全 文 ：西北农业学报 2011 , 20(6):160-163
Acta Agriculturae Boreali-occidentalis S inica
罂粟科 3种植物叶片生物碱抗氧化活性比较＊
薛 丹 ,闫桂琴 ,郭彩珍
(山西师范大学 生命科学学院 ,山西临汾 041004)
摘 要:为比较罂粟科 3 种植物叶片中生物碱的抗氧化活性 , 采用体积分数为 80%乙醇浸提博落回 、角茴香
和秃疮花 3 种植物叶片中的总生物碱 , 用常见生物碱显色反应检测 , 利用硅胶柱层析纯化 ,并且用邻苯三酚自
氧化法测定其超氧阴离子的清除效果 , 番红花红 O-Mn2+-H2O 2 光度法测定其对羟基自由基的清除效果 , 总
生物碱的还原性。结果表明 , 3 种总生物碱对这两种自由基有较好的抗氧化活性 , 角茴香对羟基自由基的清
除作用较强 , IC50为 0.170 g/ L。当质量浓度为 1 g/ L 时 ,秃疮花对超氧阴离子的清除率 92.09%, 3 种植物的
总生物碱都有还原性 , 但效果都不如硫脲。
关键词:博落回;角茴香;秃疮花;总生物碱;抗氧化
中图分类号:Q505 文献标志码:A 文章编号:1004-1389(2011)06-0160-04
Antioxidant Activity Comparison of Total Alkaloids from
Leaves of Three Papaveraceae Plants
XUE Dan , YAN Guiqin and GUO Caizhen
(Sch ool of Life S cien ce , Shanxi Normal University , Linfen S hanxi 041004 , China)
Abstract:Fo r compare ant ioxidant activi ty o f the total alkaloids f rom three plants leaves of Papaver-
aceae .In this study , the to tal alkaloids w ere ext racted by immersing in 80% alcohol f rom the leaves o f
M acleaya co rdata , Hypecoum erectum and Dicranost igma leptopod um , and puri fied by column chro-
matog raphy on silica gel.The antio xidant activit ies of to tal alkaloids w ere tested w ith three parame-
ters , such as the scavenging of hydro xy l radicals , superoxide anion and reducing pow er.The results
showed that three types of the total alkaloids can eliminate hydroxyl radicals and superox ide anion.
The alkaloid had elimination ef fect of ·OH and the IC50 of hypecoum erectu w as 0 .170 g/ L.When the
concentration of to tal alkaloids w as 1 g/L , the scavenging rate of O 2 - could reach to 92.09 %.All o f
the total alkaloids po ssess st ronger reducing pow er , but the ef fect is no t as thiourea.
Key words:Macleaya cordata (Willd.)R.Br;Hypecoum erectum L .;Dicranost igma leptopodum
(Maxim.)Fedde;To tal A lkaloid ;A ntioxidation
生物碱是主要存在于植物体内 、结构复杂 、具
有生理活性的含氮碱性物质 ,具有抗癌 、清除自由
基 、抗氧化等多种生物活性及药理作用 ,对人类的
衰老 、肿瘤 、心血管等疾病的治疗和预防也具有重
要意义[ 1] 。博落回[ Macleaya cordata (Willd .)
R.Br] 、角茴香(H ypecoum erectum L .)和秃疮花
[ Dicranost igma leptopodum (Maxim.)Fedde ,
DLF]这 3种植物同属罂粟科 ,有研究表明[ 2-4] ,其
植物体内所含生物碱丰富且均有消炎杀菌的作
用 ,但国内对其抗氧化活性却鲜有报道。因此 ,本
试验对这 3种植物叶片中总生物碱的体外抗氧化
活性进行研究 ,为科学合理的开发利用植物资源
提供科学依据。
＊收稿日期:2010-10-22 修回日期:2010-12-02
基金项目:山西省自然科学基金项目(2008011058-1)。
第一作者:薛 丹 ,女 ,在读硕士 ,从事植物学研究。 E-mai l:xuedan 2008@163.com
1 材料与方法
1.1 试 材
博落回 、角茴香和秃疮花的叶片 , 2010-05 采
自山西乡宁云丘山 ,选择完整健康的叶片洗净 ,
45 ℃烘干备用。
1.2 方 法
1.2.1 生物碱的提取分离 将采集的 3种植物
叶片烘干 、粉碎后称取 100 g ,用 80 mL 乙醇和
2 mL浓盐酸加水定容到 100 mL 制成超声波提取
液[ V(固)∶V(液)=1 ∶4] , 50 ℃下超声提取
3次 ,每次 1 h ,过滤 ,合并提取液 ,减压浓缩 ,得浸
膏 。浸膏用体积分数 5%的盐酸溶解 ,过滤 ,合并
酸溶解液;用氯仿萃取 3次 ,合并浓缩氯仿层 ,为
总碱Ⅰ ,酸水层再加浓氨水调 pH 为 11 ,正丁醇
萃取 3次 ,合并正丁醇提取液 ,浓缩正丁醇相 ,为
总碱Ⅱ ,所得所有固体用甲醇溶解 ,通过硅胶柱层
析[ 5] 。博落回以 V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(二乙
胺)=20∶1 ∶0.2 的流动相进行洗脱[ 6] ,角茴香
和秃疮花以 V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(二乙胺)=
15 ∶1 ∶0.2 的流动相进行洗脱 , 每 7 mL 作为
1个流份 ,逐步加大洗脱剂极性 ,以改良碘化铋钾
作显色剂进行检测 ,反应呈阳性的合并 ,浓缩得固
体并称量 ,备用。
1.2.2 总生物碱对超氧阴离子清除率的测定
采用略有改进的邻苯三酚自氧化法[ 7] 测定 , 取
pH 8.2的 50 mmo l/LTir s-HCl缓冲液 4.5 mL ,
再分别加入 0.1 mL 质量浓度分别为 0.2 、0 .4 、
0.6 、0.8 、1.0 g/L 的样液于比色管中 ,充分混匀 ,
25 ℃水浴中恒温 20 min ,立即加入 5 mmol/ L 的
邻苯三酚 0.3 mL(25 ℃预热),迅速摇匀后 , 在
320 nm 下以精确的 6 min作为反应时间 ,然后立
即扫描 ,测定吸光度。以等体积 10 mmol/ L 的
HCl代替邻苯三酚作空白 , 0.1 mL 蒸馏水代替
样品及 5 mmol/L 的邻苯三酚0 .3 mL 作为对照 ,
作吸光度随时间的变化曲线 ,算出其回归方程 ,斜
率为邻苯三酚的自氧化速率(v),按下式计算样品
对 O -2 的清除率 。每组试验重复 3次取均值。清
除率=[ v(对照)-v(样品)] / v(对照)×100% 。
1.2.3 清除羟基自由基(·OH)活性的测定
参照番红花红 O-Mn2+-H 2O 2 光度法[ 8] , 由于
MnSO 4-H2O2 体系产生羟自由基 ,氧化番红花红
O使其褪色 ,导致吸光度降低;而氧化剂与·OH
反应可以清除此自由基 ,使与番红花红 O 反应的
自由基量减少 ,从而使吸光度降低程度减弱。取
10 mL 比色管依次加入 0.2 mol/L H 2SO4溶液
0.7 mL 、0.4 mmol/L M nSO 4溶液 1 .6 mL 、质量
分数为 0.03%番红花红 O 溶液 0.8 mL 和体积
分数为 0.3%H 2O 2 溶液(现配现用)1.20 mL 作
为反应体系 ,依顺序加入 1 mL 不同质量浓度的
总生物碱溶液 ,加蒸馏水稀释至刻度 ,摇匀 ,放置
10 min ,以蒸馏水代替样品作为对照 ,在 518 nm
波长处测定吸光度 。番红花红 O 和硫酸定容到
10 mL 作为空白对照 ,其吸光度为 A ,加入样品后
的吸光度为 AS ,对照吸光度为 A0 。每组试验重
复 3次取均值。用以下公式计算羟自由基清除
率 ,清除率=(AS -A)/ (A0 - A)×100 %。
1.2.4 还原力的测定 铁氰化钾[ K 3Fe(CN)6 ]
与弱酸混合得到铁锈指示剂 ,遇到经硫脲还原得
到的亚铁离子会变蓝 ,可用于检测金属的氧化程
度 。以同样质量浓度硫脲作为对照品 ,取 0.5 mL
样液(空白用等量蒸馏水代替),加入 10 mL 比色
皿中 ,加入质量分数为 1%铁氰化钾溶液 2.5
mL ,0 .2 mol/L(pH 6.6)的磷酸缓冲溶液(PBS)
2.5 mL ,混匀 ,50 ℃下保温 20 min ,再加入质量
分数为 10 %三氯乙酸(TCA)溶液 2 .5 mL ,振荡
混匀后 4 ℃、4 000 r/min离心10 min 。取上清液
2.5 mL ,加入 2.5 mL 蒸馏水和质量分数为0.1 %
FeCl3 溶液0 .5 mL ,静置 10 min后体系溶液由黄
色变为蓝色 ,空白调零后 ,在 700 nm 下测定吸光
度[ 9] 。每组试验重复 3次取均值 。
1.2.5 数据处理 用 SPSS 软件对于试验选取
的 5个总生物碱质量浓度 ,在 P=0.05水平下进
行单因素方差分析 ,并利用此软件对 IC50(生物碱
半抑制质量浓度)进行分析 。
2 结果与分析
2.1 总生物碱对超氧阴离子的清除作用
由图 1可以看出 , 3种植物的总生物碱对超
氧阴离子都有清除作用 ,且随着质量浓度的增加
而加强 。对数据进行统计 ,以清除率 d 对质量浓
度ρ作自然对数曲线拟合 ,得到角茴香的回归方
程为 d =9 .513 3ln(ρ)+ 78.617 ,相关系数 r =
0.990 1 ,决定系数 R2 =0.980 3 ,根据此方程计算
IC50为 0.125 g/ L;秃疮花的回归方程为 d =
24 .228ln(ρ)+88.579 ,相关系数 r=0 .986 3 ,决
定系数 R2 =0 .972 8 ,根据此方程计算 IC50为
0.188 g/L , 博落回的回归方程为 d =26.417
·161·6 期 薛 丹等:罂粟科 3 种植物叶片生物碱抗氧化活性比较
ln(ρ)+64 .239 ,相关系数 r =0.987 0 ,决定系数
R2 =0 .974 3 ,根据此方程计算 IC50为 0.655 g/ L ,
表明这 3条曲线拟合完好 ,在总生物碱质量浓度
为 0.58 g/ L 之前 ,角茴香的清除超氧阴离子能力
较强 ,清除率为 72.2%,但在此之后 ,随着质量浓
度的增加 ,秃疮花的清除能力比角茴香增强的快 ,
清除率为 92.09%,说明低质量浓度时 ,角茴香的
清除能力较强 ,而秃疮花高质量浓度总生物碱的
清除能力强。
2.2 总生物碱对羟基自由基的清除作用
由图 2可以看出 ,在低质量浓度时 , 3种植物
的总生物碱都有较强的清除能力 ,随着质量浓度
的增大而增强 ,但角茴香中总生物碱的清除率从
0.2 g/L 到最大值变化较缓慢 。对数据进行统
计 ,以清除率 d 对质量浓度ρ作自然对数曲线拟
合 ,得到角茴香回归方程为 d =8.548 3ln (ρ)+
89 .562 , 相 关系数 r =0 .993 5 , 决定系 数
R2 =0.987 2 ,根据此方程计算 IC50为0.170 g/ L;
秃疮花的回归方程为 d =35.513ln(ρ)+91.095 ,
相关系数 r=0.997 1 ,决定系数 R2 =0.994 3 ,根
据此方程计算 IC50为 0.346 g/L;博落回的回归
方程为 d =29.836ln(ρ)+86 .701 , 相关系数
r =0.976 7 ,决定系数 R2 =0.954 ,根据此方程计
算 IC50为 0.324 g/ L ,表明这 3条曲线拟合完好 ,
说明角茴香叶片中的总生物碱清除羟基自由基的
能力是最强的 ,而其他两种相差不大 。
图 1 不同质量浓度的 3种植物叶片中总生物碱
对超氧阴离子的清除效果
Fig.1 Effect of variation concentrations of alkaloids from
the leaves of Macleaya cordata , Hypecoum
erectum and Dicranostigma leptopodum on
the scavenging of superoxide anion
2.3 总生物碱的还原力
物质的还原能力与其抗氧化活性之间有着明
显的相关性 ,还原能力的高低可以间接反映抗氧
化能力的强弱。由图 3可以看出 ,在总生物碱质
量浓度较低的时候 ,博落回和秃疮花的还原能力
较硫脲强 ,但差别极小 ,总生物碱质量浓度在 0.4
g/L 之后 ,虽然这 3种植物的总生物碱都具有较
强的还原能力 ,顺序依次为博落回>秃疮花>角
茴香 ,但其还原能力不如硫脲。
图 2 不同质量浓度的 3种植物叶片中总生物碱
对羟基自由基的清除效果
Fig.2 Effect of variation concentrations of alkaloids from
the laminae of Macleaya cordata ,Hypecoum
erectum and Dicranostigma leptopodum
on the scavenging of hydroxyl radicals
图 3 不同质量浓度的 3种植物叶片中总生物碱
的还原力和硫脲对照
Fig.3 Effect of variation concentrations of alkaloids from
the laminae of Macleaya cordata ,Hypecoum
erectum and Dicranostigma leptopodum on
reducing power, the thiourea is reference substance
·162· 西 北 农 业 学 报 20 卷
2.4 方差分析
对于试验所选取的 5个总生物碱质量浓度进
行单因素方差分析 ,角茴香试验组 、秃疮花试验组
和博落回试验组的 P 值均小于 0.05 ,有显著差异
性 ,而将其中任意两组进行两两比较 , P>0.05无
显著差异性。
3 小 结
本试验证明罂粟科这 3种植物叶片中的生物
碱有较强的清除活性 ,且都随着质量浓度的增大 ,
清除能力逐渐增强。对超氧阴离子清除效果中 ,
低质量浓度总生物碱溶液 ,角茴香的作用最强 ,而
高质量浓度则抑制 ,而高质量浓度总生物碱溶液
中秃疮花的清除能力增加的快 ,可能秃疮花中清
除超氧阴离子的生物碱类型在高质量浓度时作用
较强;对羟基自由基清除效果中 ,秃疮花和博落回
的清除能力基本相同 ,都比角茴香弱。与常见有
较强还原力的硫脲相比较 ,博落回在低质量浓度
时还原力较强 ,不排除杂质在低质量浓度时对还
原性的影响大于对高质量浓度的影响 ,但整体结
果不如硫脲。生物碱对自由基具有良好的清除活
性 ,对植物的充分生产利用提供价值 。
致谢:感谢我的导师闫桂琴教授 ,导师以渊博
的学识 、敏锐的科学洞察力 、严谨细致的治学态
度 ,在潜移默论中加深了我对科学的热爱 ,再次对
导师表示深深的谢意!
在整个学习和论文期间 ,得到闫教授 、张家铭
师兄悉心指导和教诲 ,以及我的同组同学郭彩珍
的支持 ,在此对他们表示诚势的谢意 !
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遗传距离
1910年 ,Morgen TH 提出假设:假定沿染色体长度上交换的发生具有同等的几率 ,那么两个基因
位点间的距离可以决定减数分裂过程中发生重组染色体的发生率 ,即重组分数 。重组分数的数值将随
着两位点间距离的增大而增大。它是构建物理遗传图谱的基础 ,也是利用连锁分析将基因序列从染色
体上搜寻出来的位置克隆法的基础。人们规定同一染色体上两个位点间在一百次减数分裂发生一次重
组的机会时 ,即Q =1/100时定义两位点间的相对距离为一个 cM(cent imo rg an)。人类基因组平均遗传
长度为 3 300 cM ,而DNA的平均物理长度为30亿对。染色体上各基因之间的交换率 ,即发生交换的百
分比 ,是不同的。基因之间的距离不同 ,两个基因靠的越近 ,其间染色体交叉的机会就越少 ,因而基因的
交换率越小 ,反之 ,交换率就越大 。基因的交换率反映了两基因之间的相对距离。根据基因在染色体上
有直线排列的规律 ,把每条染色体上的基因排列顺序(连锁群)制成图称为遗传学图(genetic map),亦
称基因连锁图(gene-linkage map )。
·163·6 期 薛 丹等:罂粟科 3 种植物叶片生物碱抗氧化活性比较