全 文 ：中国农学通报 2013,29(18):127-131
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：中国热带农业科学院基本科研业务费（1630032012044）。
第一作者简介：肖勇，男，1980年出生，湖北荆州人，助理研究员，博士，研究方向为热带油料作物分子生物学。通信地址：571339海南文昌文清大道
496号中国热带农业科学院椰子研究所，Tel：0898-63330917，E-mail：xiaoyong1980714@gmail.com。
通讯作者：杨耀东，男，1966年出生，福建厦门人，研究员，博士，研究方向为热带油料作物分子生物学。通信地址：571339海南文昌文清大道496号
中国热带农业科学院椰子研究所，Tel：0898-63330602，E-mail：yangyd@tocri.com。
收稿日期：2012-06-25，修回日期：2012-08-25。
油棕CBF基因的克隆及与禾本科植物CBF基因的进化关系
肖 勇 1,2，杨耀东 1,2，曹红星 1,2，范海阔 1,2，雷新涛 1,2，乔 飞 3,4
（1中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌 571339；
2海南省热带油料作物生物学重点实验室，海南文昌 571339；
3农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南儋州 571737；
4中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州 571737）
摘 要：本研究致力于克隆油棕低温相应转录因子基因CBF。以NCBI网站上公布CBF基因设计引物，
对油棕的基因组进行扩增，并对其进行回收，转化和测序。总共测了11个克隆，测序结果显示这11个克
隆中有3个不同拷贝的CBF基因序列，它们序列之间的同源性分别是99%，92%和91%。将克隆的CBF
基因与不同物种的CBF基因进行了聚类分析，分析结果显示：这些不同物种的CBF基因可以分为3类，
克隆的油棕的 3个CBF基因被聚在一块，此外，油棕CBF基因与HvCBF1，OsDREB1E，HvCBF11以及
TaCBF11的同源性较高。采用同源序列法，克隆了 3个拷贝的CBF基因，通过Blast比对发现，克隆的
CBF基因与NCBI数据库现有的CBF基因具有很高的同源性。这些工作将为油棕抗寒的分子选育奠定
基础。
关键词：油棕；CBF基因；鉴定；抗冷性
中图分类号：Q7 文献标志码：A 论文编号：2012-2275
Isolation of CBF Gene and Their Phylogenetic Relationship with CBF Genes in Cereal Family
Xiao Yong1,2, Yang Yaodong1,2, Cao Hongxing1,2, Fan Haikuo1,2, Lei Xintao1,2, Qiao Fei3,4
(1Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang Hainan 571339;
2Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology, Wenchang Hainan 571339;
3Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China,
Ministry of Agriculture, P. R. China, Danzhou Hainan 571737;
4Tropical Crops Genetics Resource Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou Hainan 571737)
Abstract: A total of 11 clones were sequenced. Sequencing results showed that there were three copies of CBF
genes in the 11 clones, among which similarities were 99%, 92% and 91% respectively. Moreover, the three
cloned CBF genes were assigned with CBF genes from other different species. Assignment result showed that
the cloned CBF genes of oil palm were clustered together. Moreover, there was higher similarity between the
three cloned CBF genes of oil palm and HvCBF1, OsDREB1E, HvCBF11 as well as TaCBF11. Using
homologous cloning, three CBF genes were cloned. By blast search, the cloned CBF genes have high similar
with available CBF genes in NCBI website. The work will have a help for molecular selection of cold resistant
variety in oil palm.
Key words: oil palm; CBF gene; identity; cold resistance
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0 引言
油棕属多年生单子叶木本油料作物，其含油量一
般在50%以上，油棕每公顷产油量是椰子的2~3倍，是
花生的的7~8倍，因此油棕也被称为“世界油王”，中国
引种油棕已有80多年的历史，主要分布于海南、云南、
广东和广西。但是由于中国热区，如海南。冬季温度
较低，从而造成了油棕在海南冬季不开花或者花而不
实，严重影响了中国油棕的产量。
CBF基因是一种冷响应的转录因子基因。当植
物受到低温诱导后 ICE转录因子被激活，然后表达的
蛋白质与下游的CBF基因的启动子结合，诱导CBF基
因的表达，然后CBF基因表达的蛋白质与COR基因的
CRT/DRE启动子结合，诱导一系列COR基因的表达，
COR基因的表达产物参与植物的抗寒过程[1-2]。
CBF基因在拟南芥的基因组上一般有 4个拷贝，
它们分别是 CBF1、CBF2、CBF3和 CBF4。Gilmour
等[3]应用CBF1基因的核苷酸序列作为探针，与冷处理
的 cDNA文库进行杂交，分别克隆CBF2和CBF3。这
3个拷贝 CBF1、CBF2和 CBF3具有较高的同源性，
CBF2与CBF1的同源性为81%，CBF4与CBF1的同源
性为 84%[4]。因为这 3个拷贝的CBF基因具有很高同
源性，因而被认为它们具有共同祖先基因，在长期的进
化过程中，经过基因组加倍或者局域的复制，而产生3
个 CBF基因，由于突变而形成了 3个拷贝，CBF1、
CBF2和CBF3[5]。
在拟南芥中，CBF基因的超表达能够显著提高拟
南芥的抗寒性[6-8]，然而，采用RNA干涉以及反义RNA
技术，显著降低拟南芥在冷胁迫下CBF1和CBF3基因
的表达，同时发现，转基因植株的抗寒性显著降低[9]。
CBF1 和 CBF3 的 超 量 表 达 能 促 进 下 游 COR
(Cold-Responsive)基因的表达，这些COR基因能够调
节植物体内脯氨酸，蔗糖以及棉在糖的含量，从而调节
植物的渗透压，增强植物的抗寒性[10-12]。
中国曾经历油棕的引种试种，但以失败而告终，其
中的主要原因之一，就是引进的油棕品种很难适应海
南冬天的低温气候，在该研究中，尝试利用网络上公布
的CBF基因设计引物，并从油棕的基因组中克隆CBF
基因，这些工作将为油棕的抗寒的分子选育奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
室内试验在椰子研究所3楼分子生物学实验室进行。
1.2 油棕基因组DNA的提取
以大观园生长的油棕资源为实验材料，取中心生
长的幼叶，采用CTAB法提取油棕的基因组DNA。
1.3 PCR扩增
以NCBI网址上公布的油棕的CBF基因序列为基
础，为了能扩增全长的CBF基因，引物位于CBF基因
的5’和3’末端，涵括CBF基因的起始密码子和终止密
码 子 。 其 引 物 序 列 如 下 ：EgCBF2-For
5’-ATGGAGAGCTTCAGTAGCGACTCCT-3’；EgCB
F2-Re 5’-TCAAATGGAGTAGCTCCACAGTGAG-3’；
Eg-CnCBF1-For 5’-ATGGAGAGCTTCAGCAGCGA
CTCCA-3’；Eg-CnCBF1-Re 5’-TCAAATGGAGTAG
CTCCACAGTGAGAC-3’。10 μL的PCR反应体系为
（10 × PCR buffer：1 μL；25 mmol/L Mgcl2：0.8 μL；
10 μmol/L primer-For：0.5 μL；10 μmol/L primer-Re：
0.5 μL；dNTP：0.2 μL；5 U/μL Taq酶：0.2 μL）。PCR反
应程序为：95℃ 4 min；30个循环 (94℃ 1 min；58℃
1 min；72℃ 1 min)，72℃ 7 min。
1.4 PCR产物的回收、连接和转化
应用回收试剂盒回收 PCR产物，其回收试剂盒
为：EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit。然后
回收后的 PCR产物连接到AT克隆上，其连接载体为
pMD18-T。连接后的产物被转化感受态细胞，其转化
步骤为：（1）取感受态细胞，置于冰上融化 15 min；
（2）50 μL感受态细胞加上 5 μL连接产物，轻弹混匀，
冰上放置 30 min；（3）42℃水浴热激 90 s，迅速放冰水
混合中冷却 2~5 min；（4）加上 500 μL（不含Amp）LB
培养基，120 r/min，45 min；（5）固体培养基LB，100 mL
LB（加100 μL 100 mg/mL的Amp），倒平板，吹干水汽；
（6）45 min培养的感受态取出 8000 r/min，30 s，吸取
100 μL后去上清，菌液打匀后涂平板；（7）37℃，培养
16 h。
1.5 数据分析
序列分析采用生物学软件ClustalW。
采取CTAB法提取油棕的基因组DNA，为了能扩
增CBF全长序列，依据CBF基因的 3’和 5’末端设计
引物，引物包涵CBF基因的起始密码子和终止密码
子，并对提取的基因组DNA进行了PCR扩增，对主带
进行了挖带、回收。针对回收的PCR产物，进行了电
泳检测，紫外透射显示，2条清晰的带型可见。基于
此，将回收的PCR产物连接到 pMD18-T载体上，并将
其转化大肠杆菌，并将转化后的感受态细胞涂在LB
培养基上进行培养，16 h后，挑取了大约20个克隆，并
进行了PCR验证，验证结果显示，所挑取的 20个克隆
都为阳性，然后将这 20个克隆送往华大进行分子测
序。
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肖 勇等：油棕CBF基因的克隆及与禾本科植物CBF基因的进化关系
2 结果与分析
2.1 CBF基因的克隆
测序结果显示：20条序列中，存在着3种不同核苷
酸序列，它们之间的同源性较高，它们之间的同源性分
别是 99%，92%和 91%。将这 3条序列翻译成蛋白质，
将这3条序列与拟南芥的CBF1、CBF2、CBF3和CBF4
基因的蛋白质序列进行比对。在氨基酸序列的N端，
从第1个氨基酸到第30个氨基酸，不同的拷贝之间同
源性较低，在油棕的不同的拷贝之间变异较大，从第
40个氨基酸到114个氨基酸，其氨基酸序列非常保守，
而根据拟南芥的CBF基因，在第 50个氨基酸到 80个
氨基酸的区域，为CBF基因的保守结构域，即AP2转
录因子的保守结构域，由此可知，所克隆的3条序列都
为CBF基因，在C未端也存在着 5个氨基酸的保守区
域，氨基酸序列都为“VSLWSY”，除了AtCBF4的最后
一个氨基酸不是“Y”，而是“F”。
2.2 克隆的CBF基因与禾本科CBF基因的进化关系
下载了大麦的不同拷贝的 CBF基因，包括：
图1 克隆的油棕CBF蛋白与拟南芥CBF蛋白质的比对图
HvCBF1、HvCBF2A、HvCBF2B、HvCBF3、HvCBF4A、
HvCBF4B、HvCBF4B、HvCBF4D、HvCBF5、HvCBF6、
HvCBF7、HvCBF10A、HvCBF10B以及HvCBF13。水
稻的不同拷贝的 CBF基因：OsDREB1B、OsDREB1F
以及OsDREB1E。高粱的CBF5和CBF6基因，六倍体
小 麦 的 TaCBF2、TaCBF5、TaCBF6、TaCBF9 以 及
TaCBF11。二倍体小麦的TmCBF7。这些CBF基因可
以被分为三大类，其中大麦的 HvCBF3、HvCBF13、
HvCBF10A、HvCBF13、HvCBF16，玉米的 AF450481
和AF300970，水稻的OsDREB1D，高粱的 SbCBF6与
小麦的 TaCBF6基因被聚成第一类；然而，大麦的
HvCBF14、 HvCBF2A、 HvCBF2B、 HvCBF9、
HvCBF4A、HvCBF4B、HvCBF4C，水稻的OsDREB1B，
六倍体小麦的TaCBF2、TaCBF9、TaCBF14被聚到第二
类。大麦的 HvCBF1、HvCBF7、HvCBF11，水稻的
OsDBEB1E，六倍体小麦的 TaCBF11，二倍体小麦的
TmCBF7与克隆的 3个油棕CBF基因，O2-3、O2-6和
O2-7被聚到第三类。从该聚类图可知，不同物种、拷
贝的CBF基因并不是完全依据物种进行分类，不同物
种相同拷贝可能被聚在一块，如：六倍体小麦TaCBF11
和大麦的 HvCBF11 被聚到一块，二倍体小麦的
TmCBF7和大麦的HvCBF7基因被归于一类，此外，高
粱的 SbCBF5，六倍体小麦的 TaCBF5 和大麦的
HvCBF6也被聚在一块，等等，这种现象在聚类图中随
处可见，这说明了不同禾本科物种，相同拷贝的CBF
基因可能具有共同的祖先，它们的CBF基因拷贝的祖
先可能在禾本科物种分化之前形成，随着物种的形成
而分化，同时，也发现，相同物种的不同拷贝基因被聚
到一块，如：大麦的HvCBF4A、HvCBF4B和HvCBF4C
被聚在一块，同时大麦的HvCBF2A和HvCBF2B也被
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聚在一块，大麦的HvCBF10A和HvCBF10B也被聚在
一块，这些多拷贝的基因，可能是在物种形成后通过全
基因组的加倍或者通过区段的复制所产生的多拷贝，
然后再长期的进化过程中逐步分化。油棕的3个CBF
拷贝基因，O2-3、O2-6、O2-7也被聚在一块，这说明了
这 3个拷贝的油棕CBF基因，是在禾本科与棕榈科分
化后，这3个拷贝的油棕CBF基因才分化形成。
3 讨论
中国曾经历了多次油棕引种试验，但都因为多种
原因未能成功，其主要原因之一是中国海南对比油棕
的主要栽培国，气温偏低，油棕正常生长所需要的年平
均温度一般在21℃以上，在25~28℃之间，油棕的生长
较为适应，然而，当温度低于18℃时，油棕的生长显著
延慢，果实发育不良，产量显著减低。当气温低于15℃
时，油棕几乎停止生长。而在中国海南的东部、北部和
西部，虽然年平均温度在23~25℃之间，但是最冷月平
均温度一般在 17℃以下，有时候温度甚至可以低至
3℃。因而海南冬季的长期低温，是油棕低产的主要原
因之一。因而引进抗寒的油棕品种，对于提高中国油
棕的产量非常重要，然而油棕为多年生木本植物，仅仅
通过大规模的引进，然后进行适应性栽培筛选耐低温
的油棕品种，效率较低。然而如果分子途径进行初步
筛选，然后再进行适应性栽培，将大大提高筛选效率。
本研究致力于克隆油棕冷相应转录因子CBF基
因。CBF基因功能以及在抗寒机理所起的作用在许
多文献中已有相关报道，最早的相关报道是在菠菜中
的相关研究，Guy[13]在菠菜中发现了在冷驯化中起关
键作用的CRT/DREB1蛋白，并验证了CBF/DREB1蛋
白在植物抗冷机制中起关键作用。之后在拟南芥、油
菜、小麦、黑麦以及番茄中都有相关的报道，CBF蛋白
一 般 含 有 2 段 短 多 肽 序 列 ，即 PPK/RP2
AGRxKFxETRHP序列，直接位于AP2DNA结合域的
上游，可能与蛋白质运输相关[14-16]；而DSAWR序列则
位于AP2DNA结合域的下游[17]。在的研究中，克隆的
3个CBF基因中，也存在着上游的PPK/RP2结构域，而
对于AP2DNA结合域的下游DSAWR，油棕的 3个拷
贝CBF基因中变异较大，相对应的它们的氨基酸序列
分别是“DSSWL”和“DASWL”。这些研究都说明了克
隆的这 3条序列都为CBF基因，为后续的功能验证以
及分子标记辅助育种奠定基础。
4 总结
应用网络上公布的油棕CBF基因设计引物，在油
棕的基因DNA中进行扩增，克隆了 3个CBF基因，并
这些CBF基因与网络上公布的禾本科CBF基因进行
比对，比对结果显示：油棕 CBF基因与 HvCBF1，
OsDREB1E，HvCBF11以及 TaCBF11的同源性较高，
在将来的工作中，将进一步研究CBF基因的功能，以
及CBF基因的自然变异，为CBF基因的分子选育奠定
基础。
参考文献
[1] Jaglo K R, Kleff S, Amundsen K L, et al. Components of the
Arabidopsis C repeat/dehydration responsive element binding
factor cold response pathway are conserved in Brassica napus and
other plant species[J]. Plant Physiol, 2001, 127:910-917.
[2] Nakashima K, Yamaguchishinozaki K. Regulons involved in
osmotic stress-responsive and cold stress-responsive gene
expression in plants[J]. Plant Plantarum, 2006,126:62-71.
[3] Gilmour S J, Zarka D G, Strockinger E J, et al. Low temperature
图2 克隆的CBF基因与禾本科的CBF基因的聚类图
·· 130
肖 勇等：油棕CBF基因的克隆及与禾本科植物CBF基因的进化关系
regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional
activators as an early step in cold-induced COR gene expression[J].
Plant Journal, 1998, 16:433-442.
[4] 张丽丽,李景富,王傲雪.转录激活因子CBF基因在植物抗冷分子
机制中的作用[J].园艺学报,2008,35:765-771.
[5] Medina J, Bargues M, Terol J, et al. The Arabidopsis CBF gene
family is composed of three genes encoding AP2
domain-containing proteins whose expression is regulated by low
temperature but not by abscisic acid or dehydration[J]. Plant
Physiology, 1999,119:463-470.
[6] Jaglo-Ottosen K R, Gilmour S J, Zarka D G, et al. Arabidopsis
CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing
tolerance[J], Science, 1998,280:104-106.
[7] Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, et al. Two transcription factors,
DREB1 and DREB2, with EREBP/AP2 DNA binding domain
separate two cellular signal transduction pathways in drought- and
low-temperature-responsive gene expression, respectively, in
Arabidopsis[J]. Plant Cell, 1998, 10:1391-1406.
[8] Gilmour S J, Fowler S G, Thomashow. Arabidopsis transcriptional
activators CBF1, CBF2, and CBF3 have matching functional
activities[J]. Plant Mol Biol, 2004, 54:767-781.
[9] Novillo F, Medina J, Salinas J. Arabidopsis CBF1 and CBF3 have a
different function than CBF2 in cold acclimation and define
different gene classes in the CBF regulon[J]. Proc Natl Acad USA,
2007,104:21002-21007.
[10] Thomashow M F. So what’s new in the field of plant cold
acclimation? Lots[J]! Plant Physiol, 2001,125:89-93.
[11] Sung D Y, Kaplan F, Lee K J, et al. Acquired tolerance to
temperature extremes[J]. Trends Plant Sci, 2003,8:179-187.
[12] Penfield S. Temperature perception and signal transduction in plants
[J]. New Phytol, 2008,179:615-628.
[13] Guy C L, Cook D, Riechmann J L, et al. Transcription factor CBF4
is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis[J]. Plant
Physiology, 2002, 130:639-648.
[14] Blackwell T K, Huang J, Ma A, et al. Binding of myc proteins to
canonical and noncanonical DNA sequence[J]. Mol Cell Biol, 1993,
13:5216-5224.
[15] Liu Q, Masuga M, Sakuma Y, et al. Two transcription factors,
DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain
separate two cellular signal transduction pathways in drought- and
low-temperature-responsive gene expression, respectively, in
Arabidopsis[J]. Plant Cell 1998,10:1391-1406.
[16] Thomashow M F. Components of the Arabidopsis C-repeat/
Dehydration responsive element binding factor cold-response
pathway are conserved in Brassica napus and other plant species[J].
Plant Physiology, 2001,126:910-917.
[17] Novillo F, Jose M A, Joseph R, et al. CBF/DREB1C is negative
regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression and
plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis[J]. Plant
Biology, 2004,11:3885-3900.
·· 131