全 文 ：文章编号:1001-4829(2005)04-0387-05
　　收稿日期:2004-12-30
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30160073);云南大学植
物学博士点基金资助
作者简介:虞　泓(1962-),男 ,教授 ,博士生导师 ,现从事居群
生物学与保护遗传学研究。
亚洲系百合九个品种的亲缘关系研究
———来自 nrDNA ITS 证据
虞　泓1 , 2 ,毛　钧1 ,瞿素萍3 ,熊　丽3 ,李永谊2 ,和　锐2
(1.云南大学生命科学学院生态遗传学实验室,云南 昆明　650091;2.云南英茂生物技术实验室,云南 昆明　650212;3.云南省
农业科学院花卉研究所 ,云南 昆明　650205)
摘　要:对亚洲系百合 9个品种的 n rDNA 的内转录间隔区(ITS)进行了 PCR扩增和产物直接测序 ,扩增出约 670bp的序列(ITS 1 、
5.8S 和 ITS2及部分 18S 和 26S rRNA 基因片段)。选取亚洲系百合祖先种泸定百合和岷江百合等 6个野生种序列为参考外类群 ,
确定其 ITS全序列(ITS 1 、5.8S 和 ITS2)的长度约为 627bp ,并根据 nrRNA ITS 区碱基序列差异计算品种间的遗传距离和构建
UPGMA系统树 ,探讨了 9个百合品种之间的亲缘关系。
关键词:亚洲系百合;品种;nrDNA;ITS
中图分类号:S644.1　　　文献标识码:A
Study on the relationship of nine varieties of Asian Lilium
based on nrDNA ITS
YU Hong1 ,2 , MAO Jun1 , QU Su-ping3 , XIONG Li3 , LI Yong-yi2 , HE Rui 2
(1.Laboratory of Ecogenet ics , College of Li fe Science , Yunnan University , Yunnan Kunming 650091 , China;2.Immol Laboratory of
Biotechnology of Yunnan , Yunnan Kunming 650212 , China;3.Flower Research Insti tute , Yunnan Academy of Agricultu ral S ciences ,
Yunnan Kunming 650205 ,C hina)
Abstract:T he sequences of nrDNA ITS from nine varieties of Asian Li lium were analyzed in this study by PCR amplifi cat ion and direct ly
sequencing.The sequences of PCR products w ere about 670 bp including ITS 1 , 5.8 s , ITS 2 and some 18 s , 26 s rRNA gene f rag-
ments.By ferring to sequences of 6 ancest ral species such as Lil ium sargent iae , Li lium regale and so on , the length of ITS(ITS1 , 5.8S
and ITS2)of Asian Li lium w as set to about 627bp.Based on the dif ference in nrDNA ITS , the genet ic distance among varietes w ere cal-
culated and UPGMA tree w as const ructed to analyze the genet ic relat ionships of nine variet ies of Asian Li lium.
Key words:Asian Li lium ;variet ies;nrDNA;I TS
　　被子植物的核核糖体 DNA(nrDNA)是高度重
复的串联序列 ,由于同步进化的力量 ,绝大多数物种
的这些单位间已发生纯合或接近纯合[ 1] 。内转录
间隔区(I TS)是 18S ～ 26S 核 rDNA 转录单位的组
分 ,它包括 3个部分(图 1):5.8S 亚基(进化上高度
保守的序列)及其两端的 ITS1和 ITS2 两个间隔序
列[ 2] 。
被子植物的 ITS 存在于高度重复的 nrDNA
中 ,所受选择压力较小 ,碱基替换速率较快 ,且片段
长度变异很小 , ITS1和 ITS2的长度均不足300 bp ,
加上协同进化使该片段在基因组不同重复单元间非
常一致很适于被子植物科内 ,尤其是近缘属间及种
间关系等低级分类群的研究[ 1 ～ 3] 。曹晖等还认为
可将 ITS区用于种下一级分类群亲缘关系研究[ 4] 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验所用亚洲系百合 9个品种样品均由云南省
农科院提供 ,6 个外类群样品及序列由云南英茂生
物技术实验室小哨保育基地提供或从 Genebank下
载 。每个样品均进行了 2 ～ 3次重复测序以确保准
确性。样品编号 、来源和引种情况见表 1。
图 1　ITS区示意图
Fig.1　Diagram for the ITS region
387
2005年 18卷 4期
Vol.18　　No.4 　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
S outhwest China Jou rnal of Agricultu ral Sciences
表 1　用于 ITS分析的亚洲系百合材料
Table 1　The materials for ITS analysis
编号
Number
名称
Name
来源
Origin
引种
Introduction
LAA1 柠檬树　Lemon T ree 荷兰 昆明省农科院
LAB4 托瑞　Toro 荷兰 昆明省农科院
LAC5 石头　Stone 荷兰 昆明省农科院
LAD3 芭芭玛　Bananarama 荷兰 昆明省农科院
LAE5 伊儿　Elle 荷兰 昆明省农科院
LAF1 基多　Jumbo Qui to 荷兰 昆明省农科院
LAG1 黄线　Celine 荷兰 昆明省农科院
LAI3 火焰　Fire 荷兰 昆明省农科院
LAJ1 维克　Vicky 荷兰 昆明省农科院
LSP1 泸定百合　Li lium sargentiae 云南思茅普洱 昆明小哨
LRG1 岷江百合　Li lium regale Genebank AB020434＊
LBC1 滇百合　Lilium bakerian um 云南澄江梁王山 昆明小哨
LMG1 玫红百合　Li lium amoenum Genebank AB035284＊
LNY1 紫斑百合　Li lium nepalense 云南元阳胜春 昆明小哨
LLH1 卷丹　Lil ium lanci folium 湖南新宁 昆明小哨
　　注:带＊号者为 Genebank的 Locus编号。
1.2　DNA序列测定方法
1.2.1　总 DNA 提取 　基因组 DNA 提取采用
CTAB法[ 5] , 并稍作修改 。0.5 g 左右的植物组织
加入到4 mL 预热到65 ℃的 2×CTAB(含 2 %β-巯
基乙醇)中 ,研磨成糊状 , 65 ℃水浴 1 h ,冷却 ,加入
1/ 3体积 5 mol/ L的 KAc冰浴 1 h , 7 000 g 离心 3
min , 取上清 ,CI(氯仿∶异戊醇=24∶1)抽提 2次 ,取
上清加 3/ 4体积的异丙醇 , -20 ℃静置 30 ～ 60
min ,12 000 g离心 10 min , 70 %乙醇洗2次 ,无水乙
醇洗 1次。加 400 μl 1×TE ,室温静置 2h ,使 DNA
充分溶解 , 1 %琼脂糖凝胶电泳 , 溴化乙锭染色 , λ
DNA(25 , 50 ,100 ng/ μl)标定 ,利用 Kodak 凝胶成
像分析系统分析并标定到 20 ng/ μl备用 。
1.2.2 　PCR 扩增 　所用引物为 ITS5:5-GGA
AG T AAA AGT CGT AAC AAG G -3,位于 18S
上;ITS4:5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
-3,位于 26S 上 。第 1轮 PCR 扩增反应在 20 μl
体系中完成 , 反应液 含 1U Taq 酶 (Shanghai
Promega), 1.5 mmol/L MgCl2(Taq 酶配套), 125
μmol/L dN TPs(上海生工),两个引物各 0.05 μmol/
L(上海生工),1μl DM SO(上海生工 ,AMRESCO 进
口分装), 20 ng 模板 DNA , 1 ×PCR 反应 Buf fer
(Taq酶配套)。反应在 PE2400型 PCR仪(美国应
用生物系统公司)进行 ,采用梯度降温 PCR方法 ,循
环参数为 94 ℃预变性 5 min ,然后经 91 ℃变性 30
s ,60 ℃梯度降温退火 30 s(每个循环降温 1 ℃),72
℃延伸 30 s ,循环 15次后 ,将退火温度恒定在 46 ℃
再循环 20次 ,最后 72 ℃延伸 7 min ,灭菌水代替模
板 DNA 作空白对照 。10 μl PCR产物经 1.5 %琼
脂糖凝胶电泳检测扩增效果 ,并将扩增条带挖下转
入 1.5 mL 离心管 ,加水 100 μl ,沸水加热 5 min使
琼脂糖胶充分溶解 ,低速离心取上清液 2.5 μl进行
第二轮 PCR扩增 。第二轮扩增条件同第一轮 PCR
扩增 ,反应体系等量扩大到 50 μl。
1.2.3　PCR产物纯化　反应结束后将扩增产物全
部转入 1支新的 1.5 mL 离心管中(注意尽量不要
吸到石蜡油),按上海生工柱离心式 Golden Beads反
应体系 DNA纯化试剂盒(产品号 SK152)操作手册
进行 PCR产物直接纯化。
1.2.4　DNA 序列测定　用美国应用生物系统公司
BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing v2.0测序试
剂盒进行测序反应 ,测序反应的参数为:Kit-M ix 2
μl , 60 ng 纯化后的 PCR 产物 , I TS 引物(ITS5/
I TS4)3.2 pmol ,补水到 10 μl体系。测序反应条件
为 95 ℃预变性 5 min , 96 ℃变性 10 s , 50 ℃退火 5
s ,60 ℃延伸 4 min ,共 25个循环。
测序反应后的混合物中加入 2.5 μl , 1 %的
SDS ,使终浓度为 0.2 %,进行测序反应产物纯化 ,
以除去残余染料。具体方法为:98 ℃加热 5 min ,25
℃保温 10 min ,加入 40μl NaAc/ 无水乙醇混合物 ,
混匀 ,室温静置 15 min , 12 000 g 离心 20 min , 124
μl ,70 %乙醇洗 2次 , 12 000 g 离心 10 min , 100 μl
无水乙醇洗 1次 , 12 000 g 离心 10 min , 70 ℃加热
10 min挥干乙醇 ,加入 Loading Buffer 3 μl ,充分溶
解沉淀 。
重悬后的测序产物经 95 ℃加热变性 5 min后 ,
立即置于冰浴 5 min , 即可上样电泳测序。用 PE
Biosystems公司 ABI PRISM TM-377 型自动测序仪
进行序列测定。测序胶为 BMA 公司 Long Ranger®
Singel®packs ,测序模块为 Seq Run 48E-1200 。
1.3　DNA序列数据分析
对有 N 值和计算机误读的个别碱基进行人工
校对 ,用 DNASTAR商用软件包 SeqMan进行序列
拼接 , 截去测序引物序列 , 所得 DNA 序列经
ClustalX1.8进行多重对比重新排序后 ,将数据导入
MEGA 2.0软件 ,选取其祖先类群泸定百合 Lilium
sargent iae、岷江百合 Li lium regale 、滇百合 Lilium
bakerianu 、玫红百合 Li lium amoenum 、紫斑百合
388 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　18卷
Li lium nepalense和卷丹Lilium lanci folium 等 6个
野生种的 ITS 序列作为外类群 ,分析各样品间的遗
传距离 ,并构建其 ITS区基因序列分子系统树。
2　结果与分析
2.1　亚洲系百合 ITS 区的差异序列
从亚洲系 9个百合品种的叶片中提取的 DNA ,
扩增出约 670 bp 的核糖体内转录间隔区序列
(ITS1 、5.8 S 和 ITS 2)及部分 18 S 和 26 S rRNA
基因片段。用 ClustalX1.8 软件对 9个植物样品的
ITS区基因序列进行了排列 ,并参考 Genebank下载
的 Lil ium regale(AB020434)序列确定其 I TS 长度
约为 627 bp左右 。
测定的 ITS区的差异序列见图 2(无差异位点
已删除 , “.”表示具有相同碱基 , “ -”表示出现碱基
缺失)。
2.2　亚洲系 9个百合品种间遗传距离
根据 Kimura 2 参数遗传距离模型计算得到的
序列间遗传距离见表 2。
2.3　亚洲系百合品种的 UPGMA聚类图
亚洲系百合品种的 UPGMA 聚类图见图 3。
LAA1.seq T TTCCGTAGG TGACCCTGCG AAAGGATCAT TGTC-GAGAA TCGATTGAGA GACCGCGAAC CTGTAAACGGATGATACCGT
LAB4.seq..................-......-........-.............................................
LAC5.seq. ...................G.............-.............................................
LAD3.seq..................-.G ......TC...G.-..A......A...................................
LAE5.seq..................................CA............................................
LAF1.seq..................--G......T......-.......................................C.....
LAG1.seq. .................-.G .............-.............................................
LAI3.seq. ............A....................-.............................................
LAJ1.seq.......................-......--TC................-............................
LAA1.seq GGCCCTCCGT GCCTCGTGTG CGGCGGGCTT AAGCGCGGGC TGTCGGCGTC GGGATGGGCA CGACGAGTGGTGGACGGAGC
LAB4.seq......................................................A.........................
LAC5.seq......................................................A.........................
LAD3.seq......................................................A.........................
LAE5.seq......................................................A.........................
LAF1.seq................................................................................
LAG1.seq......................................................A.........................
LAI3.seq................................................................................
LAJ1.seq......................................................A.........................
LAA1.seq ACCAGCAGGA TGTTGTGGTC CCCCGTCGCC TTAAGGGGCT CAAGAGACCC GGACTAGGCG AGCCGTGCTCCGTAAGAGGA
LAB4.seq................................................................................
LAC5.seq.............................................................A..................
LAD3.seq................................................................................
LAE5.seq................................................................................
LAF1.seq................................................................................
LAG1.seq................................................................................
LAI3.seq.............................................................................A..
LAJ1.seq..................................................................-..T.....A.A..
LAA1.seq GGGCGAGCCG -TCTCGCAAT
LAB4.seq..........-.........
LAC5.seq..........-.........
LAD3.seq.........C G.T.T -....
LAE5.seq...A......-.........
LAF1.seq..AGA.AG.C G....T....
LAG1.seq...A......-.........
LAI3.seq A.........G.........
LAJ1.seq.........-G....-....
图 2　9 个百合品种的 nrDNA ITS序列差异
Fig.2　The difference in nrDNA ITS sequences of nine variet ies of Li lium
3894期 虞　泓等:亚洲系百合九个品种的亲缘关系研究———来自 nrDNA ITS证据
表 2　百合品种间遗传距离
Table 2　Genet ic distances of Li lium variet ies
编号 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10] [ 11] [ 12] [ 13] [ 14] [ 15]
[ 1 ] 0.009 0.007 0.011 0.009 0.009 0.009 0.008 0.014 0.037 0.037 0.036 0.036 0.038 0.034
[ 2 ] 0.020 0.008 0.011 0.009 0.009 0.009 0.008 0.014 0.037 0.037 0.035 0.036 0.038 0.033
[ 3 ] 0.012 0.016 0.008 0.006 0.006 0.006 0.005 0.012 0.036 0.036 0.034 0.034 0.036 0.033
[ 4 ] 0.032 0.037 0.020 0.008 0.009 0.010 0.010 0.012 0.038 0.038 0.037 0.037 0.039 0.035
[ 5 ] 0.024 0.024 0.012 0.020 0.006 0.005 0.007 0.011 0.036 0.036 0.035 0.036 0.037 0.033
[ 6 ] 0.024 0.024 0.012 0.024 0.008 0.007 0.007 0.012 0.037 0.037 0.036 0.036 0.038 0.034
[ 7 ] 0.024 0.024 0.012 0.028 0.008 0.016 0.007 0.011 0.036 0.036 0.035 0.036 0.037 0.033
[ 8 ] 0.020 0.020 0.008 0.028 0.012 0.012 0.012 0.012 0.035 0.035 0.033 0.034 0.036 0.032
[ 9 ] 0.053 0.054 0.040 0.044 0.036 0.044 0.036 0.040 0.039 0.039 0.037 0.038 0.039 0.035
[ 10] 0.257 0.256 0.241 0.260 0.253 0.262 0.252 0.238 0.276 0.004 0.010 0.011 0.011 0.010
[ 11] 0.257 0.256 0.241 0.260 0.253 0.262 0.252 0.238 0.276 0.008 0.010 0.011 0.010 0.010
[ 12] 0.246 0.245 0.230 0.248 0.242 0.250 0.241 0.227 0.265 0.060 0.062 0.005 0.008 0.006
[ 13] 0.251 0.250 0.235 0.254 0.247 0.256 0.246 0.232 0.270 0.067 0.069 0.015 0.009 0.008
[ 14] 0.269 0.268 0.252 0.271 0.264 0.273 0.263 0.249 0.276 0.064 0.066 0.035 0.043 0.007
[ 15] 0.227 0.219 0.211 0.229 0.217 0.226 0.216 0.202 0.239 0.057 0.062 0.026 0.036 0.030
　　注:表中左下为遗传距离 ,右上为标准误。[ 1] Fire , [ 2] Vicky , [ 3] Lemon T ree , [ 4] Jumbo Quito , [ 5] Celine [ 6] Elle , [ 7] Stone , [ 8]
Toro , [ 9] Bananarama , [ 10] L.sargent iae , [ 11] L.regale(AB020434), [ 12] L.bakerianum , [ 13] L.amoenum (AB035284), [ 14]
L.nepa lense , [ 15] L.la ncifolium 。
3　讨　论
3.1　亚洲系百合的品种间亲缘关系
在 MEGA 2.0 软件得出 UPGMA 聚类图上我
们可以看到亚洲系百合 9个品种与其外类群的亲缘
关系得到很好的分辨 。
在亚洲系 9 个品种当中 , Lemon Tree 与 To ro ,
S tone与Celine ,Fire与Vicky 首先两两聚为一组 ,再
依次与 Elle 、Jumbo Quito 和 Bananarama 聚合 。虽
然聚类树中亚洲系百合各品种间的关系能够分开 ,
但从遗传距离来分析 ,绝大多数品种间遗传距离非常
小 , 如 Lemon Tree 与 Toro (0.0 0 8)、Celine与Stone
图 3　百合 UPGMA系统树
Fig.3　Dendrogram constructed by UPGMA
(0.008)、Fire 与 Vicky(0.020)Elle 与 Jumbo Quit
(0.024)等品种间 。而系统树上分得较开的 Jumbo
Quito 和 Bananarama两个品种与其它品种间的遗传
距离也只有 0.020 ～ 0.054。
所选用的 6个复合外类群在图的下部两两聚为
3组 ,分别对应百合属中的百合组 、钟花组和卷瓣
组 。组内的遗传距离依次为 0.008 、0.015 和
0.030 ,组间的遗传距离在 0.026 ～ 0.069 ,且钟花组
与卷瓣组的遗传距离相对要小一些。
亚洲系 9个品种与外类群 3个组之间的遗传距
离差别不大 。
综上所述 ,亚洲系百合 9个品种间的遗传距离
在 0.008 ～ 0.054 , 相比与外类群间的遗传距离
0.202 ～ 0.276要小得多 ,而且亚洲系 9个品种与外
类群 3个组之间遗传距离的差别并不大。由此推测
9个亚洲系百合品种很可能来源于共同的或者相当
近缘的亲本 , 特别是 Lemon Tree 、Toro 、Celine 、
Stone 、Elle、Vicky Fire 和 Jumbo Quit这 8个品种应
该是单一的组内亲本杂交 。而 Bananarama 由于与
上述 8 个品种间的遗传距离明显较大(0.036 ～
0.054),甚至超过了钟花组和卷瓣组间的遗传距离
(0.026 ～ 0.043),接近百合组与前两组间的遗传距
离(0.057 ～ 0.069),所以也不排除组间杂交的可能。
另外亚洲系百合经过近百年的人工杂交育种 ,已经
390 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　18卷
使园艺品种间的遗传关系日趋接近 ,与其原始的野
生祖先种的遗传距离却渐渐拉大了 。在遗传距离较
远的两个品种间进行人工杂交育种 ,也许能得到不
同性状的分离。
3.2　测序 PCR条件的优化
有关利用 nrDNA ITS 区对植物进行系统发育
的研究 ,国内外学者曾作过了一些报道 。因 ITS 序
列的进化速率较快 ,等位基因间乃至 I TS 的不同拷
贝之间都可能存在序列上的差异 ,利用其探讨系统
发育过程时 ,PCR直接测序法明显优于克隆测序 ,
因克隆的为单个分子 ,对杂合位点无能为力 ,除非同
时对很多克隆进行测序 , 否则就存在代表性的问
题[ 6] 。
在研究中 ,我们发现用常规 PCR方法扩增目的
条带时 ,经常会出现一些非特异的扩增片段 ,即使在
提高退火温度 、降低 MgCl2 用量 、甚至加入二甲基
亚砜(DMSO)等增强 PCR反应特异性的试剂的情
况下也会有少量非特异带出现 。降落式多聚酶链式
反应(Touchdown PCR , TD-PCR)代表了一种完全
不同的 PCR优化方法 ,由于开始时的退火温度选择
为高于估计的 Tm 值 ,随着循环的进行 ,退火温度
逐渐降到 Tm 值 ,并最终低于这个水平 。这个策略
有利于确保第一个引物-模板杂交事件发生在最互
补的反应物之间 ,即那些产生目的扩增产物的反应
物之间 。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的
Tm 值 ,但此时目的扩增产物已开始几何扩增 ,在剩
下的循环中处于超过任何滞后(非特异)PCR产物
的地位[ 7] 。结合本实验室用梯度降温 PCR方法使
RAPD反应的稳定性和重复性大大提高的情况 ,我
们将 TD-PCR应用于 ITS 特异性片段的扩增 ,结果
证实该方法能极大程度的消除非特异性片段的扩
增 ,也能保证同一样品中不同 I TS 片段的扩增 ,非
常适合 ITS 区基因片段的特异性扩增 。两轮 PCR
方法的采用 ,在很大程度上消除了模板 DNA 对测
序反应的影响 ,第一轮扩增相当于将模板 DNA 质
量进行了一次近乎 100 %的纯化 ,使测序质量明显
提高。
参考文献:
[ 1] 王建波 ,张文驹 ,陈家宽.核 rDNA 的序列在被子植物系统与进
化研究中的应用[ J] .植物分类学报 , 1999 , 37(4):407-416.
[ 2] 包英华 ,白　音.ITS序列在被子植物系统学上的应用[ J] .内蒙
古科技与经济 , 2000文献版:152.
[ 3] Brown T A.Genomes[ M] .BIOS Scientifi c Publishers Limited ,
1999.
[ 4] Cao Hui , Liu Yu-ping , Shao Peng-zhu , et al.The actuali ty and
prospect of DNA fingerprinting and sequencing technique for qualit y
research of Chinese medicinal materials[ J] .China Jou rnal of Chinese
Materia Medica(in Chinese), 1998 , 23(11):643 - 645.
[ 5] Dolye J J , Dolye J L.A Rapid isolat ion procedu re for small quanti-
ties of f resh t issue[ J] .Phytochem Bull , 1987 , 19:11 - 15.
[ 6] Wang Xiao-quan , Hong De-yuan.Progress in molecular systematics
of plants in recent f ive years[ J] .Acta Phytotaxonomica S inica(in
Chinese), 1997 , 35(5):465 - 480.
[ 7] Dief fenbach C W , Dveksler G S.PCR Primer:A Laboratory Man-
ual [ M ].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1995.
(责任编辑　王家银)
3914期 虞　泓等:亚洲系百合九个品种的亲缘关系研究———来自 nrDNA ITS证据