全 文 ：第35卷 第6期 水 生 生 物 学 报 Vol. 35, No.6
2011 年 11 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Nov. , 2 0 1 1

收稿日期: 2010-06-28; 修订日期: 2011-05-01
基金项目: 海洋公益项目(200805069); 国家自然科学基金(30700615)资助
作者简介: 李渊(1985—), 男, 山东省青岛人; 硕士研究生; 研究方向为海草分类学和居群遗传学。Tel: 0532-82032601; E-mail:
liyuan422@163.com
通讯作者: 高天翔, E-mail: gaozhang@ouc.edu.cn

DOI: 10.3724/SP.J.1035.2011.00900
基于 matK基因和 ITS序列探讨大叶藻科的系统发育关系
李 渊1 李文涛1 孙典荣2 高天翔1
(1. 中国海洋大学水产学院, 青岛 266003; 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所, 广州 510300)
摘要: 比较分析了 15 种大叶藻的 matK 基因和 ITS 片段的核苷酸序列, 结果发现胞嘧啶(C)在两个目的片段
上含量均较低。ITS 基因片段检测到 228 处核苷酸替换, 表现出丰富的遗传多态性; matK基因片段上有 249
处核苷酸替换, 且大部分替换来自于第三密码子的同义替换, 种间在氨基酸水平上产生了一定的分化。基于
matK 基因和 ITS 片段, 利用邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建的系统发育树结果基本一致,
明显分为 4大支, 大叶藻亚属、异叶藻属、拟大叶藻亚属和虾形藻属分别构成一支。大叶藻亚属和拟大叶藻
亚属的核苷酸差异值在 29.09%—35.51%, 超过了屈良鹄等提出的大部分被子植物 ITS 属间核苷酸差异值
(9.60%—28.80%), 在分子数据上两亚属都达到了属的水平。研究结果支持 Tomlinson和 Posluszny对大叶藻
科的划分结果, 建议将大叶藻科分为 4个属。
关键词: ITS; matK; 大叶藻科; 系统发育关系
中图分类号: Q949; Q75 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2011)06-0900-08

大叶藻科 (Zosteraceae)隶属于沼生目 (Helo-
biae)[1], 有大叶藻属 (Zostera)(12 种 )、异叶藻属
(Heterozostera)(1 种 )和虾形藻属 (Phyllospadix)(5
种)3 个属[2, 3]。目前对于这 3 个属的归属尚有争议,
有学者认为它们属于大叶藻科(Zosteraceae)[4], 也有
学者将其归于眼子菜科 (Potamogetonaceae)的大叶
藻亚科[5]。
大叶藻属包括大叶藻亚属(subgenus Zostera)和
拟大叶藻亚属(subgenus Zosterella)[3], 共 12 个种。
大叶藻亚属包含大叶藻(Zostera marina Linnaea)、具
茎大叶藻 (Zostera caulescens Miki)、丛生大叶藻
(Zostera caespitosa Miki)、宽叶大叶藻(Zostera asi-
atica Miki)和 Zostera pacifica Watson 5个种, 均分布
于北半球。其中, 大叶藻广泛分布于太平洋和大西
洋沿海, 具茎大叶藻和丛生大叶藻只分布于西北太
平洋海域(中国、日本、韩国和俄罗斯东南海域),
宽叶大叶藻分布在太平洋海域和北美沿海 [6—9],
Z. pacifica 仅分布于加利福尼亚沿海[10]。拟大叶藻
亚属包含 7 个种, 其中 Zostera capensis Setchell、
Zostera capricorni Ascherson、Zostera muelleri Ir-
misch ex Ascherson、Zostera mucronata den Hartog
和 Zostera novaelandica Setchell仅分布于澳大利亚和
新西兰沿海, 矮大叶藻(Zostera japonica Ascherson and
Graebner)分布于西北太平洋沿岸 , 诺氏大叶藻
(Zostera noltii Hornemann)分布于北大西洋和地中
海 [11]。异叶藻属仅 Heterozostera tasmanica den
Hartog 一个种, 分布于澳大利亚沿海和北美智利沿
海[4]。虾形藻属共 5个种, 分布于北太平洋沿岸[4]。
近年来的研究表明, 大叶藻科中虾形藻属的分类地
位已经明确 [2], 但大叶藻属与异叶藻属的划分仍存
在分歧[2, 4, 8, 11—13]。随着分子生物学技术的应用[14, 15],
大叶藻科的系统发育研究有了长足地发展[8, 11]。
大叶藻科物种都属于海草(Seagrasses), 海草是
多种水生被子植物的总称, 是一个生态组群而不是
一个分类组群。Kuo和 den Hartog[3]认为全球海草共
有 4 科 12 属 60 种。海草场是一类具有极高生产力
6期 李 渊等: 基于 matK基因和 ITS序列探讨大叶藻科的系统发育关系 901
的浅海生态系统, 其主要的结构成分是海草。它可
以作为许多生物的直接食物来源, 也可作为许多生
物的重要栖息地和隐蔽场所[9]。本研究依据叶绿体
的 matK基因片段和核基因 ITS片段, 对大叶藻科的
分类和进化关系进行探讨, 以为大叶藻属和异叶藻
属的重新划分提供遗传学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
采集中国青岛、威海沿海和韩国巨济岛的 4 种
大叶藻, 并依据《中国植物志》第 8 卷[16]和《中国
海草植物》[9]进行种类鉴定。样品采集后用海水洗
净, 取新鲜叶片, 放入装有硅胶的离心管中带回实
验室备用, 或者将新鲜样品浸于海水中直接带回实
验室使用。采样时为确保所采样品为不同植株, 植
株间隔至少在 2 m以上。其他大叶藻科物种及外群
[海菖蒲 Enhalus acoroides (L. f.) Royle和无尾水筛
(Blyxa aubertii Rich)]的序列信息来自于GenBank(表1)。
1.2 实验方法
基因组 DNA 提取 取 4 种大叶藻适量的新鲜
叶片或干燥叶片, 参照 Ban[17]的 CTAB(Cetyltrimen-
thylammonium bromide)法并加以改良来提取基因组
DNA, 将乙醇沉淀后的基因组 DNA 溶解于 100 μL
蒸馏水中, 4℃保存备用。取提取的DNA 3 μL用 1.5%
的琼脂糖凝胶电泳检测, 以备之后的 PCR扩增。
基因组片段的 PCR扩增、纯化 用于扩增 4种
大叶藻的 matK 和 ITS 片段的引物分别为: matK F:
5′-AACATTTCCCTTTTTGGAGGA-3′, matK R: 5′-
CAGAATCCGATAAATCAGTCCA-3′ [10]; ITS F5: 5′-
GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′, ITS G4: 5′-CTT
TTCCTCCGCTTATTGATATG-3′ [18]。PCR反应体系
总体积为 50 μL, 其中: 10×PCR缓冲液(200 mmol/L
Tris-HCl, pH 8.4; 200 mmol/L KCl; 100 mmol/L
(NH4)2SO4; 15 mmol/L MgCl2) 5 μL, dNTP 200
μmol/L, 引物各 0.2 μmol/L, Taq酶 1.25 U(大连宝生
物公司), 模板 DNA 20 ng, 加水至 50 μL。matK反
应条件为: 94℃预变性 3min, 94℃变性 1min, 57℃退
火 2min, 72℃延伸 1min, 40 个循环 ; 72℃延伸
10min。ITS反应条件为: 94℃预变性 2min, 94℃变性
1min, 37℃退火 2min, 72℃延伸 2min, 30 个循环;
72℃延伸 10min。以上反应均设阴性对照以排除DNA
污染的情况。用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩
增产物, 凝胶成像系统拍照。
1.3 PCR产物回收及 DNA序列测定
PCR 产物经 1%TAE 琼脂糖凝胶电泳检测, 产
物电泳后于紫外灯下切割目的条带, 用 DNA 胶回
收试剂盒(上海华舜)进行产物的纯化回收。测序分

表 1 样品、采样地点和 GenBank 序列号
Tab. 1 List of species, localities and GenBank accession numbers
种类
Species
采样地点
Locality
GenBank序列号(matK/ITS)
Accession No.
Z. capricorni — Australia. Sydney AB096167 AY077996
Z. mucronata — Australia. WA, Perth AB096168 AY077993
Z. muelleri — Australia. Melbourne AB096169 AY078005
Z. novazelandica — New Zealand. Kaikoura Peninsula AB096173 AY077994
Z. japonica 矮大叶藻 Korea. Geoje Island 本研究 本研究
Z. noltii 诺氏大叶藻 Germany. North Frisian Island AB096170 AY077992
H. tasmanica — Australia. WA, Perth AB096171 AY077989
Z. asiatica 宽叶大叶藻 Japan. Hokkaido AB096161 EF198347
Z. caulescens 具茎大叶藻 Japan. Iwate AB096163 —
Z. caespitosa 丛生大叶藻 Korea. Geoje Island 本研究 本研究
Z. marina 大叶藻 China. Qingdao 本研究 本研究
Z. pacifica — California. Santa Catalina EF198340 EF198348
Z. minima — — AJ581456 —
Phyllospadix torreyi Watson — — EF198333 AY077985
Phyllospadix iwatensis Makino 红须根虾形藻 China. Weihai 本研究 本研究
E. acoroides 海菖蒲 — AB002569 —
B. aubertii 无尾水筛 — — AY870359

902 水 生 生 物 学 报 35卷
析仪为美国ABI公司 3700型全自动序列分析仪, 为
保证所测序列的准确性, 每个样品均进行双向测序,
测序反应采用与 PCR反应一致的引物。
1.4 序列数据分析
用DNAStar软件(DNASTAR, Inc)对所得序列进
行剪切、编辑和比对, 并辅以人工校正。用 PAUP 4.0
和 Modeltest 2.0筛选两个目的片段核苷酸最佳替换
模型。用 MEGA 4.1软件将蛋白质编码基因 matK的
核苷酸序列的密码子转换为氨基酸进行检测。15种
大叶藻的 DNA多态性用软件 Arlequin ver 3.1进行
分析。使用 PAUP 4.0软件, 应用邻接法(NJ)、最大
简约法(MP)、最大似然法(ML)构建系统发育树, 运
用MrBayes 3.0软件构建贝叶斯(Bayes)系统发育树。
2 结果
2.1 核苷酸组成及序列差异
4种大叶藻经过 PCR扩增后均得到清晰的matK
和 ITS 两目的片段, 对测得序列进行比对且辅以人
工校正, 得到同源片段序列 matK长度为 715 bp, ITS
区(不包括 5.8S rDNA)序列的长度范围为 424—438
bp。其中多种大叶藻科的 matK 和 ITS 序列参照
GenBank 中同源序列进行比对(表 1)。15 种大叶藻
在 matK片段存在 249个多态位点, 在 ITS片段上有
236个多态位点(表 2)。
15 种大叶藻两目的片段的胞嘧啶(C)的含量均
较低, matK基因编码区密码子第三位点上的 C含量
低于 14.32%。15种大叶藻在 matK片段上反 C偏倚
尤为显著 (<9.70%, 但 P. torreyi 的 C 含量达到
21.80%)。A+T 含量明显高于 G+C 的含量, 平均含
量为 67.65%, 其中 ITS 片段 A+T 含量最低为
62.30%(表 3)。
ITS片段的 228处变异包括 156处转换、102处
颠换。matK基因片段上的 249处突变中有 138处转
换、122处颠换, 有 153处发生在密码子第三位点上
(62处颠换), 38处在密码子第二位点上(28处颠换),
58处位于密码子第一位点(29处颠换)(数据未列出)。
氨基酸水平上, 在 matK基因的 237个氨基酸序列中,
15 种大叶藻共检测到氨基酸替代(Amino acid sub-
stitution)45 处。这说明在氨基酸水平上, 15 种大叶
藻已在 matK 基因片段上产生了一定程度的遗传分
化(图 1)。
基于 HKY+G和 HKY模型分别计算得到 15种
大叶藻间的遗传距离(表 4), 异叶藻属与虾形藻属的
遗传距离在 0.5872—0.6141 之间, 与大叶藻亚属的
差异为 0.3155—0.3514, 与拟大叶藻亚属的差异为
0.1265—0.1599, 大叶藻亚属与拟大叶藻亚属的差
异在 0.2909—0.3551 之间, 结果显示异叶藻属与拟
大叶藻亚属亲缘关系最近, 与系统发育树结果一致。
2.2 系统发育分析
利用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)、最大似然
法(ML)和贝叶斯法(Bayes)构建的系统发育树基本
一致(图 2)。15种大叶藻明显分为 4大支, 第一支为
拟大叶藻亚属, 第二支由异叶藻属组成, 第三支由
大叶藻亚属组成, 虾形藻属单独构成最后一支, 除
个别节点外大部分节点均有较高的支持率。
基于 matK 和 ITS 两目的片段构建的系统树中,
Z. capricorni、Z. mucronata、Z. muelleri和 Z. novaze-
landica未能分开。

表 2 序列片段多态及 Modeltest 检验得到的模型
Tab. 2 Sequence variability and nucleotide substitution model estimates for Modeltest analyses
基因
Gene
片段长度
Sequence
length (bp)
信息简约位点
Parsimony information
sites
多态位点
Variable sites
单一信息位点
Singleton sites
插入/缺失
位点
Indels
核苷酸替代
模型
Best fit model
Gamma值
Gamma value
matK
ITS
715
424—438
56
187
249
228
193
49
0
82
HKY
HKY+G
Equal rates
1.988

表 3 核苷酸 matK 和 ITS 片段碱基频率分布
Tab. 3 Nucleotide frequencies of ITS and matK gene sequences (%)
基因
Gene
C T A G A+T
matK 14.26 40.73 32.72 12.30 73.00
ITS 17.36 34.46 27.84 20.34 62.30
平均值
Average
15.81 37.60 30.28 16.32 67.65
3 讨论
本研究结果显示 matK和 ITS两目的片段 4种碱
基存在明显的偏向性 , 胞嘧啶 (C)的含量都较低
(<17.36%), 在 matK 基因的密码子第三位点上 C 的
含量更低(14.32%)。A+T的含量明显高于 C+G的含
量, 表现出对 A+T 含量的偏倚。ITS 片段长度比较
6期 李 渊等: 基于 matK基因和 ITS序列探讨大叶藻科的系统发育关系 903
表 4 15 种大叶藻的 matK(下三角)基因和 ITS(上三角)序列之间的遗传距离
Tab. 4 Genetic distances of gene fragment of matK (below diagonal) and ITS (above diagonal) among fifteen Zosteraceae species
H. tasmanica P. iwatensis P. torreyi Z. asiatica Z. caespitosa Z. capricorni Z. caulescens
H. tasmanica 0.5872 0.6141 0.3155 0.3342 0.1265 —
P. iwatensis 0.045 0.1228 0.6168 0.6595 0.6309 —
P. torreyi 0.396 0.3506 0.6732 0.6874 0.622 —
Z. asiatica 0.0527 0.0746 0.4217 0.022 0.2909 —
Z. caespitosa 0.0576 0.0781 0.4136 0.0085 0.3094 —
Z. capricorni 0.0127 0.045 0.3928 0.0526 0.0574 —
Z. caulescens 0.062 0.0827 0.4237 0.0113 0.0084 0.0588
Z. japonica 0.017 0.0465 0.3926 0.0572 0.0619 0.0042 0.0634
Z. marina 0.0591 0.078 0.4164 0.0113 0.0056 0.0605 0.0084
Z. minima 0.0622 0.0828 0.4165 0.0127 0.007 0.062 0.0127
Z. mucronata 0.0156 0.0465 0.3949 0.0557 0.0604 0.0028 0.0619
Z. muelleri 0.0127 0.045 0.3928 0.0526 0.0574 0 0.0588
Z. noltii 0.0156 0.045 0.3929 0.0556 0.0604 0.0028 0.0619
Z. novazelandica 0.0127 0.045 0.3928 0.0526 0.0574 0 0.0588
Z. pacifica 0.0576 0.0782 0.4139 0.0085 0.0028 0.0574 0.0085

Z. japonica Z. marina Z. minima Z. mucronata Z. muelleri Z. noltii Z. novazelandica Z. pacifica
H. tasmanica 0.1599 0.3459 — 0.1298 0.1265 0.1515 0.1265 0.3514
P. iwatensis 0.6786 0.6575 — 0.6381 0.6309 0.6404 0.6309 0.648
P. torreyi 0.6694 0.6826 — 0.6291 0.622 0.6316 0.622 0.6919
Z. asiatica 0.3189 0.0277 — 0.2954 0.2909 0.3138 0.2909 0.0248
Z. caespitosa 0.338 0.0109 — 0.3141 0.3094 0.333 0.3094 0.0081
Z. capricorni 0.0486 0.3204 — 0.0027 0 0.0451 0 0.326
Z. caulescens — — — — — — — —
Z. japonica 0.3495 — 0.0515 0.0486 0.0248 0.0486 0.3551
Z. marina 0.0651 — 0.3252 0.3204 0.3444 0.3204 0.0027
Z. minima 0.0666 0.007 — — — — —
Z. mucronata 0.007 0.0636 0.065 0.0027 0.048 0.0027 0.3308
Z. muelleri 0.0042 0.0605 0.062 0.0028 0.0451 0 0.326
Z. noltii 0.0042 0.0635 0.065 0.0056 0.0028 0.0451 0.3502
Z. novazelandica 0.0042 0.0605 0.062 0.0028 0 0.0028 0.326
Z. pacifica 0.062 0.0056 0.007 0.0605 0.0574 0.0604 0.0574

保守 , 缺乏编码选择压力 , 核苷酸序列变化较大 ,
进化速率较快[19]。本研究结果与王建波等[19]的研究
结果相似, 在 ITS 片段中, 检测到丰富的遗传多态
性, 有 228 个多态位点。密码子第三位点上的突变
大多为同义突变, 很少导致氨基酸替代, 其中最常
见的突变是密码子第三位点上的转换, 其次是密码
子第三位点上的颠换和第一密码子位点上的无义转
换[20], matK 基因片段的研究结果与此一致。在 15
种大叶藻的 matK 基因片段上共检测到 249 处变异
位点, 其中 138处转换, 122处颠换。密码子第三位
点上的转换 95处, 颠换 62处, 这可能是由于蛋白质
编码基因密码子第三位点上核苷酸突变受自然选择
压力小所致; 密码子第一位点上 29处转换, 32处颠
换; 在受到功能限制最强的密码子第二位点上也检
测到 38处核苷酸替代, 转换 14处, 颠换 28处。氨
基酸水平上, 15 种大叶藻在氨基酸序列上共检测到
45处遗传变异, 表明 15种大叶藻在 matK基因片段
上已有一定的分化。
目前虾形藻属因其形态特征和染色体数目与其
他属的差异很大[3, 4, 21], 分类地位明确, 因此大叶藻
科的争议主要集中在大叶藻属与异叶藻属的划分
上。Setchell[22]因 Zostera tasmanica与大叶藻属其他
904 水 生 生 物 学 报 35卷


图 1 15种大叶藻 matK基因的氨基酸序列比较
Fig. 1 Amino acid sequences alignment of matK gene for fifteen Zosteraceae species

物种不同的形态特征, 将其定义为新属Heterozostera。
den Hartog[5]和 Kuo[21]依据根茎节间分支特点和皮
层维管束的数目将异叶藻属与大叶藻属和虾形藻属
进行鉴别。Kuo[21]同时认为染色体数目与形态特征
相结合可以作为大叶藻科中属与亚属的划分标准 ,
将染色体数目与 Sauvageau, et al.提出的一些区分大
叶藻属和异叶藻属的形态特征结合 ,支持异叶藻属
的独立存在。随着研究的进一步深入, 大叶藻属和
异叶藻属间的界限并不明确, 植物形态有过渡性。
Tomlison[1]同样支持将异叶藻属作为一个独立的属,
但并不认为根茎的以上特征可以作为划分属的标准,
研究发现异叶藻属中既有单轴式根茎也有合轴式根
茎。1995 年 Soros-Pottruff 和 Posluszny[23]明确提出
异叶藻属根茎属于单轴式, Yip[24]发现异叶藻属与大
叶藻属的根茎维管束数目亦有重叠, 同时 Tomlison[1]
发现异叶藻属与 Z. muelleri的叶片形态和结构也有
一定的相似性。而 Soros-Pottruff, et al.[23]和 Les, et
al.[2]支持 Taylor[12]将异叶藻属作为大叶藻属的一个
亚属。Tomlinson 和 Posluszny[13]首次将拟大叶藻亚
属提升到属的水平(genus Nanozostera), 将大叶藻科
分为 Heterozostera(1 个种)、Nanozostera(8 个种)、
Zostera(4个种)和 Phyllospadix(5个种)4个属。
大量的研究表明, matK 基因和 ITS 片段都适用
于植物系统发育研究[4, 8, 11, 25—27], 本研究中 matK和
ITS 两个片段都能将大叶藻科各物种很好的区别 ,
而且构建的系统发育树拓扑结构图基本一致(除了
matK系统树中多 2个种)。大叶藻科物种明显分为 4
大支, 而且有很高的置信度。有研究表明, 虾形藻属
是最早从大叶藻科中分化出来的[13], 而大叶藻亚属
在很多研究中都是被看作一个独立的组群 [3, 5], 与
本研究的结果相符合。与形态分类结果不同的是异
叶藻属与拟大叶藻亚属聚到一起 , 而非单独存在 ,
与其他研究结果相同。Les, et al.[2]基于 rbcL基因片
段研究海洋被子植物 , 得到异叶藻属与拟大叶藻
6期 李 渊等: 基于 matK基因和 ITS序列探讨大叶藻科的系统发育关系 905


图 2 邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建 15 种
大叶藻的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic trees of fifteen Zosteraceae species based on
neighbor joining analyses, maximum parsimony analyses, maxi-
mum likelihood and Bayes analyses
支持率及后验概率标注在分支上; 上: matK; 下: ITS
Numbers on the trees represent the values of supporting values and
posterior probability value; above: matK; below: ITS

亚属的 Z. mucronata 和诺氏大叶藻聚类到一起, 再
与大叶藻亚属的大叶藻聚到一起。Les, et al.[11]运用
matK、ITS和 rbcL基因片段探讨澳大利亚和新西兰
的大叶藻科的系统发育, 其结果显示异叶藻属也与
拟大叶藻亚属聚为一支, 提出将异叶藻属作为大叶
藻属的一个亚属, 建议将大叶藻科分成虾形藻属和
大叶藻属。Tanaka, et al.[4]基于 matK基因片段研究
了大叶藻属与异叶藻属的系统发育关系, 结果也显
示异叶藻属与拟大叶藻亚属聚为一支, 对于大叶藻
属和异叶藻属重新划分提出了 3 个方案: (1)合并为
大叶藻属, 异叶藻属作为大叶藻属的一个亚属; (2)划
分为大叶藻属(大叶藻亚属)和新属 Nanozostera (异
叶藻属和拟大叶藻亚属); (3)划分为大叶藻属(大叶
藻亚属)、Nanozostera(拟大叶藻亚属)和一个新属(异
叶藻属和 Z. capensis)。Kato, et al.[8]基于 matK 和
rbcL基因片段探讨日本沿海大叶藻科物种的系统发
育与起源, 也认为可将大叶藻亚属和拟大叶藻亚属
提升到属的水平, 建议大叶藻科划分为虾形藻属、
大叶藻属(大叶藻亚属)和 Nanozostera(异叶藻属和
拟大叶藻亚属)。以上诸学者的结果都是拟大叶藻亚
属与异叶藻属的亲缘关系较近, 而与同属的大叶藻
亚属较远。本研究基于 matK基因和 ITS片段对大叶
藻科进行系统发育研究, 也得出了与以上诸学者类
似的结果, 同时也可以看出虾形藻属最先分化。
诸多学者利用叶尖形态特征(截形、钝圆、微凹
和裂口)进行大叶藻科种类鉴定[3, 5], 但这些形态分
类特征并不是清晰可辨的, 当有重叠交叉时, 并非完
全可靠, 因此在分类上就不能完全有效地分开[11, 28]。
基于 matK 和 ITS 两目的片段构建的系统树中 ,
Z. capricorni、Z. mucronata、Z. muelleri和 Z. novaze-
landica 未能完全分开, 而且序列变异很小, 仅几个
碱基的差异(matK片段上是 2碱基差异, 在 ITS片段
上 4碱基差异)。2002年, Les, et al.[11]提出将澳大利
亚和新西兰的这四个种合并为一个种 Z. capricorni。
2006年, Jacobs, et al.[28]认为从形态特征和分子上并
不能完全将这 4 个种分开 , 主张合并为一个种
Z. muelleri, 包含 4个亚种 Z. muelleri subsp. muelleri
(Linnaea) Jacobs, Z. muelleri subsp. capricorni
(Ascherson) Jacobs, Z. muelleri subsp. mucronata
(den Hartog) Jacobs 和 Z. muelleri subsp. novaze-
landica (Setchell) Jacobs。2008年, Jones, et al.[29]也
支持将四个种合并为一个种 Z. muelleri, 但是否应
该划分亚种还需要进一步的证实。
屈良鹄和陈月琴[30]对 GenBank 中不同生物类
群的 ITS 序列进行比较得出属种划分的分子标准:
被子植物大多数科属的 ITS 序列的种间差异值
1.20%—10.20%, 属间差异值为 9.60%—28.80%。张
宏意等 [31]得出单叶血藤和大血藤的种间差异为
0.32%—2.31%, 从分子数据上更支持将单叶血藤划
到大血藤中; 向建英等[26]从遗传组学上得出 Begoni
handelii和 Begoni prostrata的种间差异仅为 0.556%—
0.696%, 明显小于种间的差异值, 认为二者在形态
上存在一定差别, 且在地理分布上不同, 应该是起
源于亲缘关系较近的共同祖先, 由于生境(分布)不
同而分化为两个分类群。本研究得到的结果显示异
叶藻属与虾形藻属的核苷酸差异值为 58.72%—
61.41%, 与大叶藻亚属的核苷酸差异值为 31.55%—
35.14%, 与拟大叶藻亚属的核苷酸差异值为 12.65%—
15.99%, 大叶藻亚属与拟大叶藻亚属的核苷酸差异
值为 29.09%—35.51%, 这些都明显高于屈良鹄等[30]
提出的属间划分的分子标准, 异叶藻属、虾形藻属
906 水 生 生 物 学 报 35卷
和大叶藻属间差异都在属的水平上, 符合 den Har-
tog 和 Kuo[3, 5]划分结果, 但是大叶藻亚属和拟大叶
藻亚属间的差异也达到了属的水平。Tanaka, et al.[4]
和 Kato, et al.[8]都曾将大叶藻亚属和拟大叶藻亚属
提升到属的水平。
综上, 拟大叶藻亚属与异叶藻属的亲缘关系最
近, 之后是同属的大叶藻亚属, 最远的是虾形藻属,
本研究结果支持 Tomlinson和 Posluszny[13]对大叶藻
科划分的结论, 建议将大叶藻亚属和拟大叶藻亚属
提升为属。但由于所用实验样品仅有大叶藻、丛生
大叶藻、矮大叶藻和红须根虾形藻, 对于大叶藻科
其他物种的了解不够全面。今后应加强样品采集和
形态学的研究, 尤其是能有效区分各物种的形态特
征探讨, 同时结合更多的分子标记对大叶藻科进行
更为深入的系统发育研究。
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PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS IN ZOSTERACEAE BASED ON MATK AND ITS
NUCLEOTIDE SEQUENCES
LI Yuan1, LI Wen-Tao1, SUN Dian-Rong2 and GAO Tian-Xiang1
(1. Fisheries College of Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute,
Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)
Abstract: Seagrasses are composed of four families belonging to angiosperms and they are thought to become adaptive to
aquatic life independently. The marine monocotyledonous Zosteraceae are one such family, which place in the order of Helo-
biae using traditional classifications and are typically circumscribed to comprise three genera (Heterozostera, Phyllospadix
and Zostera) with approximately 18 species. Since Zosteraceae had been reported, the studies about the family were mainly
focused on their morphological characters, physiological and biochemical characters and their flora. But the phylogenetic re-
lationship between taxa of Zosteraceae was still hard to guarantee in terms of similar morphological characteristics. With se-
quencing by PCR amplification, we reconstructed the phylogenetic relationship of Zosteraceae based on fragments of the
chloroplast (matK) and the nuclear ribosome (ITS) regions, which were successfully suitable for phylogenetic relationship
analysis. Four species were collected from China and Korea, and eleven species were obtained from GenBank. The nucleotide
composition analysis indicated a strong bias against cytimidine (C) in both fragments. 228 nucleotide substitutions were found
in ITS gene, showing the high genetic polymorphism. 249 nucleotide substitutions were checked in matK gene, and most of
them were synonymous transitions at the third codon positions. The Zosteraceae species had a certain degree of differentiation
at the amino acid level. Based on partial sequences of matK and ITS gene, phylogenetic trees were constructed by neighbor
joining, maximum parsimony, maximum likelihood and bayesian inference methods and the four methods produced trees with
largely congruent topology. These phylogenetic trees showed four separate lineages: (1) subgenus Zostera, (2) Heterozostera,
(3) subgenus Zosterella and (4) Phyllospadix. The pairwise percentage divergence values in the samples of subgenus Zostera
and subgenus Zosterella were from 29.09% to 35.51% and were much higher than the standard values (9.60% to 28.80%)
among genera of most angiosperm. The results suggested genetic differentiation of these two subgenus had reached the level
of generic variation. Our results lend support to the classification by Tomlinson and Posluszny, who recommended taxonomic
delimition of Zosteraceae as four genera: Heterozostera (one sp.), Nanozostera (eight spp.), Phyllospadix (five spp.) and Zos-
tera (four spp.). The molecular evidence suggested that Phyllospadix was the most divergent taxon, while Heterozostera and
Nanozostera were the most closely related taxa. The phylogenetic relationship was more complex, so, further molecular and
morphological investigations were needed to classify the phylogentic relationships of Zosteraceae.

Key words: Internal transcribed spacer; matK; Zosteraceae; Phylogenetic relationships