全 文 ：第 25 卷 特刊
2 0 0 3年 l月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOU R N A L O F B E JI ING FO RE S」,R Y U N I V E R S ll万
V o l
.
2 5
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S Pc e
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15 5
.
J a n
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,
2 0 0 3
蜡梅科 ( C a ly C a n th a e e a e )若干植物
n r D N A IT S 序列 P C R 反应条件分析 `
赵凯歌 陈龙清 “
(华中农业大学园艺林 学学院 , 43 0 70 ,武汉 )
摘要 该文 旨在探讨适合 于扩增蜡梅科植物 月 S 序列的 P C R 反应条件 。 试验中设计了 2 个新引物来扩增 整个核糖体
RN A 基因 ( irI D N A )的 I sT 序列 ,进行 了 4 种引物组合 、 2 种扩增程序 、 7 种 M扩` 浓度 、 4 种 dNPT 浓度 和 3 种二 甲基亚矾
浓度的 比较 。 结果表明 : 当反应体系中 M扩+ 浓度为 1 . 8 m m 0厂 L , dN开 为 Z m m o F L , 含 5 % 二 甲基 亚矾 , 扩增时先进行
两步预扩增 , 反应效果最好 。 文中还对引物的设计进行了探讨 , 认为当所选用 的植物可能有寄生 真菌时 , 最好不用与
真菌同源的引物 。 最后提出了几点引物设计的注意事项 〕
关键词 蜡梅科 , 肛D N A , IT’S 序列 , PC R 反应条件
E x P l o r a t i o n o f t h e O P t im a l P C R R e a c t i o n C o n d i it o ns o f n r D N A
’
s
I T S R e g i o n A m o n g S o m e M e m b e r s i n C a ly c a n ht a c e a e
Z h a o K a ige C h
e n L o n g q i n g
( e o l l e g e of H o rt i e u l tu re a n d F
o
re s t叮 s o i e n e e s , H u a z h o n g A卯 . u n i v . , 4 30 0刃 , w u h a n , P . R . e hian )
A B S T R A C T hT
e p u甲 o s e o f t h i s e x p e ir m e n t 15 to if n d o u t t h e o p t im a l p C R re a e t i o n e o n di t i o n s o f n rD N A ’ 5 1巧
re g i o n of r de te e t i n g t he P ll y l o g e n e t i e re la t i o n s h ip a m o n g I n e lnb
e rs o f C a l y e a n t h a e e a e
.
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o n e w Pir m e rs w e re d e
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51邵 e d t o a m p l ify th e w ho le n u e l e a r r R N A g e n e s ’ i n t e rn al t ar n s e ir b e d s p a e e r . oF u r p ia rs o f p ir m e rs , t w o a m p li if -
e a t io n p or e e du er s
, s e v e
alr k i
n d s o f M扩+ , d N即 , n M S O e o n e e n tar oi o n l e v e ls w e er u s e d t o a t t a i n th e e x p e e te d er -
s u l t s
.
A s w e ll
,
t h e au t h o比 e o m e u p w i th s e v e ar l p o in t s e o n e e nr i n g p ir me r d e s ig n
.
K E Y W O R D S C a l y e a n t ha e e a e
, n r D N A
,
I巧 ( i n t e nr a l tar n s e ir b e d s p a e e r ) er g i o n , PC R er a e ti o n e o n d i ti o n
蜡梅科 ( C a l y e a n t h a e e a e )植物起源古老 , 分 布广
泛 ,属于典型的东亚一北美间断分布植物 ,对于研究
东亚和北美之间植物的变迁 、 区系分布 、 系统进化及
古地理和古气候均具有重要价值 ,受到了专家关注 。
国内外很多学者从形态学 、 细胞学 、抱粉学及化学成
分等方面探讨了该科植物的分类 、 起源进化等 ,但仍
存在很多争议 。 近年来美国及澳大利亚的几位学者
利用叶绿体 br cL 基 因 、 18S r 及 26 S rR N A 基因等的序
列探讨了蜡梅科的系统位置及属的进化 。 本课题组
也利用分子标记 R A PD 分析了蜡梅科若干植物居群
的遗传多样性 ,这将对探讨蜡梅科植物 的系统学以
及资源保护与利用具有重要意义 。 本研究 旨在利用
核 nr D N A 的 IT S 序列 ,探讨蜡梅科植物居群 、 种及属
的进化生物学问题 。
IT S ( i n t e m a l tar n s e ir b e d s p a e e r )序列是高等植物
核 r D N A 中 的 高 度 重 复 串联 序 列 , 位 于 1 85 和
26 S rD N A 之间 ,被 5 . 85 rD N A 隔开为 IST I 和 I件 2 两
个区域 。 其结构如下图所示 :
1 8 5
r D N A
5
.
8 5
r D N A
I TS Z
6 S
r D NA
由于它所受选择压力较小 , 碱基替换及 同步进
化速率较快 、 拷贝数大 、 两端均连在 高度保守 区 , 长
度相对保守 (在所有的有花植物 中 , I巧 1 和 I邓 2 序
列均小于 30 0 bp , 5 . 8 5 r D N A 大多为 163 或 164 b p ,整
个 IST 区均小于 7 00 b p ) ,使它特别适用 于研究低级
分类群的系统演化关系川 。 这一点已经在许多实验
` 国家 白然科学基金资助项 目 ( 3 99 0 01 18 ) 。
` ’ 通讯作者 : Earn i l : . h e 司 q 66 @ s 〕`卜u C o m
DOI : 10. 13332 /j . 1000 -1522. 2003. s2. 011
北 京 林 业 大 学 学 报 第 25 卷
中得到了证实 。 如在芍药属囚的杂种确定 、 网状进
化 ,木兰属 0[] 的物种形 成 、 地理迁 徙等方面 , I作 序
列均显示出了很高的分辨率 。
本试验旨在摸索出蜡梅科植物 nr D N A 的 IST 序
列 P C R 扩增的最适反应条件 , 为后期的测序和分析
工作做准备 。
行预扩增 , 程序 1 为 : 94 ℃变性 3 m in , 然后 2 个循环
的预扩增 : 94 ℃变性 1而 n ~ 52 ℃复性 205 ~ 72 ℃延伸
5 0 5
,接着 3 5 个循环的 9 4 ℃ 20 5~ 5 2℃ 2 0 5~ 7 2 ℃ 5 0 5 ,
最后在 7 2℃延伸 8而 n 。 另 1种是直接扩增 , 程序 2
为 9 4℃变性 4而 n , 35 个循环的 94 ℃变性 1而 n~ 52 ℃
复性 1而 n~ 72 ℃延伸 l m in , 最后在 72 ℃延伸 8而 n 。
1 材料与方法
1
.
1 材料来源及总 D N A 提取
蜡梅 ( hC imo an n t h u 、 尹ar e e ox ) 、 柳叶蜡梅 ( hC i。 -
an 。 。h us s a lic 如之`。 ) 、 亮叶蜡梅 ( C h`。 an 。。h us 0 1` e。 ) 、
夏蜡梅 ( s ino e a clx a n t h u : 。人i n e ns is ) 、 美 国蜡梅 ( aC ly -
e a n oh。 少ir d us ) 和西美蜡梅 ( aC 加 a n rh u s o e e ide n ta lis )
的新鲜叶片均采 自华 中农业大学实验基地 。 另外 ,
本试 验采 用 了在 一 20 ℃ 下 保 存 2 年 的西 南 蜡 梅
( hC imo an
n th u s e a呷 a n u la t us ) o N A , 以 检测保 存时 间
对扩增效果的影响 。
D N A 提取方法基本按照 F er de icr k M . A us ub el 所
述的 cAT B 法进行 7[] , 但在沉淀 D N A 时用 2 倍体积
无水 乙醇代替 CTA B 沉淀液 。
1
.
2 试验设计
1
.
2
.
1 引物的选择
本试验中用了 2 对引物扩增整个 I巧 区 , l 对引
物参考 w ih te 在 19 90 年设计 的引物〔”」,序列如下 : 引
物 1 为 5 ’ 一 G GA AG T AA A AGT C G T A A C A A C C -
3
` , 结合位点距 18 5由N A 的 3 ’端 犯b p ;引物 2 为 5 ’ -
T C C T C C G C T T A T T G A TA T G C
一 3 ` , 结合 位点 距
2 6 S
r D N A 的 5 ’端 39 b p 。 另 l 对根据 G e n b a n k 资源 自
行设计 , 序列如下 : 引物 3 为 5 ` 一 A C T c C A C TG 从 C
e竹 A T e 一 3 ’ , 结合位点距 1 s s r D N A 的 3 ’端 79 b p ;
引物 4 为 5 ` 一 GC T GG G CT ( C A ) ( C T ) T C C C G G rT
e G 一 3 ’ ,结合位点距 2 6 s r n N A 的 5 ’端 9 6 b p 。 用引物
1 和引物 2 , 引物 3 和引物 4 ,引物 1 和引物 4 ,引物 2
和引物 3 , 4 种组合分别对各个物种进行扩增 。
1
.
2
.
2 反应条件的优化
1
.
2
.
2
.
I M扩十 浓度
在 2 0拜L 反应体系中 ,加人 l . s m , 一/ L d N T P ,弓}
物 l 和 4 各 12 . s p m o l , T a q 酶 1 . 5 单位 , n N A 模板约
2 0 n g
,
M扩十 浓 度 分 l 、 一 2 、 1 . 4 、 1 . 6 、 1 . 5 、 2 . 0 、
2
·
Zm m o l / L 7 个水平 。
1
.
2
.
2
.
2 d N T P 浓度
分 l 、 1 . 5 、 2 、 2 . s m m o l / L 4 个水平 , M扩+ 浓度 为
1
.
s mmo l/ L
,其它条件同上 。
1
.
2
.
2
.
3 二 甲基亚飒的浓度
分 0 、 5% 、 8 % 3 个水平 。 M扩+ 浓度为 l . s m m o l /
L
,
dN什 浓度为 Z m m ol / L ,其它条件同上 。
1
.
2
.
3 扩增程序的优化
本试验进行了 2 种扩增程序 的比较 。 1 种是进
2 结果与分析
2
.
1 D N A 质量对扩增效果的影响
用新鲜叶片提取的 D N A 纯度高 , 片段完整 , 故
扩增之后条带单一清晰 , 且产量高 。 但是用保存的
西南蜡梅 D N A 扩增时 , 条带弥散模糊 , 而且出现 了
非特异带 。 这可能是 由于存放过程中 D N A 自然降
解和微生物污染造成的 (图 1 ) 。
图 1 DN A 质量对扩增效果的影响
FI GI爪 E 1 E l孔咒 t s Of D NsA iw t h d i fe er n t o ir ig ns o n 即 l p l击 icat on o ul st
1 一 7 泳道分别是西 南蜡梅 、 蜡梅 、 柳叶蜡梅 、 亮叶蜡梅 、 夏蜡
梅 、 美国蜡梅和西美蜡梅
I五 n e s 1 to 7 ar e Ch乙noz an 瓜 h us e a呷 a n u la t璐 , C . 尸r a eox
,
C
.
s al ic如 il 。 , C . in te ns , is no ca l了拟瓜h o hc i ne ns 众 , ca 加a nt h。
加 ir d 。 , a n d 公 21少近a nt h us , e i去 nt a l必 , re s p e e t ive ly
2
.
2 引物选择
引物组合 l 和 2 , 3 和 4 , 1 和 4 均可 以得到较好
的扩增效果 。 但引物 1 和引物 2 最初是根据真菌序
列设计 的 ,所以如果所用 D N A 被污染 , 就有可能扩
增出真菌的 I玲 片段 。 试验中用该组合扩增出的产
物直接 测序 , 得 到 了与真菌 几班样 o sP h ae er al lat e ar ils
I件 序列 9 9% 同源的片段 。 引物 3 和 引物 4 是根据
高等植物的 18 5 及 2 6 sr D N A 序列设计 的 ,从而避免
了上述问题 ,但它们距 I巧 序列两端均较远 , 扩增片
段较长 ,不利于直接测序 。 因此本试验中 , 引物 1 和
4 组合最适用于扩增整个 I巧 片段 。
2
.
3 反应条件
2
.
3
.
I M扩十 浓度
M扩+ 的多少对 aT q 酶的活性起着决定性作用 ,
是实验 中最主要的影响因子之一 。 根据图 2 可以看
特刊 赵凯歌等 : 蜡梅科( Ca ly ca n tha c ea e) 若干植物 r nD N AI r’ S序列 P CR反应条件分析
出 , M扩十 过低时 , 没有扩增 产物或者 较少 , 当 M扩+
在 1 . s m m ol / L 时 , 产生的条带单一且量较 多 。 如果
浓度再升高的话 ,就 出现严重的拖带 , 给 D N A 测序
带来很大的不便 。
图 3 不同扩增程序对结果的影响
FI CU R E 3 E fe e t s
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f 山 fe er n t a m p l i if e at i o n nor
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s o n er s u il s
图的上半部分是程序 2 的扩增结果 ,下半部分 是程序 1 的结果
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图 Z M扩+ 浓度对扩增效果的影响
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e t s of M扩十 e o n e e n ora t i o n s o n a m p“ e iat o n r e s u l t s
1 一 9 泳 道 分别 是 对 照 , 10 帅 分 子 量 Mark er (最亮处 为
s o b p )
,
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,
1
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2
,
1
.
4
,
1
.
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,
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,
8
,
2
.
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Z m m o l / L
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,
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.
6
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.
8
,
2
.
0
,
2
.
2 m m o l / L
,
r e s拌 e * iv e ly
2
.
3
.
2 d NTP 浓度
当 dNTP 浓度为 2 m mo l/ L 时 , 可 以产生单一清
晰的条带 。 过高或过低时 ,会带来与 M扩+ 浓度变化
相似的结果 。
2
.
3
.
3 二甲基亚巩浓度
二甲基亚枫 的作用是消除模板 D N A 及引物二
聚体 。 蜡梅科植物比较古老 , G + C 含量偏高 , 所以
不加二甲基亚飒时 , 常常没有反应结果 ,但是当加入
5% 的二甲基亚矾 以后 , 就可 以 很好地解决这个 问
题 。 由于实验中加人 5% 和 8% 的二 甲基亚飒结果
基本一致 ,所以最终取 5 % 的浓度水平 。
2
.
4 扩增程序对实验结果的影响
在反应体系完全一致 的情况下 , 扩增程序不一
样 ,也会有不一样的结果 。 在本实验 中 ,程序 2 的反
应结果明显差于程序 1 , 主要表现在反应时间长 , 主
带量少 ,有时还会出现非特异带 (图 3 ) 。
综上所述 , 在 以下反应条 件下扩增效果 最佳 :
20拼L 反 应体 系 中 , 含 l . s nu o l / L M g CI:
,
2
~
0 1/ L
d NTP
, 引物 1 和 4 各 12 . s pmo l , 1’a q 酶 1 . 5 单位 , D N A
模板约 2 0 n g , l拜L D M S o 。 94 ℃预变性 3而 n , 接着 两
个循环的预扩增 : 9 4 ℃ l m i n , 52 ℃ 2 0 5 , 7 2℃ 5 0 5 ; 然后
94 ℃ 2 0 5 , 52 ℃ 2 0 5 , 7 2 ℃ 5 0 5 , 3 5 个循环 : 最后 7 2℃延
伸 s m i n (图 3 ) 。
3 问题与讨论
目前发表文章中所用 IST 序列引物很 多 , 其结
合位点及序列不尽相 同 , 其中 W ll it e 所 提及 的引物
是用的比较多的一类 。 但 如前所述 , 它与真菌序列
同源 ,所以如果所采叶样里寄生有真菌 ,或者提取过
程有污染的话 , 就可能扩增 出假带或者多条带 。 在
反应条件不合适的情况下 , 这一点 十分突 出 。 文中
所提及 的 卫介。 sP h ae er al alt e ar ils 属于哪一种情况还
需进一步病理学和解剖学实验证明 , 但它确是一种
植物 病 害 。 另 外 , 西 美蜡梅 还 是 真菌 八少zal ict in a
gu at at 的寄主 。 在这种情况下 ,对 引物的选 择就格
外重要 。
在进行引物设计时 , 除了留意 G + C 含量 、 退火
温度等经常提到的问题 ,还应该 : ①对 尽可能多的序
列进行 比较 , 找到最适合于实验对象 的一段区域 ; ②
用引物设计软件 ,如 V ce t or N皿 分析 , 可 以避免出现
引物二聚体或茎环结构等不利于 P C R 反应 的情况 ;
③ G e n e b a n k 上有的序列不十分可靠 , 所 以尽可能选
择那些 已公开发表论文中上传 的序列 。 ④所设计 的
引物最好 不要距 目的区 域 太远 , 从而避 免扩 增及
D N A 序列边界定位困难等问题 。
另外 , 反应程序和条件的不同 ,会对扩增产物质
量和数量产生很大的影响 , 这要在试验中反复摸索 。
参 考 文 献
张若蕙 ,沈湘林 . 蜡梅科的分类及地理分布与演化 . 北京林业大
学报 , 19 9 , 2 1 ( 2 ) : 7 一 11
( 下转 2 8 页 )
北 京 林 业 大 学 学 报 第 25 卷
改良梅花使之切合 (在欧洲 )实现产业化 目标
席 瓦
(意大利 S na er m o花卉栽培研究所遗传改 良室 )
摘要 这位意大利花卉专家在此短 文中阐述了他们对花卉产业化的一些看法 。 尤其对 于梅花 ,认为这一抗寒花木 的
抗霜冻耐低温能力极为 可贵 , 值得以之为材料开展分子水平研究 。 作者认为用梅花栽种在欧洲适宜的山地来布置 园
林 , 是彩化绿化中的一个创新亮点 。
(责任编辑 李 契 )
(上接 3 1 页 )
2 蒋英 ,李秉滔 . 中国植物 第 三十卷第二分册 . 北京 :科学 出版社 ,
197 9
3 郑万钧 . 中国树木 志 : 第二卷 .北 京 : 中国林业 出版社 , 19 85
4 B al d w i n B G
,
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e rs o n M J
, P n洲 t o r J M
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l明e n y . A n n M i s s o u ir B ot G a r c l , 19 9 5 , 8 2 : 2 47 一 2 77
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t i o rl i n 几 o n i e , ( 尸`记。 n i a ) u s i n g i n tern al t ar n sc ir统 d , p ac e : se 卿e n e e s o f
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P r oc N a t l A e ad S e i U S A
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19 5
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92
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6 8 13 ~ 6 8 17
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.
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19 7
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1 10
:
3 39 一 3肠
奥斯伯 , 布伦特 ,金斯顿 , 等 . 精编分 子生物学实验 指南 .颜 子颖 ,
王海林 译 .北京 : 科学出版社 , 19 98
Wh i
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B ru
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, 晚 e s , e t a l . A呷 l i if e a t i o n a n d di化 e t se 甲e n e i n g
Of fu n gal ir b
o s o m al RN A 罗 n e s of r p hy l o罗 n e ti e s . In : In n i s M A , eG lfa n d
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Sn ins k y J J
,
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.
CP R P
r o t佣 0 15 : a G u ide ot M e t h记 s
a n d Ap p ll e a t ion
.
S an Di e即 : A e ad e而 e P r e s , l 9 9() . 3 12 一 3 15
(责任编 辑 李 契 )