全 文 ：收稿日期:2007-04-10基金项目:国家自然科学基金(30630045);农业部种植业结构调整项目(050501B);河北省自然科学基金资助课题(C2004000697)作者简介:李　伟(1979-),男 ,河北石家庄人 ,本科 ,助理研究员 ,主要从事谷子遗传和基因组研究通讯作者:刁现民(1963-),男 ,河北南和人 ,理学博士 ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事作物遗传育种与分子生物学研究 。
适合于狗尾草属遗传分析的 ISSR标记筛选
及反应体系优化研究
李　伟 ,智　慧 ,王永芳 ,李海权 ,刁现民
(河北省农林科学院谷子研究所 ,河北 石家庄　050031)
　　摘要:利用公共数据库已有的 ISSR序列信息 , 检验了 29 条 ISSR引物在谷子等狗尾草属植物基因组的扩增性 ,其
中14条在狗尾草属中有良好扩增 , 其余 15 条在狗尾草属中无任何扩增。能稳定扩增的 14 条引物全为 3-锚定引物 , 6
条5-锚定引物在狗尾草属中得不到扩增。研究发现 AG , GA和 CA重复的引物在狗尾草属植物有较好扩增 , 且多态性
强。利用正交试验设计 ,从Mg2+、dNTP、引物 、Taq酶4 种因素 、4 个水平对狗尾草属谷子 ISSR反应体系进行优化 ,确定
了适合谷子的 ISSR反应体系 ,在 20 μL体系中 ,含 1×PCR buffer、Mg2+浓度 2.0 mmol/L , dNTP浓度 0.25 mmol/ L, Taq酶
0.4μL , 引物浓度 0.25 μmol/ L, 50 ng模板 , 通过梯度 PCR确定了引物的退火温度。本研究筛选的 ISSR引物及建立的
优化反应体系可用于谷子等狗尾草属植物遗传多样性和基因组研究 , 并对其他近缘作物有指导意义。
关键词:谷子;ISSR标记;狗尾草属
中图分类号:S515.01　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2007)04-0141-05
Screening of ISSR Primers that Suitable for Setaria
Species and Their PCR Reaction System Optimization
LI Wei ,ZHI Hui ,WANG Yong-fang , LI Hai-quan DIAO Xian-min
(National Millet Improvement Center of China , Institute of Millet Crops ,Hebei Academy
of Agriculture and Forestry Sciences ,Shijiazhuang　050031 ,China)
Abstract:Twenty nine ISSR primers designed according to the public ISSR database were tested their reaction fea-
sibility in foxtail millet and other setaria species genomes , of which 14 primers gave perfect amplication profile and the
other 15 made no amplication.All the 14 primers that made good amplication were 3′-anchored.The results also showed
that poly(AG)or(GA)and poly(CA)have better amplictiaon and polymorphism than other primers in setaria genomes.
The orthogonal design was used to optimize ISSR amplification system of setaria in four factors(Mg2+ ,dNTP ,primer ,Taq
polymerase)at four levels respectively.A suitable ISSR reaction system was established , namely 20 μL reaction system
containing 50 ng DNA templet ,0.25μmol/L primer ,1×PCR buffer ,0.25 mmol/L dNTP ,0.4μL Taq DNA polymerase ,
2.0 mmol/L Mg2+.The results obtained can be used for setaria genetics and genome research , and are important for re-
lated sepecies in connected fields.
Key words:Foxtail millet;ISSR marker;Sataria
　　Zietkiewicz等[ 1]发表了关于锚定的 SSR作为一
种分子标记的工具 , 即 ISSR(Inter Simple Sequence
Repeat),其基本原理是利用基因组中存在的众多的
SSR本身设计引物 ,在SSR的 3或 5加上 1 ～ 4 个碱
基锚定 ,对两侧具有反向排列的 SSR序列间的基因
组片断进行扩增 ,扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中分
离 ,从中鉴定多态性。 ISSR标记操作简便 、重复性强 、
省时省力 、消耗低 , ISSR 和 RAPD 很相似 , 但是比
RAPD更稳定 ,可重复性强 ,多态性更好 ,而且不需要
知道被检测的物种任何基因组的信息 ,因此 ISSR标
记很适合基因组信息缺乏物种的研究。由于 ISSR标
记的众多优点 ,自发明以来已被广泛应用于生物的遗
华北农学报·2007 , 22(4):141-145
传多样性和分子标记研究 ,在农作物研究中应用尤其
多[ 2 ,3] 。狗尾草属的研究基础相对薄弱 ,基因组信息
缺乏 ,遗传分析缺少相应的工具 , ISSR作为一种简便
的标记很适合狗尾草属遗传多样性分析。
谷子属于狗尾草属 ,其抗旱耐瘠是中国北方主
要的粮食作物之一 ,由于属于小作物研究基础薄弱 ,
无任何基因组相关信息 , Devos 等[ 4] 、Wang 等[ 5]用
RFLP 曾经对谷子进行过遗传研究 , 1998 年 Li Y
等[ 6]利用 RAPD对谷子进行了遗传多样性的研究 。
由此可见狗尾草属的研究背景少 ,可利用的标记少 ,
SSR是较好的一种分子标记 ,本实验室正致力于自
主开发谷子 SSR标记 ,因其开发周期长 ,耗时耗工 ,
达到利用 SSR标记分析谷子需要的标记数还需一
段时间的工作。我们也曾试图利用禾本科其他物种
的已有 SSR标记 ,研究其在狗尾草属的通用性 ,但
是通过筛选小麦 EST-SSR 、高粱 、水稻 、玉米大约 446
对SSR引物 ,只筛出 48对可在狗尾草属中有扩增产
物 ,利用这 48对引物研究狗尾草属遗传多样性显然
太少。 ISSR由于其多态性好 、操作简便 、重复性好 ,
利用其分析狗尾草属的遗传多样性是相对较好的工
具。
ISSR是基于 PCR的一种标记 ,其反应条件受许
多因素的影响 ,如 Taq酶量 、模板 、Mg2+、dNTP 、引物
的浓度都能影响 PCR的扩增结果 ,因此 ,确定某个
特定物种和其近缘种的 ISSR标记扩增所适合的具
体引物和反应条件 ,对于形成稳定高效的反应体系
至关重要 。以单因素试验 ,难免顾此失彼 ,忽视其相
互作用 ,正交试验设计具有均衡分散 ,综合可比及可
伸可缩 ,效应明确的特点 ,能够较快的优化反应条
件 ,本试验从Mg2+ , dNTP ,Taq酶 、引物 4个因素的 4
个水平对狗尾草属谷子 ISSR反应体系进行优化分
析 ,并对 ISSR引物的退火温度进行梯度试验 ,以期
获得狗尾草属优化的 ISSR-PCR反应体系 ,为狗尾草
属遗传多样性研究奠定基础。
1　材料和方法
1.1　材料
植物基因组 DNA 提取:植物基因组 DNA采用
SDS法[ 7]提取 ,取供试材料幼苗叶片 200 mg 用液氮
充分研磨 , 将粉末转至 2 mL Eppendorf 管中 ,加入
800 μL DNA 提取缓冲液充分混匀 ,加入 90 μL SDS
(10%)溶液 ,上下颠倒混匀 , 65℃水浴 15 min ,加入
140μL KAC(5 mol/L),混匀冰浴 30 min , 4℃12 000
×g离心 15 min ,取上清加氯仿:异戊醇(24∶1)500μL
抽提 ,取上清加 600μL异丙醇(4℃预冷),混匀后于
-20℃放置 30 min , 4℃12 000×g 离心 15 min ,去上
清后 80%乙醇洗涤 ,4℃12 000×g离心 5 min ,去上
清 ,放于超净工作台吹干 ,加入 100 μL ddH2O 溶解
DNA ,使用时稀释10 ～ 20倍 。
供试材料采自河北省农科院谷子所试验田 ,正
交试验均采用豫谷 1号的基因组 DNA 为模板 ,对所
建立的反应体系的验证试验采用的植物材料有谷子
豫谷 1号 ,阴天旱;青狗尾草材料 09001和 09003;法
式狗尾草材料 02006和 02002。
试验所采用试剂 , Taq 酶 , dNTP 均购自大连宝
生物工程公司 。PCR仪使用 eppendorf PCR仪 。
本试验根据加拿大 UBC大学网站(http://www.
michaelsmith.ubc.ca/services/NAPS/Primer-Sets/Prim-
ers-Oct2006.pdf)得到引物列表 ,在上海生工生物工
程公司合成全部引物 ,引物见表 2。
1.2　方法
供试材料采用 SDS 法提取总 DNA ,经过 0.8%
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量 , DNA浓度通过 ND-
1000紫外分光光度计测量 ,终浓度稀释为50 ng/μL。
1.3　退火温度的确定
根据试验选择合适的反应体系 ,设定退火温度
(51 ±5)℃, 自动生成 1 ～ 10 个梯度:47.2 , 47.7 ,
48.6 ,49.7 ,51.0 ,52.4 ,53.8 ,55.0 ,56.1 ,57℃,测试最
佳退火温度。
1.4　PCR正交试验设计
针对Mg2+ 、dNTP , Taq 酶 、引物 4 种因素 ,选用
L16(44)正交表 ,设计的PCR各反应成分的因素-水
平及正交试验表列于表 1。
表 1　PCR正交试验设计
Tab.1　Orthoronal design for ISSR-PCR reaction
system in Setaria
编号
No.
Mg
2+浓度
/(mmol/ L)
Mg
2+
dNTP 浓度
/(mmol/ L)
dNTP
Taq酶/μL
Taq DNA
polymerase
引物/(μmol/ L)
Primer
1 2.0 0.15 0.1 0.15
2 2.0 0.20 0.2 0.20
3 2.0 0.25 0.4 0.25
4 2.0 0.30 0.3 0.30
5 2.5 0.15 0.2 0.25
6 2.5 0.20 0.1 0.30
7 2.5 0.25 0.3 0.15
8 2.5 0.30 0.4 0.20
9 3.0 0.15 0.2 0.30
10 3.0 0.20 0.1 0.20
11 3.0 0.25 0.4 0.25
12 3.0 0.30 0.3 0.15
13 3.5 0.15 0.3 0.20
14 3.5 0.20 0.4 0.15
15 3.5 0.25 0.2 0.30
16 3.5 0.30 0.1 0.25
142　 华　北　农　学　报 22卷
　　以上 16个处理 ,每个处理 3 次重复 ,共 48个
PCR管 ,按表 1加样。反应体系总体积 20 μL ,每管
还包括1×PCR buffer和 50 ng的模板 DNA 。反应程
序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min ,47 ～ 49℃退火
1 min ,72℃延伸2 min ,循环 45次;72℃延伸 10 min;
4℃保存 。
PCR反应产物加入 2 μL 电泳点样缓冲液 ,2%
琼脂糖电泳 ,80 V恒压 1 h ,电泳后在溴化乙锭中染
色 ,在 BIO-RAD universal HOOD Ⅱ上进行凝胶观察
和照相 ,100 bp DNA ladder(TaKaRa ,中国大连)作为
分子量标准。每个 PCR反应重复 2 ～ 3次。
2　结果与分析
2.1　退火温度的确定
序列退火温度的梯度测验 ,结果见图 1 。分析
该结果 ,退火温度较低容易产生弥散的带 ,杂带多 ,
背景很高 ,随着退火温度的升高 ,引物与模板的结合
特异性增强 ,扩增条带特异性增强 ,但是随着温度的
升高一些非特异带产生 ,温度继续升高非特异带逐
渐减少 ,共利用梯度测验检测 ISSR引物 29 条(表
2),分别确定了各自的退火温度。
M.100 bp的 ladder;1～ 10号温度分别为:47.2 , 47.7 ,48.6,
49.7 , 51.0 , 52.4, 53.8 , 55.0 , 56.1 ,57℃
M is 100 bp ladder;Tm of NO.1 to 10:47.2, 47.7 , 48.6 , 49.7 ,51.0 ,
52.4 ,53.8, 55.0 , 56.1 , 57℃, respectively
图 1　引物 UBC810扩增程序退火温度对扩增的影响
Fig.1　Grandient PCR for finding Tm of primer UBC810
表 2　合成的 29 条引物及测试的退火温度
Tab.2　The details of 29 ISSR primers
名称
Name
长度
Length
序列(5′to 3′)
Sequence
Tm/ ℃ 扩增效果Ampliattern Ta/ ℃
扩增条带数
Numbers
of bands
扩增片断大小/bp
Size
of bands
UBC801 17 (AT)8T 32.9 无扩增
UBC804 17 (TA)8A 32.9 无扩增
UBC807 17 (AG)8T 52.2 好 47 6 250 ～ 800
UBC808 17 (AG)8C 54.6 好 49 5 480 ～ 1 100
UBC809 17 (AG)8G 54.6 好 49 6 190 ～ 750
UBC810 17 (GA)8T 52.2 好 47 7 200 ～ 1 000
UBC811 17 (GA)8C 54.6 好 49 4 300 ～ 1 100
UBC812 17 (GA)8A 52.2 好 47 6 200 ～ 700
UBC813 17 (CT)8T 55.4 无扩增
UBC814 17 (CT)8A 52.2 好 47 1 1 000
UBC815 17 (CT)8G 54.6 无扩增
UBC816 17 (CA)8T 52.2 好 47 3 600 ～ 1 500
UBC817 17 (CA)8A 52.2 好 47 6 260 ～ 1 400
UBC818 17 (CA)8G 54.6 好 49 5 500 ～ 1 100
UBC819 17 (GT)8A 52.2 好 47 2 900 ～ 1 600
UBC820 17 (GT)8C 54.6 无扩增
UBC821 17 (GT)8T 52.2 无扩增
UBC822 17 (TC)8A 52.2 好 47 3 640 ～ 1 100
UBC825 17 (AC)8T 52.2 无扩增
UBC829 17 (TG)8C 54.6 好 49 5 500 ～ 1 000
UBC834 18 (AG)8YT 52.7 无扩增
UBC835 18 (AG)8YC 55.0 好 49 3 350 ～ 750
UBC872 16 (GATA)4 41.3 无扩增
UBC884 17 HBH(AG)7 49.8 无扩增
UBC885 17 BHB(AG)7 49.8 无扩增
UBC888 17 BDB(CA)7 49.8 无扩增
UBC889 17 DBD(AC)7 49.8 无扩增
UBC890 17 VHV(GT)7 49.8 无扩增
UBC891 17 HVH(TG)7 49.8 无扩增
2.2　PCR正交试验设计的分析
3次正交试验 PCR给出了稳定的扩增结果(图
2)。从结果明显看出 ,随着 dNTP 的增加扩增产物
明显增多 ,但其特异性差(1 ～ 4号),当 dNTP 浓度在
4期 李　伟等:适合于狗尾草属遗传分析的 ISSR标记筛选及反应体系优化研究 143　
0.25 mmol/L 时其特异性高 ,产物稳定可靠(3 号);
而dNTP浓度太低时 ,直接影响 PCR扩增 ,甚至可造
成无扩增 , 第 1 , 5 , 9 , 13 4 个样本在 dNTP 浓度在
0.15 mmol/L 时基本无扩增说明了这一点。PCR产
物受Mg2+的影响较大 ,随着 Mg2+浓度的增加 ,扩增
产物明显增加 ,其弥散更加明显。Taq酶和引物浓
度对扩增无太大影响 。综合比较后 ,确定较适宜的
反应体系是:Mg2+浓度 2.0 mmol/L , dNTP 浓度 0.25
mmol/L ,Taq酶 0.4μL ,引物浓度 0.25 μmol/L。
1～ 16号分别对应表 1中 1～ 16号的反应体系
No.1 to 16 is same as Tab.1
图 2　正交试验电泳图
Fig.2　Result of PCR products electrophoresis
2.3　适合于谷子等狗尾草属植物的 ISSR标记引物
筛选
基于 ISSR标记在水稻 、小麦 、玉米等禾本科植
物的已有研究结果 ,本研究共设计了 29对 ISSR引
物 ,按照上述反应体系检测了每个引物在豫谷 1号
基因组的扩增表现 ,结果列于表 2。从结果可以看
出 ,29个引物有 14 个能稳定扩增 , 15个引物无扩
增。能够扩增的引物扩增的片段大小分布 190 ～
1 600 bp ,引物UBC810扩增的片段最多 ,为 7条;引
物UBC814给出的最少 ,为 1条 ,平均为 4.4条。
M.100 bp的 ladder;1～ 6号是 UBC807对豫谷 1号 ,阴天旱 , 09001 ,
09003 ,02006 ,02002的扩增;7～ 12号是 UBC810对豫谷 1号 ,阴天旱 ,
09001 , 09003 , 02006 ,02002的扩增
M is 100 bp ladder;No.1-6 is the result of Yu1 , Yintianhan ,09001 ,
09003 , 02006 ,02002 with primer UBC807 and the same templates
No.7 to 12 with primer UBC810
图 3　UBC807 , UBC810 应用于狗尾草属的扩增
Fig.3　Result of PCR products electrophoresis of
UBC807 and UBC 810
2.4　ISSR-PCR反应体系在狗尾草属植物中的应用
为检验所建立的反应体系在谷子等狗尾草属植
物的可应用性 , 将上述优化体系 Mg2+浓度 2.0
mmol/L ,dNTP浓度0.25 mmol/L ,Taq酶0.4μL ,引物
浓度 0.25 μmol/L 应用于包括豫谷 1号在内的 6个
狗尾草属的其他材料的扩增反应 ,包括 2个谷子品
种 、2个青狗尾草品种 、2个法式狗尾草品种。优化
的反应体系在这 6个品种中都得到较好的 、清晰扩
增条带 ,且重复性好(图 3),不同物种之间和同一物
种的不同品种之间 ,还表现了丰富的多态性。表明
优化的 ISSR-PCR反应体系稳定可靠 ,可用于狗尾草
属遗传多样性和分子标记分析。
3　结论与讨论
在我们合成的 29个 ISSR引物中 ,仅有 14个引
物在谷子等狗尾草属物种中有稳定扩增 ,在豫谷一
号基因组中共扩增出 62 条带 ,2002年 Joshi等[ 2]在
水稻中应用 ISSR标记分析水稻的遗传多样性 ,在谷
子和水稻上都能得到良好扩增的引物有 UBC807 ,
UBC808 ,UBC810 , UBC811 , UBC814 , UBC835 , 而引物
UBC813 ,UBC815 ,UBC821在谷子和水稻上都无扩增
或扩增弥散 , UBC812 , UBC816 , UBC817 , UBC818 ,
UBC819 ,UBC829在谷子上有良好扩增而在水稻中
无扩增或弥散 ,UBC834和 UBC872在水稻上扩增良
好 ,特异性强 ,却在谷子中无扩增 。从以上结果可以
看出 ,两碱基重复的 ISSR标记中 AG 和 GA 重复在
谷子和水稻中都有良好扩增且特异扩增强 ,说明在
狗尾草属和稻属基因组中含有丰富的 AG 和 GA 重
复。两碱基CT 和GT 重复在谷子和水稻中的扩增
都不好 ,很可能 CT 和GT在 2个属的基因组中含量
相对较少 , 或分布比较分散 , 无法得到扩增 ,
UBC816 ,UBC817 ,UBC818都是CA重复 ,这 3个引物
在谷子中有良好扩增 ,但是在水稻中却无扩增 ,这一
点可能反应了 CA微卫星重复在狗尾草属和稻属基
因组的不同状况。
本试验合成的 2个 AT 重复序列 ,在谷子中得
不到任何扩增 。在 Brantestam等[ 3]使用 ISSR标记对
大麦的研究中 ,UBC888 ,UBC889 ,UBC890 ,UBC891等
5′-锚定 ISSR引物可以得到 9 ～ 14扩增条带 ,本试验
也合成了 6 条 5′-锚定 ISSR引物 ,但是在谷子等狗
尾草属植物中无任何扩增 ,其中的原因值得探讨 。
由于 TaqDNA聚合酶是 Mg2+依赖性酶 ,Mg2+浓
度对 PCR扩增十分重要 ,本试验确定的最终适合浓
度是 2.0 mmol/L ,而Mg2+和其他因素之间有相互作
用的因素 ,所以单纯考虑 Mg2+浓度是不够的 ,本试
验采用正交试验设计 ,尽量实现各因素的优化组合 ,
使 PCR反应体系不只单纯根据单因素调整 ,最终得
到较优化的组合是:Mg2+浓度 2.0 mmol/L ,dNTP 浓
144　 华　北　农　学　报 22卷
度 0.25 mmol/L , Taq 酶 0.4 μL , 引物浓度 0.25
μmol/L。
在利用温度梯度 PCR测试引物的退火温度时 ,
发现在退火温度很低时易出现弥散的带 ,背景重;当
温度合适时 ,只产生特异的 PCR条带 ,无弥散带 ,且
重复时稳定性好;温度再高一些 ,就出现了非特异扩
增条带 ,这些带一般出现在较 300 bp 小或者大于 1
kb的位置 ,重复性差;温度继续升高 ,这些非特异带
逐渐减少 ,特异带的亮度变弱 ,说明引物与模板的结
合能力差 ,结合较困难 ,导致扩增量少。
优化的 ISSR-PCR体系在狗尾草属的 3个种:谷
子 、青狗尾草和法式狗尾草中得到较好的扩增 ,且多
态性好 ,利用 1条引物即可将其区分 ,每个物种都有
其特异条带 ,3个种之间的种间差异也在图 3中有
明显的显示 ,种的特异带十分明显;种内不同品种间
也表现了多态性 。因此 ,应用 ISSR能够分析狗尾草
属的遗传多样性和系统进化关系。在狗尾草属谷子
的已有研究中较多使用 RAPD 随机标记[ 6] , 但是
RAPD 的多态性差 、可重复性差。此外 , RFLP 标
记[ 5 ,8]和AFLP标记均在谷子和狗尾草属遗传多样
性研究中应用[ 9] ,而 ISSR具有在狗尾草属中良好的
扩增以及好的重复性 ,在狗尾草属中引入 ISSR标
记 ,无疑会加快狗尾草属的遗传研究 ,为遗传背景知
识较为薄弱的小作物研究增加了一个有利的工具 。
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4期 李　伟等:适合于狗尾草属遗传分析的 ISSR标记筛选及反应体系优化研究 145