全 文 ：无致病力 hrp-突变体防治茄科蔬菜青枯病
杨宇红 刘俊平 杨翠荣 龚惠芝 冯东昕＊ 谢丙炎＊
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘要:为探索一条可有效控制茄科蔬菜青枯病的生防途径 ,以基因工程方法获得的无致病力青枯
菌 hrp-突变体为材料 ,针对茄科蔬菜青枯病进行有关生防体系 、防治潜能及其机制的研究 。结果表
明 ,无致病力 hrp-突变体对致病青枯菌无直接抑制作用 ,但可在植株体内定殖 ,并在预接种后阻止
致病青枯菌的增殖。最优生防体系为采用改良蘸根接种法用无致病力 hrp-突变体预处理 24h后再
接种致病菌 ,对青枯菌生理小种 1引起的番茄 、茄子 、辣椒青枯病防治效果达 64%以上 ,其中对 hrp-
突变体的野生致病菌株引起的番茄青枯病的防治效果最好 ,防效接近 90%,对该野生致病菌接种
辣椒 、茄子引起的青枯病防治效果也在 75%以上 ,且持效期长 、稳定性好 、安全无药害 。
关键词:青枯病;无致病力 hrp-突变体;生物防治
ControlofSolanaceaevegetablebacterialwiltwithavirulenthrp-mutants
YangYuhong LiuJunping YangCuirong GongHuizhi FengDongxin＊ XieBingyan＊
(InstituteofVegetableandFlower, ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Beijing 100081, China)
Abstract:ForexploringaneficientmethodtobiocontrolSolanaceaevegetablebacterialwilt, thispaper
investigatedthebiocontrolsystem, potentialabilityofbiocontrolanditscontrolmechanismsofSolanaceae
vegetablebacterialwiltusingavirulentstrainofRalstoniasolanacearumhrp-mutantthatwasobtainedby
geneengineering.Theresultsshowedthathrp-mutantcouldnotinhibitR.solanacearumgrowthdirectly,
butcouldbecolonizedinplantandpreventedvirutentstrainreproductionafterpre-inoculation.Theopti-
malbiocontrolsystemwastoinoculateplantswithR.solanacearumafterpretreatmentofhrp-mutantfor24
hour.Thecontrolefectwasover64% tobacterialwiltthatcausedbyphysiologicalstrain1 totomato,
eggplantandpepper.Andthesignificantcontrolefectwasnear90%totomatobacterialwiltthatcaused
byhrp-mutant swildpathogenicstrain, whilethecontrolefectofpepperandeggplantinoculatedwith
wildR.solanacearumwasover75%.Thisbiocontrolsystemdisplaysadvantagesofstability, safetyand
longtermefect.
Keywords:bacterialwilt;avirulenthrp-mutant;biologicalcontrol
由 Ralstoniasolanacearum引起的茄科蔬菜青枯
病是一种毁灭性的土传病害 ,其寄主范围十分广泛 ,
可侵染 44个科的数百种植物 ,发病严重时常造成番
茄 、茄子 、辣椒 、马铃薯等茄科蔬菜毁种绝收 ,已成为
茄科蔬菜生产的主要障碍[ 1] 。生产上主要采用抗
病品种和轮作等农业措施防治该病 ,但目前尚缺乏
抗病优质品种 [ 2-3]及有效的化学药剂 ,农业措施虽
有一定效果 ,但不能从根本上控制病害 。生物防治
具有无毒 、无害 、不污染环境及不易产生抗药性的特
点 ,是防治细菌性青枯病的有效途径。
国内外在利用生物因子防治青枯病方面已开展
了大量的研究 ,并获得了可喜的效果 ,利用青枯菌的
基金项目:“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD07B02、2006BAD17B08、2006BAD08A08),国家自然科学基金项目(30471134),
农业科技跨越计划项目
作者简介:杨宇红 ,女 , 1963年生 ,副研究员 ,主要从事植物病理及生物防治研究 , email:qingchaoy@yahoo.com.cn
＊通讯作者(Authorsforcorrespondence), email:xiebingyan2003@yahoo.com.cn, fengdx@mail.caas.net.cn;收稿日期:2008-05-23
第 35卷 第 5期
2008年 10 月
植 物 保 护 学 报
ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA
Vol.35 No.5
Oct. 2008
DOI :10.13802/j.cnki.zwbhxb.2008.05.019
无致病力菌株防治作物青枯病就是其中一种。无致
病力青枯菌株可通过物理诱变 、自发突变和基因工
程等手段获得 ,国内对前两种方法获得无致病力菌
株的研究报道较多[ 4-8] ,而对利用基因工程手段获
得无致病力青枯菌防治青枯病的研究报道则非常有
限 。Frey等[ 9]采用基因工程方法 , 在 Ralstoniaso-
lanacearumhrp-基因簇内 hrp-O片段上插入一个 Ψ-
Km片段获得了无致病力的 hrp-突变体 ,用该突变体
进行防治番茄青枯病的试验取得了很高的保护率 。
作者在 Frey等[ 9]研究的基础上 ,进一步研究无致病
力 hrp-突变体的生防体系 、防治潜能及其机制 ,以求
探索出一条有效控制茄科蔬菜青枯病的生防途径。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株:青枯菌株:GMI1000、TM60(番茄青
枯病菌株)、EM43(茄子青枯病菌株)、PO41(马铃薯
青枯病菌株)。其中 GMI1000野生型致病菌株为抗
利福平标记菌株 ,由法国农业科学院提供;其余菌株
均为本实验室保存 。生防菌株:无致病力 hrp-突变
体(简称 hrp-突变体),法国农业科学院提供 。
作物及品种:番茄:丽春 、中蔬 4号 、中蔬 5号 、
中蔬 6号 、Vc48-1和 Vc9-1,为对青枯病抗 、感程度
不同的品种;辣椒 (茄门)、茄子(七叶茄)、马铃薯
(大西洋),均为青枯病易感品种。以上品种由中国
农业科学院蔬菜花卉研究所育种课题组提供。
1.2 方法
1.2.1 hrp-突变体对青枯致病菌的体外抑制作用测定
采用平皿抑菌法 ,具体操作依据谭兆赞等[ 10]的
方法进行 , 30℃下培养 48h后 ,观察有无抑菌圈及
抑菌圈的大小。设 4次重复 。
1.2.2 hrp-突变体对青枯致病菌的体内抑制作用测定
播种中蔬 6号番茄 ,在番茄 3叶期进行以下两
种接种处理:①预接种 hrp-突变体 24h后接种青枯
致病菌 GMI1000;②单接种青枯致病菌 GMI1000。
hrp-突变体的接种浓度为 1×107 cfu/mL,青枯致病
菌 GMI1000的接种浓度为 1×108 cfu/mL。两种处
理在接种青枯致病菌后分别于 0h、2、4、6、8、10天
采集番茄植株地上部分 ,经 70%乙醇消毒 、漂洗后 ,
按鲜重加等量水研磨成匀浆 ,并经一系列稀释后取
不同稀释浓度的番茄研磨液 100μL,在含有利福平
(50μg/μL)的 BGT选择性培养基(蛋白胨 10g、酸
水解酪素 1g、酵母提取物 1g、葡萄糖 25g、琼脂 15 ～
20g、水 1L)上涂平板 ,置 30℃培养 48h,记数平板单
菌落数 ,将菌落数按稀释度和取样鲜重换算成单位
鲜重的标记菌株的菌体数 ,统计两个不同处理青枯
致病菌在番茄体内的增殖速度 。每个时间点 、稀释
度设 3次重复 。
1.2.3 生防体系的建立
接种方法筛选:将经多年抗病性鉴定筛选出的
对青枯病抗 、感病程度不同的番茄材料播种于底部
有孔的穴盘中 ,育苗基质为消毒的草炭 、蛭石和营养
土(2∶2∶1)混合物。待番茄幼苗长至第 3片真叶
期 ,采取以下两种方法接种青枯致病菌 GMI1000。
①传统蘸根接种法:把番茄幼苗从穴盘中拔出 ,洗尽
根部土壤后 ,把根部浸入接种液中 , 20min后取出 ,
再移植于另一盛有育苗基质的育苗钵中;②改良蘸
根接种法:接种前先剪去伸出穴盘底部的须根 ,然后
直接把穴盘放入接种液中 ,浸渍 30min后将穴盘置
于另一盛有育苗基质的盘上 。接种浓度为 1×108
cfu/mL。每品种设 3次重复 ,每重复 6株。接种后
的番茄植株置于白天 28 ～ 30℃、相对湿度 50%和夜
晚 18 ～ 20℃、相对湿度 95%的人工接种气候室内 ,
每天光照 16h。观察两种接种方法的发病始期 ,并
于接种后 7、15天调查发病严重度。
接种时间筛选:选用易感品种中蔬 6号为试材 ,
采用改良蘸根接种方法预接种 hrp-突变体后 ,分别
于 6、12、24、 48、72h和 7天后再接种青枯致病菌
GMI1000,以单接种 H2O、GMI1000致病菌和 hrp-突
变体为对照。两者的接种浓度及接种生育期同 1.2.2,
接种后培养条件同上。每处理重复 3次 ,每重复 15
株苗 。单接致病菌的番茄开始发病时 ,每天调查各
处理的发病情况。
1.2.4 温室盆栽防治青枯病试验
hrp-突变体对国外野生型番茄致病青枯菌的防
治试验:将易感的番茄(丽春)、辣椒 、茄子品种分别
播种于育苗盘中置温室常规管理 ,在茄子长至 2叶
期 ,番茄 、辣椒 4叶期时采用改良蘸根接种法预接种
生防菌株 hrp-突变体 , 24h后再用从法国引进的野
生型番茄致病青枯菌(GMI1000)进行接种 ,以单接
hrp-突变体和 GMI1000为对照。接种 7 ～ 10天后调
查各作物青枯病发病严重度 。
hrp-突变体对国内主要茄科青枯病的防治试
验:番茄(丽春)、茄子育苗及接种生育期同上 ,马铃
薯播于育苗钵中 ,接种生育期为 6 ～ 7叶期 ,采用传
统蘸根接种法预接种生防菌株 hrp-突变体 24h后 ,
434 植 物 保 护 学 报 35卷
再用本地番茄青枯菌株 (TM60)、茄子青枯菌株
(EM43)、马铃薯青枯菌株(PO41)分别接种相对应
的寄主植物 ,以分别单接种青枯致病菌株和 hrp-突
变体为对照 。
两个试验的菌株接种浓度均为 1×107-8 cfu/
mL,接种后发病条件同 1.2.3中接种方法筛选 。每
处理 3次重复 ,每重复 8株苗。 7 ～ 10天后调查生防
菌株 hrp-突变体对植株的安全性及各处理的发病情
况 ,计算 hrp-突变体对不同来源青枯菌的防治效果。
2 结果与分析
2.1 hrp-突变体对青枯致病菌的体外抑制作用
蘸有 hrp-突变体菌液的纸碟在含有致病青枯菌
GMI1000的平板上培养 48h后 ,没有发现抑菌圈 ,
表明无致病力 hrp-突变体在植株体外对番茄青枯菌
无直接抑制作用 。
2.2 hrp-突变体对青枯致病菌的体内抑制效果
根据抗利福平标记菌株 GMI1000与无致病力
hrp-突变体分别对利福平具有耐药和敏感的特点 ,
用含有利福平的 BGT选择性培养基从两种不同接
种处理的番茄植株体内分离标记青枯菌株 ,比较两
种接种处理致病青枯菌在植株体内的增殖情况 。结
果表明 ,预接种 hrp-突变体 24h后再接种致病菌的
番茄植株 ,其致病菌在植株体内出现的时间较单接
种致病菌的发生时间显著延迟 ,在接种后第 8天才
分离到较低浓度的致病菌(3.7×104 cfu/g),而且在
植株体内增殖速度缓慢 ,增殖量也受到显著的抑制 ,
接种后第 10天每克鲜重植株中的细菌量为 2.5×
10
6 cfu,仅相当于单接种致病菌约第 3天的含菌量;
而单接种致病菌 GMI1000的番茄 ,接种后第 2天在
番茄植株体内就分离到较高浓度的致病菌 (1.7 ×
10
5cfu/g),且随着时间的推移 ,病原菌在植株体内
的繁殖量急剧增加 ,接种后第 8天达到最高值(1.12×
10
15 cfu/g),此时 ,植株已严重发病并萎蔫死亡(图
1)。这说明 hrp-突变体对致病青枯菌在番茄体内的
繁殖有较强的抑制作用 ,可能是由于预先接种 hrp-
突变体后 ,突变体抢先占据了定殖位点 ,排斥致病青
枯菌在植株的部分区域定殖 ,即产生所谓位点竞争
定殖 ,从而减少致病菌的侵入 。
图 1 hrp-突变体对青枯致病菌的体内抑制效果
Fig.1 Inhibitoryactionofavirulenthrp-mutantto
Ralstoniasolanacearum
2.3 生防体系的建立
2.3.1 接种方法的筛选
两种接种方法的接种效果基本相同。接种后
1 5天调查 ,供试番茄材料对青枯病的反应趋势完全
一致 ,说明两种接种方法均能准确地体现各番茄材
料的抗病和感病程度。其中以改良蘸根接种法较传
统蘸根接种法更为敏感 ,表现为发病时间提前 ,改良
蘸根接种法在第 4天开始发病 ,较传统蘸根接种法
提前 2天发病 ,而且前期发病程度也较传统蘸根接
种法重 ,在接种后第 7天 ,即能判断各番茄品种对青
枯病的抗病 、感病趋势(表 1)。更为重要的是与传
统蘸根接种法相比 ,改良蘸根接种法具有省时省力 、
方便简捷 、灵敏度高等特点 ,对于大批量接种鉴定及
利用 hrp-突变体菌株防治青枯病处理等更为适宜。
表 1 不同接种方法接种青枯病的病情指数
Table1 Diseaseindexoftomatobacterialwithdifferentrootinoculations
处理
Treatment
丽春
Lichun
7d 15d
中蔬 4号
ZhongshuNo.4
7d 15d
中蔬 5号
ZhongshuNo.5
7d 15d
中蔬 6号
ZhongshuNo.6
7d 15d
Vc48-1
7d 15d
Vc9-1
7d 15d
传统蘸根接种 58.4 100.0 51.9 100.0 41.8 100.0 29.6 95.5 0.0 0.0 0.0 0.0
Traditionalrootinoculation
改良蘸根接种 97.9 100.0 92.7 100.0 91.7 100.0 90.6 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Improvedrootinoculation
注:表中数据为三次重复的平均值。Note:Thedateinthetablemeansofthreerepeatexperiments.
4355期 杨宇红等:无致病力 hrp-突变体防治茄科蔬菜青枯病
2.3.2 hrp-突变体预处理时间的确立
结果显示 ,单接致病菌株 GMI1000的番茄于接
种后第 5天开始发病 ,且病害扩展迅速 ,至第 9天达
到发病高峰(图 2)。而预接种 hrp-突变体后在不同
时间点挑战接种致病青枯菌 ,对青枯病均有不同程
度的控制作用 ,以 48h以前进行 hrp-突变体预处理
的防治效果最显著 ,在接种后 24天内能基本控制青
枯病的发生 ,且设置的 4个时间点即 6、12、24、48h
间防效无显著性差异;预接种 hrp-突变体 72h后再
接种致病青枯菌 ,前期虽能有效控制病害发生 ,但防
效不持久 ,后期防治效果显著降低(图 2)。在本试
验中以单接种 hrp-突变体和清水处理为对照的番茄
植株无萎蔫症状出现 ,表明 hrp-突变体确为无致病
力菌株 ,对植株无危害作用 。
综合上述结果 ,充分说明 hrp-突变体对番茄青
枯病具有极显著的防治效果 ,且对植株无危害 ,预处
理时间在致病青枯菌接种前 48h内均有显著防效 。
为方便操作 ,本研究选定 hrp-突变体预接种 24h后
再接种致病菌为适宜的生防体系。
2.4 温室盆栽防治青枯病效果
hrp-突变体对茄科主要蔬菜青枯病均有一定的
防治作用 ,但对不同青枯病菌生理小种间的防效存
在一定的差异。对青枯菌生理小种 1引起的番茄 、
茄子 、辣椒青枯病防效显著 ,不论国内 、国外菌种 ,接
图 2 hrp-突变体不同预处理时间控制青枯病效果
Fig.2 Controleficacyofpre-inoculationwith
hrp-mutantfordiferenttime
注:6、12、24、48、72h、7天分别代表预接种 hrp-突变体后 ,再
接种致病菌GMI1000的时间。 Note:6, 12, 24, 48, 72h, 7dmean
thetimechalengeinoculationwithGMI1000 afterpre-inoculation
withhrp-mutant.
种后 10天调查 ,防治效果均在 64%以上。特别对
hrp-突变体的野生致病菌株引起的番茄青枯病的防
治效果最好 ,其防效接近 90%,对该菌接种辣椒 、茄
子引起的青枯病防治效果也在 75%以上 。但对青
枯菌生理小种 3引起的马铃薯青枯病的防治效果稍
弱(表 2、3、图 3)。安全性调查结果表明 ,单独用
hrp-突变体处理的植株均生长正常 ,无萎蔫症状(表
2、3),再次证明 hrp-突变体本身对作物无致病及致
害作用 ,具有极高的安全性。
表 2 hrp-突变体对国外番茄青枯菌野生型菌株的盆栽防治效果
Table2 Controleficacyofhrp-mutanttoRalstoniasolanacearumfromabroadinpottrial
处理
Treatment
病情指数 Diseaseindex
番茄Tomato 辣椒Pepper 茄子 Eggplant
防治效果 Controlefficacy(%)
番茄Tomato 辣椒Pepper 茄子 Eggplant
hrp-+GMI1000 7.5a 16.3a 24.1 a 89.2 78.3 75.4
GMI1000 69.4b 75.0b 98.0 b
hrp- 0.0 0.0 0.0
表 3 hrp-突变体对国内主要茄科青枯菌的盆栽防治效果
Table3 Controlefficacyofhrp-mutanttoRalstoniasolanacearuminpottrial
番茄青枯病 Tomatobacterialwilt
处理
Treatment
病情指数
Disease
index
防效(%)
Control
eficacy
茄子青枯病 Eggplantbacterialwilt
处理
Treatment
病情指数
Disease
index
防效(%)
Control
eficacy
马铃薯青枯病 Potatobacterialwilt
处理
Treatment
病情指数
Disease
index
防效(%)
Control
eficacy
hrp-+TM60 32.6a 64.2 hrp-+EM43 27.5 a 67.3 hrp-+PO41 64.0a 32.1
TM60 91.1b EM43 84.0 b PO41 94.2b
hrp- 0.0 hrp- 0.0 hrp- 0.0
3 讨论
近年来 ,生物防治已成为控制植物土传病害的一
种重要手段。无致病力青枯菌作为防治青枯病害的
一种生物因子 ,在国内外已有研究报道[ 4-9, 11-12] 。目
436 植 物 保 护 学 报 35卷
图 3 hrp-突变体对茄科主要青枯菌的盆栽防治效果
Fig.3 Controleficacyofhrp-mutanttoRalstoniasolanacearuminpottrial
前 ,国内大多利用物理诱变(如紫外线诱变 、Co60辐
射等)[ 5, 7]或自发突变 [ 6]获得无致病力青枯菌 ,虽有
一定防治效果 ,但存在防效偏低 、持效期短及不稳定
的弊端 。而利用基因工程手段获得的无致病力青枯
菌防治青枯病 ,其防效优于物理诱变及自发突变的
无毒菌株[ 8, 11-12] ,具有较好的生防前景 。
Frey等 [ 9]用竞争接种法检测青枯菌的无毒 hrp-
突变体对青枯病的控制能力 ,发现无毒突变体能够
排斥有毒菌株在植株部分区域定殖 ,由此获得了显
著的防治效果。这与本研究对无致病力 hrp-突变体
青枯菌生防机制研究的初步结果一致 ,即无致病力
hrp-突变体对致病青枯菌无直接抑制作用 ,但可在
植株体内定殖 ,并在预接种后阻止致病青枯菌的增
殖 ,从而延缓青枯病发生并最终控制青枯病的危害 。
表明青枯菌无致病力 hrp-突变体主要通过位点竞争
和营养竞争影响致病菌在寄主上的附着或营养的摄
取 ,从而起到控病作用 ,与物理诱变获得无致病力青
枯菌的主要控病因子细菌素无关 ,但无致病力 hrp-
突变体是否还通过引起寄主组织的诱导抗性及其它
抗病机制尚需进一步研究 。
Frey等 [ 9]研究还发现 ,青枯菌无致病力 hrp-突
变体可移植到番茄植株的根尖和根颈 ,而不到果实 ,
因此它的存在不影响番茄产量 ,且由于无致病力突
变体可正常侵染植物并在植物体内繁殖 ,受土壤环
境和其它土壤微生物的影响较小 ,因此生防效果稳
定 。本研究结果也表明 ,采用建立的生防体系 ,用无
致病力青枯菌 hrp-突变体防治由青枯菌生理小种 1
引起的茄科蔬菜青枯病效果十分显著 ,且持效期长 、
稳定性好 、安全无药害 ,克服了生物防治中常出现的
防治效果受土壤环境和土壤微生物影响导致田间防
治效果不稳定的缺陷 。由此说明该无毒突变体确是
一个颇具潜力的生防菌株 ,且本研究建立的无致病
力 hrp-突变体防治茄科蔬菜青枯病的生防体系是切
实可行的。因此 ,如果将该无毒突变体研制 、开发成
生物菌剂并将本研究的生防体系应用于田间生产 ,
则有望为青枯病的防治提供一条有效途径。
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