全 文 ：茶树 EST-SSRs在山茶科植物中的通用性研究
程小毛 1 ,陈自兰1 ,王华 2＊　(1.西南林业大学园林学院 ,云南昆明 650224;2.湖北省农业科学院中药材研究所 ,湖北恩施 445000)
摘要　[目的 ]研究茶树EST-SSRs在山茶科植物中的通用性。 [方法]选用来源于茶树EST序列的 7对EST-SSRs引物 ,对山茶科植物的
19份材料进行了扩增。 [结果] 7对EST-SSRs引物中有 5对引物能对 19个供试材料进行有效扩增 ,通用性比率为 71.43%;扩增率最高
的为云南山茶凤山茶、华东山茶彩霞和云南山茶菊瓣 ,最低的为川滇莲蕊茶和大花杨桐;有效扩增的 5对引物对中有 4对引物在供试材
料中表现出丰富且差异明显的多态性。 [结论]从茶树基因组上开发的 SSR引物在山茶科植物不同种属植物间有较高的通用性 , 可用
于山茶科植物比较基因组研究和分析标记研究。
关键词　茶树;EST-SSR;通用性;山茶科植物
中图分类号　S79　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2011)13-07596-03
StudyontheCommonalityofCameliasinensisEST-SSRsinTheaceaePlant
CHENGXiao-maoetal　(ColegeofLandscapeArchitecture, SouthwestForestryUniversity, Kunming, Yunnan650224)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtostudythecommonalityofCameliasinensisEST-SSRsinTheaceaeplant.[ Method] Sevenpairs
ofEST-SSRsprimerswhichderivedfromCamelliasinensisESTsequencewereusedtoamplifythenineteenspeciesinTheaceaeplant.[ Re-
sult] FivepairsinthesevenpairsofEST-SSRsprimerscouldefectivelyamplifythenineteentestmaterials, andthecommonalityratewas
71.43%.TheamplificationrateofCamelliaretiacalateFengshancha, CamelliajapouicaCaixiaandCameliaretiacalateJubanwasthehighest,
andtheamplificationrateofCameliasynapticaSealyandAdinandrasagonicavar.Walichiana(oc)Mingwasthelowest.Moreover, four
pairsinthefivepairsofprimerswhichcouldefectivelyamplifyshowedtherichpolymorphismwhosedifferencewasobviousinthetestmateri-
als.[ Conclusion] SSRprimerswhichweredevelopedfromtheteaplantgenomehadthehighercommonalityinthedifferentvarietiesof
TheaceaeplantandcouldbeusedinthecomparativegenomeresearchandanalysismarkresearchofTheaceaeplant.
Keywords　Cameliasinensis;EST-SSR;Commonality;Theaceaeplant
基金项目　“省部级重点学科 、省高校重点实验室及校实验室共享平
台 ”项目;西南林业大学校级重点基金项目(110909)。
作者简介　程小毛(1979-),女 ,安徽安庆人 ,讲师 ,博士 ,从事园林植
物分子生物学研究 , E-mail:xmcheng0103@gmail.com。 ＊
通讯作者 ,助理研究员 ,硕士 ,从事植物分子遗传育种研究 ,
E-mail:mrwang813@sina.com。
收稿日期　 2011-02-17
　　山茶科植物是一种具有重要经济价值的园林植物 。山
茶科的各属大部分原产亚洲热带和亚热带地区 ,少数分布于
北美的东海岸及中 、南美洲的热带地区。我国是世界上山茶
原产地和分布中心 ,是山茶种质资源最丰富的国家 [ 1] 。近年
来 ,分子标记如 RAPD、AFLP、ISSR, SSR等被广泛应用于山
茶科植物遗传多样性 、种质鉴定 、遗传连锁图谱构建等 [ 2 -5] 。
在这些类型的分子标记中 , SSR标记由于其具有操作简便 、
重复性好 、共显性等优点 [ 6]而逐渐成为研究者的首选。目
前 ,茶树的基因组信息较山茶科其他属的植物丰富 ,因此研
究者利用公共数据库中的序列信息开发了一些茶树的 SSR
标记 [ 7] ,但茶树相对于其他作物如油菜 [ 8] 、辣椒 [ 9]和水稻 [ 10]
而言 ,可用的 SSR标记数量较少 ,且关于茶树 SSR标记在山
茶科植物中通用性的研究也未见报道。为此 ,笔者利用茶树
EST序列开发了 7对茶树 EST-SSR标记 ,并研究了其在山茶
科植物中的通用性 ,旨在为增加山茶科其他属植物可用的
SSR标记数目提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料　供试材料为山茶科植物杨桐属 1份 、山茶属 17
份及厚皮香属 1份(表 1),均采自昆明及周边地区 。分别取
健康植株的嫩叶 ,在液态氮条件下迅速研磨至细碎粉末状 ,
然后将其保存在 -20 ℃冰箱中 ,备用 。
1.2　方法
1.2.1　EST-SSR引物设计 。利用茶树 EST设计 SSR标记 ,
在剔除 SSR旁邻序列小于 15bp的 EST后 ,用 PRIMER3(ht-
tp://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3 www.cgi)设
计 PCR引物 ,共设计了 7对 EST-SSR引物(表 2)。引物设计
设置的主要参数为:GC含 40%～ 60%;退火温度(Tm)约 55
℃(54 ～56℃);引物长度 15 ～20bp;预期扩增长度为 100 ～
400。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表 1　试验用 19份植物材料
Table1　19 plantmaterialsusedintheexperiment
编号
Numbering
植物名称
Plantname
拉丁学名
Latinname
1 闽鄂山茶 CameliagrijsiHance
2 大花杨桐 Adinandrasagonicavar.Walichiana
(oc)Ming
3 川滇连蕊茶 Cameliasynapticasealy
4 攸县油茶 CameliayuhsienensisHu
5 华东山茶·彩霞 CameliajapouicaCaiXia
6 云南山茶·早牡丹 CameliareticulateLindlEarlyPaeony
7 云南红花油茶 CameliareticutataLindl
8 云南山茶·小桂叶 CameliaretiacalateXiaoGuiYe
9 云南山茶·大银红 CameliaretiacalateDaYinHong
10 云南山茶·凤山茶 CameliaretiacalateFengShanCha
11 云南山茶·狮子头 CameliaretiacalateShiZiTou
12 云南山茶·松子鳞 CameliaretiacalateSongZiLin
13 云南山茶·菊瓣 CameliaretiacalateJuBan
14 云南山茶·平瓣大红茶 Cameliaretiacalate
PingBanDaHongCha
15 云南山茶·早桃红 CameliaretiacalateHanTaoHong
16 云南山茶·大红茶 CameliaretiacalateDaHongCha
17 茶梅 CameliasasanquaThunb.
18 绿茶 Cameliasinensis(L.)O.Ktze.
19 厚皮香 Ternstroemiagymnanthera
(WightetArn.)Beddome
1.2.2　基因组 DNA提取。采用改良的 CTAB法抽提基因组
DNA[ 11] 。具体步骤:①取 0.3 g在液氮中研磨过的植物材料
责任编辑　乔利利　责任校对　马君叶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2011, 39(13):7596 -7598
表 2　7对 EST-SSR引物
Table2　7pairsofEST-SSRprimers
引物编号
Primer
numbering
重复基元
Repeated
primitives
引物序列(5′→3′)
Primersequence(5′→3′)
退火温度∥℃
Annealing
temperature
重复次数
Repeatedtimes
引物长度∥bp
Primerlength
目的片段大小∥bp
Sizeofobjectivefragment
S3 (GTG)n F:TGATGAGTCCTGAGTAACCAC 55.11 8 24 105
R:TGACTGCGTACCAATTCAT
S17 (TGTT)n F:TGCCCCTAATTTTCTATCTTT 54.89 5 20 185
R:GGGAAATTGCTTACTCTCATT
S19 (TC)n F:CCATTATGCAACAATTTTCTC 54.93 13 26 150
R:GAAGTGGGTAAAGTGACAATG
S59 (AG)n F:TGCCCCTAATTTTCTATCTTT 55.79 16 32 149
R:GGGAAATTGCTTACTCTCATT
S95 (CAG)n F:GAGGTAATAGTTTGCACCTC 55.50 6 15 153R:TGTAATACCCTCCATTAGTCG
Contig18 (AG)n F:AGATTTCCCTTTCTAAGGAGAC 54.99 21 42 150
R:CTTGAGTCTGTGATCTGGAAG
Contig172 (TC)n F:CTCAGTGAACTAGGGTTAGGG 55.59 16 32 104
R:ATGGAAATGGAACTGAAGAAA
装入 1.5ml离心管中 ,加入 1.0 ml提取液(0.4 mol/L葡萄
糖 、3% PVP和 2%β-巯基乙醇),摇匀 ,在室温下静置 10
min。②10 000r/min离心 10 min,倒出上清液 ,再加入 1.0
ml提取液 , 10 000 r/min离心 10min。③倒掉上清液 ,向沉淀
中加入 600.0μl2% CTAB,将离心管置于离心盒板上 ,在 65
℃恒温水浴锅中水浴 60min(每隔 10 min上下颠倒离心管 ,
摇匀 ,不能用力过猛),冷却至室温 , 10 000 r/min离心 10
min。④将上清液转至另一 1.5 ml离心管中 ,加入等体积的
氯仿 -异戊醇(24∶1),轻轻混匀数分钟 , 10 000 r/min离心
10min。⑤取上清液于另一离心管中 ,加入等体积的氯仿 -
异戊醇(24∶1),轻轻混匀数分钟 , 10 000 r/min离心 10 min。
⑥取上清液于另一离心管中 ,加入 2/3体积预冷的异丙醇轻
轻混匀 ,于 -20℃冰箱放置 30min, 10 000 r/min离心 10 min。
⑦弃上清液 ,加入 1.0 ml76%乙醇(10.0mmol/LNH4AC)洗涤
沉淀 2次。⑧轻轻倒出乙醇 ,待 DNA自然吹干后溶于 100.0μl
RNase酶水中 ,置于 -20 ℃冰箱中保存备用。
1.2.3　EST-SSRPCR扩增 。SSR反应体系 (总体系 10.0
μl):1×PCRBufer(Mg2 +), 0.2 mmol/LdNTPs, 0.8 μmol/L
引物 , 0.5UTaq酶(北京天根生化科技有限公司), 100.0 ng
DNA模板。扩增在 GeneAmpPCRsystem9700(AppliedBio-
systems)上进行 。反应程序:94 ℃预变性 3min;94 ℃变性 30
s, 56℃复性 1 min, 72 ℃延伸 90 s, 40个循环;72 ℃延伸 5
min。在扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(200 ml98%
甲酰胺 , 0.105 g二甲苯青 FF, 0.105 g溴酚蓝 , 0.040 g
NaOH), 4℃放置备用。
1.2.4　扩增产物的银染检测 。扩增产物用 6 %脲变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳 ,采用银染法检测结果 [ 8] 。电泳完毕 ,取下
长板玻璃 ,胶面向上 ,在蒸馏水中漂洗 6 ～ 8 s,放到银染液
(0.2% AgNO3)中轻摇 10 ～ 20 min后 ,再在蒸馏水中漂洗 6
～8 s,最后在显影液 (2.000% NaOH、0.004% Na2CO3 和
0.036%甲醛)中显影至条带清晰时取出 ,用水漂洗后取出玻
璃 ,沥干水后在灯箱上拍照。
2　结果与分析
2.1　茶树 EST-SSR引物在山茶科不同属 、种间的通用性分
析　结果表明 ,不同引物在不同的属 、种间扩增效果不一样
(表 3)。在所用的 7对 EST-SSR引物中 ,有 5对引物能在不
同山茶科不同属 、种中扩增出产物 ,占测试引物数的
71.43%;7对引物在川滇莲蕊茶和大花杨桐中均未能成功扩
增;在云南山茶花彩霞 、凤山茶和菊瓣 3个品种中扩增成功
率最高 ,达到 71.43%;有 4对引物能在绿茶中进行有效扩
增 ,占测试引物数的 57.14%。可见 ,由茶树 EST序列设计的
SSR引物可在山茶科植物属种间进行有效扩增 ,且茶树 EST-
SSR在山茶科不同属或种间的通用性较好。
表 3　19种植物材料的SSR扩增结果
Table3　SSRamplificationresultsof19 kindsofplantmaterials
植物材料编号Plantmaterialnumbering
S3 S17 S19 S59 S95 Contig18 Contig172
扩增成功率∥%Successratioofamplification
1 - + - + - + + 57.14
2 - - - - - - - 0
3 - - - - - - - 0
4 - + - + + + - 57.14
5 - + - + + + + 71.43
6 - + - - - + - 28.57
7 - + - - - + - 28.57
8 - + - + - + + 57.14
9 - + - - - + + 42.86
10 - + - + + + + 71.43
11 - + - + - + + 57.14
12 - + - + - + + 57.14
13 - + - + + + + 71.43
14 - + - - - + + 42.86
15 - + - - - + + 42.86
16 - + - - - + + 42.86
17 - + - - - + + 42.86
18 - + - - + + + 57.14
19 - + - - + + + 57.14
　注:+.有扩增结果;-.无扩增结果。　Note:+indicatedtheamplificationresult, and- indicatedwithouttheamplificationresult.
2.2　茶树 EST-SSR在云南山茶花中的通用性分析　在所
设计的 7对茶树 EST-SSR引物中 ,有 5对能在云南山茶花中
扩增出条带 ,分别是 S17、S59、S95、Contig18和 Contig172,通
用性比例为 71.43%,且这 5对引物能在云南山茶花中表现
出多态性(图 1),说明从茶树 EST序列开发的 SSR标记能够
较好地应用于云南山茶花。
3　讨论
传统基因组来源的 SSR在不同物种间的通用性很
差 [ 12] ,而作为基因的一部分 , EST-SSR侧翼序列在物种之间
759739卷 13期　　　　　　　　　　　　　　　　程小毛等　茶树 EST-SSRs在山茶科植物中的通用性研究
注:1～ 19分别与表 1中 19种植物材料编号相对应。
Note:1-19respectivelycorespondedwiththenumberingsofnineteen
plantmaterialsinTable1.
图 1　5对EST-SSR引物在 19份供试材料上的扩增结果
Fig.1　AmplificationmapsoffivepairsofEST-SSRprimersin
thenineteenplantmaterials
高度保守 ,因此 EST-SSR引物可在物种之间通用。试验利用
茶树 EST-SSRs在山茶科植物中进行了通用性研究 ,根据茶
树 EST设计了 7对 EST-SSRs引物(S3、S17、S19、S59、S95、
Contig18和 Contig172)对 19个山茶科植物进行了扩增 ,其中
5对引物对(S17、S59、S95、Contig18和 Contig172)能进行有效
扩增 ,有效扩增率为 71.43%,这与白菜 [ 13] 、棉花 [ 14 -15]的高通
用性一致。 7对茶树 EST-SSRs标记中有 5对在云南山茶花
中表现出通用性 ,通用性比率为 71.43%,且这 5对在云南山
茶花中都具有多态性 ,说明开发的 EST-SSR标记对近缘种具
有较高的通用性 ,能够有效弥补云南山茶花分子标记不足 ,
丰富其标记数量。另外 ,茶树 EST-SSR标记在山茶科不同属
种间都有较好的通用性 ,且多态性也较好 ,说明这些标记是
进行茶树与相关物种的比较基因组学研究的良好工具。
SSR引物在不同物种中的通用性取决于 SSR侧翼序列
的保守程度。EST-SSR标记来源于相对保守的转录区域 ,因
此其侧翼序列相对于基因组 SSR侧翼序列更加保守 ,所以
EST-SSR标记一般较基因组 SSR标记具有更高的通用
性 [ 16] 。该研究中发现 ,不同引物的通用性存在很大差异 ,如
引物 S3和 S9在所有供试材料中都不能进行有效扩增 ,而引
物 S17和 Contig18能在供试的 17个材料中进行成功扩增 ,表
明不同的 EST-SSR引物间其侧翼序列的保守性可能存在
差异 [ 17] 。
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