全 文 ：西北农业学报　2008 , 17(5):61-64
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
番荔枝科植物鹰爪内生真菌 rDNA
ITS-PCR扩增条件的优化＊
范　辉1 ,高晓霞1 ,冯昌文2 ,严寒静1 ,傅　军1＊
(1.广东药学院 ,广东广州　510006;2.广东省肇庆市第一人民医院 ,广东肇庆　526000)
摘　要:探索一种简单 、快速的获得番荔枝科植物鹰爪内生真菌 rDNA ITS 目的片断的方法。采用改良的
Rodrigues 组织培养表面消毒技术和 CTAB 法提取植物样品总 DNA , 利用真核生物通用引物 LH2/ Sm73 扩
增 rDNA ITS 目的片段 ,正交法优选 ITS-PCR扩增条件。 PCR反应可同时获得两条 600 bp 和 700 bp 产物 ,
分别为植物和内生真菌的 rDNA ITS 目的片断。改良的组织表面消毒技术可排除外源 DNA 污染。正交法
可快速获得植物内生真菌目的片断。该法简单 、快速 , 为番荔枝科植物内生真菌生物多样性研究提供分子生
物学基础。
关键词:番荔枝科;鹰爪;内生真菌;rDNA ITS 区;聚合酶链式反应(PCR)
中图分类号:Q939.5　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2008)05-0061-04
Optimization for ITS-PCR Amplification Conditions on Endophytic
Fungi of Artabortrys hexapetalus (L.f.)Bhandari
FAN Hui1 , GAO Xiao-xia1 , FENG Chang-wen2 , YAN Han-jing1 and FU Jun1＊
(1.Guangdong Universi ty of Pharmacy , Guangzh ou　510006 , China;2.Th e Fi rst People′s H ospital of Zhaoqing , Zhaoqing　526000, China)
Abstract:To develop a simple , rapid me thod fo r amplify ing fungal rDNA ITS regions w ithin plant tis-
sues of Artabortry s hexapetalus(L.f.)Bhandari.The healthy leaves w ere surface steri lized fo llow ing
a procedure modi fied f rom Rodrigues.The total genomic DNA were ex t racted using CTAB method
wi th modifications.Using the opt imization condi tion o f PCR based on orthogonal design , rDNA ITS
regions w ere amplif ied w ith a pai r of eukary ote universal primer s LH2/ Sm73 for endophyt ic fungi
wi thin Artabortry s hexapetalus(L.f.)Bhandari.PCR amplif icat ions of the rDNA ITS regions w ere
show n being tw o distinguished and closed f ragments which the 700 bp is angiosperms and 600 bp is
co rresponding a typical rDNA ITS size for fungi.DNA contamination can be prevented by the sterile
methods using modified Rodrigues fo r tissue surface.The optimizat ion of orthogonal design is a sim-
ple , rapid method fo r endophy tic fungi of angiosperms.
Key words:Annonaceae;Artabortry shexapetalus(L .f.)Bhandari;Endophy tic fung i;rDNA internal
t ranscribed spacers(rDNA ITS), PCR
　　番荔枝科(Annonaceae)植物近年来备受关
注 ,尤其是番荔枝内酯类化合物(A nnonaceous
aceto genins)抗肿瘤活性强[ 1-2] ,是紫杉醇的 40 ～
300倍[ 3-4] 。由于这类化合物复杂的化学结构和
独特的空间构型 ,其提取分离 、合成的生产成本
高 ,产率低[ 5] 。
近年来 ,人们发现分离自某些抗癌药用植物
的内生真菌能产生与宿主相同或相似的抗癌活性
＊　收稿日期:2008-01-17　　修回日期:2008-03-21
基金项目:广东省中医药局建设中医药强省科研课题(编号 2060041),广东省科技计划项目(社会发展计划 ,编号 63036)。
作者简介:范　辉(1979-),男 ,江西瑞昌人 ,助教,硕士研究生 ,从事药物分析 、中药制剂质量标准研究。
＊通讯作者:傅军(1949-),女 ,教授 ,从事药物分析 、中药制剂质量标准研究。 E-m ail:zchf j@t om .com
物质 ,从而为抗癌药物的生产开辟了一条新的途
径。目前为止 ,国内外尚无学者从内生真菌的角
度对番荔枝科植物内生真菌资源进行基础研究以
及开发和利用研究。
植物内生真菌研究多采用分离培养技术进行
筛选和鉴定。这类技术耗时长 、具有培养基依赖
性 ,在不同培养基获得的内生真菌群落结构有差
别 ,形态学方法鉴定较难 。分子生物学研究中提
取植物基因组 DNA 时 ,寄生于植物组织内部 、种
类繁多的内生真菌其基因组 DNA 同时也可被提
取出来。因此 ,近年来国内外研究者[ 6-8] 开始应用
真核生物通用引物对如 I TS1/ ITS4 、ITS5/ I TS4
等 ,直接从植物基因组 DNA 中扩增内生真菌 rD-
NA ITS 目的片段 ,再将扩增产物进行分子克隆 ,
对其内生真菌进行鉴定以及生物多样性等方面的
研究 。本文利用上述不依赖培养分离的分子生物
学技术[ 6-11] 从番荔枝科植物鹰爪(Artabortry s
hexapetalus (L.f.)Bhandari)[ 12] 叶片组织总
DNA 中获得其内生真菌目的产物 。从而为番荔
枝科植物内生真菌的生物多样性研究 、鉴定分离
出产番荔枝内酯类化合物的内生真菌菌株 ,以及
内生真菌资源的开发和利用奠定基础。
1　材料和方法
1.1　材料
番荔枝科鹰爪花属鹰爪(Artabortrys hexap-
etalus (L.f.)Bhandari)健康叶片组织采自广东
省肇庆鼎湖山 ,由广东药学院中药鉴定教研室鉴
定。样品经蒸馏水清洗 ,并用已灭菌的滤纸擦干
后 ,立即放入装有硅胶的密封袋中保存。参照
Rodrigues组织培养表面消毒的[ 13]方法进行严格
的表面消毒。已消毒的叶片样品在灭菌三蒸水(3
dH 2O)中浸泡 3 min ,收集上述 3 d H 2O ,加入 1/
10体积 3 mol/ L N aAc 和 2.5倍体积的无水乙
醇 , -20℃放置过夜 ,10 000 r/min 离心 15 min ,
弃去上清液 。70%乙醇洗涤 Eppendorf 管壁两
次 ,无水乙醇洗涤一次 ,真空干燥后回溶于适量灭
菌的 1×TE(pH 8.0)中 ,作为阴性对照溶液 ,
-20℃保存备用 。
1.2　试剂与仪器
CTAB (gene), ExTag DNA 聚 合 酶
(Mg2+ , 15 mmo l/L , TaKaRa), 琼脂糖 (Pro-
mega), 10 mmo l/L dNT P (Sangon)。台式高速
离心机(Sigma), 涡旋混合仪 (IKA WORKS),
PE2480 PCR 扩增仪 (PE), 恒压恒流电泳仪
(Life Technolo gies), 凝 胶 成 像 仪 (Kodak
EDAS120)。
1.3　总 DNA的提取
取经消毒处理的叶片样品 0.1 g ,加液氮研磨
成细粉后 ,使用改良的 CTAB法提取总 DNA [ 14] ,
于-20℃保存备用。
1.4　rDNA ITS目的基因片断 PCR扩增
应用 rDNA ITS 区真核生物通用引物对-
LH2/Sm73[ 15-16] 。引物均由上海生物工程有限公
司合成。
20μL PCR反应体系中含10 ×Buffer 2μL ,
2.5 mmol/ L dNT P 1.2 μL , 25 mmo l/L M g2+ 2
μL , 10 μmol/L 引物各 0.5 μL ,5%DMSO 1 μL ,
ExTaq(5 U /μL)0.1μL ,DNA模板(适宜浓度)
2μL ,灭菌三蒸水(3 d H 2O)10.7 μL。扩增条件
为 94℃变性 4 min;94℃1 min , 51℃1 min ,72℃
2 m in ,循环 30 次;72℃延伸 10 min ,同时以 3 d
H 2O代替模板 DNA 作空白对照液 ,以上述阴性
对照溶液代替模板 DNA 作为阴性对照液 。扩增
产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析 。
采用基础反应体系并确定适合的模板 DNA
浓度 ,利用三因素三水平正交表优化 PCR反应条
件 ,主要考察 Mg2+ 、dN TP 、引物的浓度对 PCR
扩增的影响。正交试验设计见表 1。
表 1　正交试验设计[ L9(33)]
Table 1　Orthogonal design [ L9(33)]
试验号
No. Mg
2+
/(mmol/ L)
dNTPs/(μmol/ L) Primers/(μmol/ L)
1 2.0 150 0.75
2 2.0 250 0.25
3 2.0 300 0.10
4 2.5 150 0.25
5 2.5 250 0.10
6 2.5 300 0.75
7 3.0 150 0.10
8 3.0 250 0.75
9 3.0 300 0.25
2　结果与分析
应用改良的 CTAB 法提取鹰爪叶片总
DNA ,在提取过程中未出现多酚类物质的褐化现
象 ,DNA溶液无色透明 ,可见-紫外分光光度计测
得其 A 260/A 280为 1.83。图 1表明 ,总 DNA 提取
条带清晰 、完整 ,无降解。
·62· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
利用 LH2/Sm73[ 15-16]对鹰爪叶片总 DNA 进
行 PCR扩增 。在预试验中利用四因素四水平表 ,
对 PCR反应体系中的 Mg 2+(1.0 ～ 3.0 mmo l/
L)、dN TP(150 ～ 300 μmo l/L)、引物(0.10 ～ 0.75
μmol/L)以及模板(稀释 10 ～ 1 000倍)条件进行
优化 。结果有 4个正交反应条件可以获得 600 bp
左右的目的片断 ,但是扩增效果较差 ,仅可优选出
模板浓度(稀释 100倍)。在此基础上利用表 1中
反应条件作进一步优化 ,结果如图 2所示 。上述
表 1中的 4 、5 、7 和 9号 PCR反应条件可同时获
得两条清晰(700 bp和 600 bp)、带型基本一致的
扩增产物(图 2中 5 、6 、8和 10)。
1.鹰爪叶片组织 , Sample;2.阴性对照 , Negat ive con t rol;
M .λDNA(15 000 bp)
图 1　鹰爪总 DNA
Fig.1　Total DNA extracted from the leaves of
Artabortrys hexapetalus (L.f.)Bhandari
1.空白对照 , Blan k cont rol;2-10.试验号 , T rial s;
11.阴性对照, Negative cont rol;M.DNA (1 000 bp)
图 2　PCR反应条件优化
Fig.1　Optimization of the PCR condition based
on orthogonal experimental design method
3　讨论
从植物体内分离内生真菌 ,关键的第一步是
对植物组织表面消毒。如果表面消毒不彻底 ,一
些表生真菌就会先长出来 ,影响内生真菌的分离
和鉴定。利用分子生物学技术研究植物内生真
菌 ,即使采用组织培养中的表面消毒技术杀死组
织表面的细菌和微生物 ,但是这些表面的细菌和
微生物 DNA 仍会残留在植物组织表面 。因此 ,
不依赖分离培养的分子生物学技术 ,排除组织表
面的残余 DNA 是关键。本研究中利用 DNA 具
有易溶于水的溶解性质 ,收集经表面消毒后冲洗
叶片组织的 3 dH 2O ,以此溶液为阴性对照溶液 ,
进行 PCR扩增。结果证明(图 2的 11为阴性对
照)经过严格的表面消毒程序成功地除去了植物
样品表面的外源 DNA 污染 。
郭良栋[ 6-8] 等应用真核生物通用引物对
ITS1/ I TS4 、ITS5/ ITS4等构建的植物内生真菌
文库 ,其生物多样性比较低。高晓霞等在药用植
物肖菝葜内生真菌生物多样性研究中[ 17] 设计并
报道真核生物通用引物对-LH2/Sm73 ,可同时扩
增出分别为 700 bp 和 600 bp的 rDNA ITS 区片
段 ,且获得较为丰富的内生真菌生物多样性;并且
根据已有相关资料[ 18] 和试验证明 ,大分子片断为
植物 rDNA ITS 区 , 600 bp左右片断接近典型的
真菌 rDNA ITS 区片断大小[ 19-20] 。本研究中应
用 LH2/Sm73 ,在优化的 PCR反应条件下同时获
得 600 bp 和 700 bp 的两条目的片断 , 经后续
PCR产物割胶纯化 、rDNA ITS 区克隆文库的构
建 、筛选及测序等工作表明 , 700 bp 左右片断为
鹰爪植物 rDNA ITS ,小片断为鹰爪内生真菌 rD-
NA ITS 区片断。
利用严格的表面消毒技术和正交试验设计优
化 PCR反应条件 ,可简单 、快速 、准确地从植物组
织总 DNA 中获得内生真菌目的产物。此方法为
进一步植物内生真菌的生物多样性研究 、内生真
菌资源的开方和利用奠定了分子基础。
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