 P .spicata聚在一起 ,表明这 6 个仲彬
草属植物的物种形成以 Pseudoroegneria 为母本供
体 。而 K .melanthera 、K .mutica 、K .melanthera
var.tahopaica 和 A .cristatum 聚成 P 分支 , 表明
Agropy ron作为母本供体参与这3个仲彬草属植物
类群的物种形成。尽管上述仲彬草属物种同处于青
藏高原高山植被区 ,但 Agropy ron 和 Pseudoroeg-
neria 均可能作为母本供体参与不同仲彬草属植物
的物种形成。
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(本文审稿:丁春邦;责任编辑:巩艳红;英文编辑:李清源)
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