全 文 ：细胞色素 P450在茄科作物中的研究进展
张 昊1 , 戴素明 2 , 谢丙炎 3
( 1湖南农业大学农学院 ,长沙 410128; 2湖南农业大学生物安全科技学院 ,
长沙 410128; 3中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ,北京 100081)
摘 要: 细胞色素 P450在生物体中起着重要的作用。近些年来 ,植物细胞色素 P450的研究得到快速的进展。归纳了已克隆
的茄科类 P450基因 ,并对其克隆方法和功能等研究情况进行了综述。
关键词: 细胞色素 P450; 基因 ; 茄科 ; 克隆
中图分类号: Q788 文献标识码: A 文章编号: 1001-5280( 2007) 02-0132-05
细胞色素 P450 ( Cy to chrome P450,以下简称
P450)是一类与重金属结合的配体 ,形成的酶在生物
细胞通过可逆性的变化而进行电子传递。 因它与一氧
化碳结合后 ,在 450 nm处有吸收峰 ,故有此名。 P450
不仅在脊椎动物或无脊椎动物 (包括昆虫 )和微生物中
存在 ,而且在植物中也广泛存在。 至今 ,已从 111种植
物中获得 1 052个植物 P450基因。根据国际细胞色素
P450基因命名委员会的规定:同源性大于 40%的 P450
基因划为一个家族 ,同源性大于 55%的 P450基因划为
一个亚家族 ,已克隆的植物 P450基因分属于 CYP51,
CYP71— CYP99, CY P701— CYP706家族。植物 P450
在植物体中担当着重要的功能 ,可以催化许多次级代
谢反应 ,已知的催化反应已超过 50种 ,反应底物包括
脂类、苯、丙烷类、黄酮类、萜类、生物碱、生氰糖苷等内
源性化合物以及包括农药、除草剂等在内的外源物
质 [1 ]。本文重点对茄科作物的 P450基因的研究情况作
一综述。
1 P 450基因的克隆策略
茄科类 P450基因的克隆策略与昆虫 P450基因的
克隆策略 [2 ]相比 ,二者有着相似之处。 但作为植物
P450,其又有着不同之处。
( 1)纯化 P450蛋白 ,制备抗体以筛选 cDN A表达
文库。 此方法对植物 P450的克隆 ,同样受限于蛋白质
的分离纯化技术。现今 ,仅 CYP 74B 1通过该方法获
得 [3 ]。
( 2)用已知的植物 P450基因为探针筛选 cDN A文
库或基因组文库。此方法使得茄科类 P450基因的克隆
速度大大加快。探针不仅可以从茄科植物已克隆的
P450基因中选择 ,也可以从其它植物 (拟南芥 )中选
收稿日期: 2007-03-21
作者简介:张 昊 ( 1980- ) ,男 ,湖南益阳市人 ,助教 ,从事
植物基因工程研究。
择 [4 ]。 然而 ,探针有时与筛选的基因并不属于同一家
族。 Naoyuki等以茄子 CY P 75A 2基因的部分片段为
探针 ,从其基因组文库中筛选出 3个 CY P71家族成员 ,
即 CYP 71A 2,CYP 71A 3和 CYP 71A 4。与 CYP75同源
性比较 ,其值最高达 35% [5 ]。
( 3) 同源序列法。 同其它生物一样 ,植物 P450基
因也含 有一段血红 素结合区域 ( Heme-binding
region)。 根据这段保守氨基酸序列设计简并性引物 ,
并用简并引物对 cDN A文库进行 PCR扩增 ,再以 PCR
产物为探针 ,对 cDN A文库进行筛选 ,或采用 cDN A末
端快速扩增 ( RACE)途径 ,从而得到全序列 P450
cDN A
[6 ]。由于同源序列并不专属于 P450基因某一家
族 ,因此扩增产物不一定属于同一家族。 Lyle等从烟
草中同时克隆分属于 4个家族的 6个基因 ,即
CYP 71D20和 CYP 71D21,CYP 73A 27和 CY P 73A 28,
CYP 82E 1和 CYP 92A 5[7 ] 。对于大多数 P450基因 ,血
红素结合区域的氨基酸序列为 P-F-G-X-G-R-R-X-C-
X-G。但植物 P450有两个家族 CYP72和 CY P74例
外 [8 ]。对于克隆 CYP72家族基因 ,我们应该设计其它
引物 ,或者在低严谨条件下进行 PCR扩增。 对于克隆
CYP74家族基因 ,由于其血红素结合区域与大多数
P450的相似度太低 ,因此设计的简并性引物不适合
CYP74基因的克隆。
2 已克隆的茄科类P 450基因
茄科植物有很多种 ,目前 P450基因主要来自辣
椒、茄子、烟草、马铃薯和番茄 5种作物 ,已克隆 P450
的 cDN A和片段的总数为 56个 (表 1) ,仅占整个植物
P450基因的 7. 5% 。 这些 P450基因主要分属于
CYP71, CYP72, CY P73, CY P74和 CYP75等 14个家
族。其中 , CYP71最多 ,共有 15个 ,其次是 CYP74,共有
12个。 在 5种茄科作物中 ,以烟草和番茄中克隆的
P450基因占多数。
132 CROP RESEARCH 2007( 2)
表 1 已克隆的茄科植物P 450基因一览
作 物 基因名称 序列长度
( bp)
Genbank /
EM B编号
参考
文献
辣 椒 CY P 71D19 1781 AF122821 [ 12 ]
CY P 73A 21 1654 AF088847
CY P 74B 1 1647 U51674 [ 3]
CY P 701A4 257 AA840770
茄 子 CY P 71A 2 1744 D14990 [ 5]
1747 X71654
CY P 71A 3 1096 X70982 [ 5]
CY P 71A 4 1724 X70981 [ 5]
CY P 75A 2 1696 X70824 [ 19 ]
CY P 76A 1 1571 X71658
CY P 76A 2 1827 X71657
CY P 77A 1 1683 X71656 [ 8]
CY P 77A 2 1673 X71655 [ 8]
烟 草 CY P 51nt 1913 AF116915 [ 9]
1725 AY065641
CY P 71b-lik e 3890 AF166332 [ 29 ]
CY P 71D16 589 BF459990
3890 AF166332 [ 30 ]
CY P 71D20 1660 AF368376 [ 7]
CY P 71D21 1614 AF368377 [ 7]
CY P 73A 27 192 CD002916
1745 AF368378
CY P 73A 28 1693 AF368379
> CYP 74A 1 1761 AJ295274 [ 31 ]
CY P 82E 1 664 BF153877
1727 AB015762 [ 20 ]
CY P 92A 2 1628 X95342 [ 27 ]
CY P 92A 3 3702 X96784
CY P 92A 5 1530 AF368380
CY P 94A 4 1722 AF092915
CY P 94A 5 1742 AF092916 [ 28 ]
CY P 94A 6 1869 AF092913
马铃薯 CY P 71D4 1701 AJ296346
CY P 71D6 1641 U48434 [ 6]
CY P 71D7 588 CA759863
683 CA759864
3107 U48435 [ 6]
CY P 72A 29 1813 AB067685
CY P 74D2 1437 AJ309541 [ 17 ]
番 茄 CY P 72A 30 1734 AF249329
CY P 73A 18 202 Z70216 [ 32 ]
CY P 74A 1 1865 AJ271093
CY P 74A 2 592 BF153934 [ 4]
1721 AF230371
CY P 74B 3v 1 1440 AJ239065 [ 4]
CY P 74B 3v 2 1840 AF230372 [ 4]
CY P 74C3 1772 AF454634
CY P 74C4 516 CA847636
1755 AF461042
CY P 74D1 1631 AF317515 [ 16 ]
CY P 84A 2 1960 AF150881
CY P 84A 498 AI772808
CY P 84A 368 AI894552
CY P 85A 1 1023 AI943419
110 CA901110
1395 U54770 [ 24 ]
3 茄科类P 450的基因功能
目前 ,植物 P450基因功能的研究情况 ,同昆虫
P450一样存在同样的问题。许多 P450仅获得部分片
段 ,没有明确的功能 ,难于深入研究 ,且有些 P450基因
至今还停留在全基因的获得 ,功能尚无详细研究。 在
此 ,参照其它植物 P450,对茄科 P450各家族的基因功
能做一归纳。
CYP 51: 已从烟草中克隆两个 CYP51基因 , 即
N tCYP 51-1和 N tCYP 51-2。二者具有 97%的同源性 ,
与其它植物 CYP51基因的同源性达 75%左右 [9 ]。从不
同生物类群的 P450分析发现 ,细菌、真菌、动物和植物
中都存在 CY P51基因。CYP51在各生物类群中的代谢
作用 ,即固醇的 14-脱甲基作用是保守的 ,但在各生物
类群之间 CYP51催化反应的底物各不相同。 植物
CYP51催化的底物是钝叶鼠曲草醇 ( obtusi to liol) ,其
功能已通过体外重组酶得到证实 [10, 11 ]。烟草 CYP51基
因的功能也已通过基因水平调控固醇合成途径在植株
中得到体现 [9 ]。
CYP 71: CY P71通过基因重复形成 P450基因簇 ,
是所有植物 P450中最大的家族。CYP 71A 1是从鳄梨
(Persea americana )的中果皮中克隆出的第一个植物
P450基因 ,但关于 CYP 71A的功能仍不十分清楚。通
过 Northern杂交分析 , CY P71不参与花色素苷的合
成 ,而与组织的成熟有关 [5 ]。关于 CYP 71Ds的功能报
道却有不少。茉莉酸甲酯 ( M JA)和脱落酸 ( ABA)诱导
马铃薯 CY P 71D6和 CYP 71D7微弱表达 ,表明可能与
一些胁迫诱导、缓慢积累的次生代谢物的合成有关 [6 ]。
炭疽病不亲和小种 (Colletotrichum gloeosporioides )
诱导辣椒表达 CY P 71D19,其编码产物在病菌侵染果
实表皮时起保护作用 [12 ]。从烟草克隆的 CYP 71D20基
因 , 其 离体 活性 (催化 5-epi-a ristolochene 和 1-
deoxycapsidiol形成甜椒醇 )已有报道 [ 7]。
CYP 72: 茄科植物已克隆 2个 CYP72基因 ,即
CYP 72A 29和 CYP 72A 30。关于基因的功能报道很少 ,
只有实验证明 CYP 72A 29基因的表达活性受植物激
素调控 [13 ]。从长春花 (Catharanthus roseus ) 克隆的
CYP 72A 1基因 ,已证明其是一种环氧化酶 ,催化单萜
类吲哚生物碱的生物合成 ,推测 CYP72可能涉及单萜
或吲哚生物碱的合成 [14 ]。
CYP 73:关于茄科 CYP73基因功能的资料尚无获
悉。从拟南芥中克隆的 CYP 73A 5基因已证实是肉桂
酸 -4-羟化酶 ,参与苯丙烷代谢途径的第二步反应 ,其
离体活性已有报道 [15 ]。
1332007年 第 2期 作 物 研 究
CYP 74:与其它 P450比较 , CYP74具有许多异常
的特征:其酶无需氧可催化脂肪酸过氧化物形成丙二
烯氧化物或挥发性物质 ;其 cDN A序列在 P450血红素
结合域的保守序列处 ,有一些明显的氨基酸残基替换 ;
在 N-末端氨基酸序列类似质体或线粒体的运送肽。在
CYP74家族中 ,关于 74A, 74B和 74D的研究比较多。
有趣的发现: 丙二烯氧化物合酶 ( AO S)基因、氢过氧
化物裂解酶 ( HPO /HPL)基因和 DES( Diviny l Ether
Synthase)基因分属于 74A, 74B和 74D三个家族。 ①
AO S可以转化由脂肪氧合酶催化衍生的脂肪酸氢过
氧化物成不稳定的丙二烯氧化物。丙二烯氧化物是植
物中非常重要的脂类中间体 ,在植物体内可以经酶催
化转化为植物信号分子茉莉酸。目前 ,茄科植物中只在
番茄和烟草中 ,分别发现 CY P 74A 2和 CY P 74A 1具有
AO S活性。② HPO也利用由脂肪氧合酶产生的不饱
和脂肪酸的氢过氧化物为底物 ,催化形成的产物 (醛或
醇 )构成果实和蔬菜挥发物成分 ,在植物的相互作用中
发挥作用。从番茄中克隆的 CYP 74B 3V 2基因 ,其 HPO
活性已在大肠杆菌中表达 [4 ]。③ DES参与脂肪酸代谢
的另一途径—— 二乙烯醚合成途径 ,催化脂肪酸氢过
氧化物形成二乙烯醚。 该活性已通过茄科作物的两个
74D基因 (CYP 74D1和 CYP 74D2)得到证实 [16, 17 ]。二
乙烯醚虽然在生物体内的功能还不十分的明确 ,但有
报道其在植物对疫霉的抗性中起着重要的作用 [18 ]。
CYP 75:在茄科植物中现仅获得一个属于 CYP75
家族的基因 (CYP 75A 2)。通过改变光源 , 发现
CYP 75A 2同合成花色素苷的基因 (如 CHS和 DFR )
一起大量表达 ,且其分布同 CHS和 DFR一样具有组
织特异性 ,仅在茄子下胚轴中分布。另外 ,在牵牛花花
蕾发育中期 ,也检测到该基因大量表达。CYP 75A 2这
种分布的特异性是与花色素苷的分布相关 ,推测该基
因编码羟化酶 ,参与花色素苷的合成 [19 ]。
CYP 76:已从茄科植物中克隆 2个 CYP76基因 ,但
关于其基因功能的资料尚未获得。
CYP 77:目前仅从茄子中获得两个 CYP77基因 ,
即 CYP 77A 1和 CY P 77A 2。其中 ,CYP 77A 1具有类黄
酮 B-环羟化酶活性已有实验证实。另外 ,通过改变光
源 ,发现 CYP 77A 1同合成花色素苷的基因一起大量
表达 ,推测 CYP 77A 1也有可能参与花色素苷的合
成 [8 ]。
CYP 82:从 Phytophthora in f estans的细胞壁成分
处理的烟草叶中获得特异表达的 CYP 82E 1基因。该基
因 能 在 大 豆 病 原 菌 Pseudomonas sy ringae pv .
Glycinea侵染的烟草中大量表达 ,而在烟草病原菌 P .
syringae pv. Tabaci侵染的烟叶中微弱缓慢地表达 ,
表明 CYP 82E1与烟草的抗病性相关 [20 ]。
CYP 84:关于茄科 CYP84基因的功能尚无报道 ,
仅拟南芥 CYP 84A 1基因有研究报道 ,其表达与木质
素生物合成的定量以及发育调控有关。研究发现 ,相比
CaMV 35s启动子 , C4H启动子更能提高 CYP 84A 1的
表达效率 [21 ]。因此 ,CY P 84A 1可作为高等植物调控木
质素合成的选择靶标 [22 ]。 目前 ,该基因已在酵母中表
达 ,发现其催化的底物不仅包括阿魏酸 ,还有松柏醛和
松柏醇 [23 ]。
CYP 85:根据同源性关系 ,植物 P450基因主要分
为两大类: A型和非 A型。 大多数参与次生代谢物或
天然产物的生物合成的 P450都属于 A型 ,是植物特有
的。非 A型则是由具有很大分歧的序列构成 ,分为许多
独立支 ,其同源性更接近非植物类 P450。 Bishop等采
用筛选突变体的方法从番茄中获得一个非 A型 P450
基因 ,命名为 CYP 85A 1[ 24] 。 其突变体表型矮化 ,推测
CYP 85A 1可能涉及激素的合成。CYP 85A 1[25 ]和拟南
芥 CYP 85A 1s[26 ] 已在酵母重组体中得到表达 ,证实
CYP 85A 1在油菜素类固醇的合成中催化两步连续的
C6氧化反应。
CYP 92: Pierre等从 Pseudomonas solanacearum
侵染的烟草中获得两个过敏性反应相关基因 Hsr 515
和 Hsr 201。通过同源性比较 , Hsr 515是 P450(命名为
CYP 92A 2) ,与 CYP 71A 1的同源性很高。然而 ,在烟草
老化组织中没有检测到 Hsr515, 由此初步认为
Hsr 515在与病原菌不亲和互作的植株中优先表
达 [27 ]。
CYP 94:从烟草 cDN A文库中筛选获得 CYP 94A 5
基因 ,实验证明其参与脂肪酸的羟基化 ,形成ω-乙醇和
二元酸 [28 ]。
4 结 语
分子生物技术的发展使得许多植物 P450得到分
离。其中 ,从拟南芥中分离的 P450基因最多 ( 272个 ) ,
基本上分属于植物 P450的各个家族 ,体现了 P450在
生物体内的多样性。相比之下 ,已分离的茄科 P450基
因数目少 ,尚存在许多家族的 P450基因未知 ,所以基
因的克隆仍是茄科 P450研究的一个热点。 今后 ,我们
应该充分利用已发现的 P450基因资源 ,通过分析近缘
作物间 P450基因的同源性 ,获得其它茄科作物的 P450
基因 ;通过从拟南芥中获得的基因作为探针 ,挖掘茄科
作物尚未发现的家族。在克隆策略方面 ,随着基因克隆
的策略方法已日臻完善和多样化 ,我们需从中借鉴使
134 CROP RESEARCH 2007( 2)
茄科类 P450基因的克隆更加有效。
细胞色素 P450基因的分离加速了人们对其功能
的认识。通过功能分析 ,茄科类 P450在植物的次生代
谢的合成方面有着非常复杂而广泛的功能。其中 ,与植
物防御反应相关的 P450基因为研究茄科作物的抗病
性提供了新的亮点。它们在抗病原物有关物质的合成
中起重要作用 ,有的催化形成植保素 (甜椒素 ) ,抑制对
植物有致病作用的微生物的生长 ;有的催化形成胁迫
信号 (茉莉酸 ) ,活化植物的抗病性。由此 ,这些 P450基
因有待开发利用 ,作为提高茄科作物抗病性的调控靶
标。此外 ,在茄科作物中 ,一些 P450经鉴定在植物防御
反应中优先表达 ,但关于它们的具体功能尚处于研究
空白 ,还有待今后更深入的研究。
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月底移栽 ,要充分发挥其高产潜力 ,栽植规格宜采用
16. 7 cm× 23. 3 cm ,每穴插 5～ 6苗 ,以保证每公顷大
田栽基本苗 120万～ 150万 ,为中后期建立穗、粒最佳
群体结构奠定强大基础。
3. 3 科学施肥 ,保证正常生长发育
Ⅱ优 231根系发达 ,叶片挺直 ,茎秆粗壮 ,抗倒伏 ,
营养优势强 ,对肥料需求量较大。做到重施有机肥 ,适
当施氮并增施磷钾肥 ,保证其正常生长发育对肥料的
需求 ,是发挥该组合优质高产潜力的重要措施。要求施
肥水平以每公顷 160～ 165 kg纯氮为宜 ,其中氮磷钾
比为 1. 0∶ 0. 6∶ 1. 0,总肥量中农家肥占 50%～ 55% 。
后期切忌氮肥用量过多 ,以防贪青晚熟。各生育期肥料
施用比例:底肥占 65% ,分蘖肥占 30% ,穗肥 (抽穗前 7
～ 10 d)占 5% 。
3. 4 合理管水 ,综合防治病虫害 ,适时收割
本田前期浅水返青 ,薄水分蘖 ,中期勤露轻晒 ,保
证每公顷有效穗 240万～ 260万 ,后期浅水抽穗、灌浆 ,
湿润壮籽成熟。根据当地病虫预测预报 ,注意稻瘟病、
纵卷叶螟、稻飞虱等病虫害的综合防治。该组合后期落
色好 ,不早衰 ,应在籽粒十成黄时适时收割 ,确保增产
增收。
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