全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2011)03 － 1050 － 06
收稿日期:2011 － 03 － 01
基金项目:国家“863”计划(2006AA10Z110、2006AA10A113) ;国
家自然科学基金(30771237) ;重庆市科技攻关项目(CSTC
2009AB1030)
作者简介:呼丽君(1983 －) ，男，山西吕梁人，硕士研究生，主要
从事植物分子遗传与遗传工程研究，* 为通讯作者。
芸薹属 DFR基因家族 RNA干扰载体的构建
呼丽君1，柴友荣1* ，张建奎1* ，姚永宏2
(1．西南大学农学与生物科技学院，农业部生物技术和作物品质改良重点实验室，重庆市油菜工程中心，重庆市作物品质改良重点
实验室，重庆 400716;2．重庆市农业科学院，重庆 401329)
摘 要:二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)是类黄酮途径的一个关键酶，对种皮色泽和花色的形成具有重要
作用。本研究从甘蓝型油菜克隆了 600 bp (不计人工酶切位点)的芸薹属 DFR 基因家族的 RNA干扰片段 BDFRI，将其反义片段
和正义片段分别插入到本课题组新近改造的植物 RNAi平台载体 pFGC5941M的启动子与间隔区之间、间隔区与终止子之间，构建
了 11 400 bp的 RNAi干扰载体 pFGC5941M-BDFRI，通过多重 PCR鉴定证实载体构建成功，并转化到根癌农杆菌菌株 LBA4404 中
形成了工程菌株。此载体的构建为进一步研究 DFR基因参与决定芸薹属种皮色素和茎叶彩色性状的分子机理和代谢调控奠定了
基础。
关键词:芸薹属;甘蓝型油菜;二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR) ;RNA干扰;种皮颜色;载体构建
中图分类号:Q784 文献标识码:A
Vector Construction for RNAi of Brassica DFR Gene Family
HU Li-jun1，CHAI You-rong1* ，ZHANG Jian-kui1* ，YAO Yong-hong2
(1． Chongqing Key Laboratory of Crop Quality Improvement，Chongqing Rapeseed Engineer Research Centre，Key Laboratory of Biotechnol-
ogy and Crop Quality Improvement of Ministry of Agriculture，College of Agronomy and Biotechnology，Southwest University，Chongqing
400716，China;2． Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 401329，China)
Abstract:Dihydroflavonol-4-reductase (DFR)is a key enzyme of phenylpropanoid-flavonoid pathway． It plays important roles in pigmenta-
tion of seed coat and plant surface． A 600-bp (not including the artificial enzyme sites)RNAi fragment，BDFRI，targeted to Brassica DFR
gene family was cloned from Brassica napus． Its antisense and sense fragments were inserted to the promoter-spacer and spacer-terminator clo-
ning sites of plant RNAi platform vector pFGC5941M which was modified by this research team recently，forming the 11400-bp RNAi vector
pFGC5941M-BDFRI． It was successfully verified by multiple PCR checking and then transformed into Agrobacterium tumefaciens strain
LBA4404 to form engineering strain． Construction of this vector will lay a basis for clarifying the molecular mechanism of DFR in participat-
ing in the determination of Brassica seed coat pigments and stem / leaf colors and for metabolism regulation．
Key words:Brassica;Brassica napus;Dihydroflavonol-4-reductase (DFR) ;RNA interference;Seed color;Vector construction
甘蓝型油菜(Brassica napus)是世界和中国最为
重要的油料作物之一，在相同遗传背景下黄籽油菜
较黑籽油菜具有含油量和蛋白质含量高、种皮薄、纤
维素和多酚化合物含量低、油质清澈透明、杂质少、
饼粕对畜禽适口性好、成熟度较易鉴定、便于适时收
获等一系列优点［1］。因此黄籽油菜已越来越被育
种家们所重视，特别是甘蓝型黄籽油菜新品种的选
育，已成为提高种子含油量，改进油菜品质的一条重
要途径。但甘蓝型油菜黄籽性状研究又是一个世界
性的难点。芸薹属中，甘蓝型油菜是由二倍体物种
甘蓝(B． oleracea，CC)和白菜(B． rapa，AA)通过天
然远缘杂交、染色体自然加倍后进化而来的异源四
倍体物种。甘蓝和白菜中均存在稳定遗传的天然纯
黄籽材料，而甘蓝型油菜中则没有天然的黄籽材料。
现有的甘蓝型油菜黄籽材料是通过种间杂交选育而
来的，选育周期长、难度大，黄籽材料奇缺，且黄籽性
状的表现型极易受环境影响而不稳定，黄籽度和黄
籽率还不够理想，一直是妨碍黄籽油菜育种的主要
因素［2］。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物的研究表
明，种皮色素主要是原花青素(proanthocyanidin，
0501
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2011 年 24 卷 3 期
Vol. 24 No. 3
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2011.03.053
PA)聚合而成的多酚类色素物质，它是类黄酮生物
合成途径的产物。它分布于植物的果实、皮、叶和种
子，具有防护猎食者的功能，同时还赋予酒、果汁等
饮料独特的味道，对人体健康也有益，还是饲料作物
的主要有益成分［3］。种皮中的 PA 保护胚和胚乳，
在胚胎发育早期是无色的，在种子成熟和干燥过程
中形成棕色或红棕色的氧化复合物。花青素苷则是
植物花朵和其它体表器官中继叶绿素之后的另一大
类色素，赋予了花朵、茎、叶等的丰富色彩。花青素
(花青素苷的非糖苷部分)和原花青素均是类黄酮
途径(flavonoid pathway)的产物，该途径位于公共苯
丙烷途径(common phenylpropanoid pathway)的下
游。拟南芥等植物中，原花青素以花青素作为前体
物质，通过一步或多步酶促反应而形成［4 ～ 6］。
二氢黄酮醇 4-还原酶(Dihydroflavonol-4-reduc-
tase，DFR)属于依赖 NADPH的还原酶［7］，属于 DFR
超家族，是类黄酮途径的一个关键酶，最早由 O’
Reilly等［8］采用转座子标签技术从玉米和金鱼草中
分离得到。它催化二氢黄酮醇类物质如香橙素(di-
hydrokaempferol，DHK，又叫二氢山萘素)、二氢槲皮
素(dihydroquercetin，DHQ)或二氢杨梅素(dihydro-
myricetin，DHM)形成无色花青素(leucoanthocyani-
din) ，它是进一步合成花青素和原花青素的重要中
间产物(Bartel and Matsuda，2003;Debeaujo et al．，
2003) ，并且在花色的修饰中起重要作用［9］。DFR
还是色素生物合成的一个遗传调控要素，黄籽埃塞
俄比亚芥中 DFR表达减少，花青素含量也减少［10］。
在拟南芥中，tt3 突变体导致种皮原花色素的降低，
使种子呈现黄色，与野生型的深褐色种子区别明
显［11］。
RNA干扰(RNAi)是由双链 RNA 介导的一种
转录后基因沉默，广泛应用于基因的功能分析。基
于基因保守区的 RNAi 设计，可以沉默整个基因家
族。也可以基于非保守区设计 RNAi，用于仅沉默其
中的部分成员或单个成员。在作物遗传育种中，
RNAi比反义 RNA技术具有更好的沉默效果和稳定
性［12 ～ 13］。
芸薹属重要物种甘蓝、白菜和甘蓝型油菜的
DFR基因家族成员的基因组和全长 cDNA序列已经
克隆，在此基础上，构建了芸薹属 DFR 基因家族的
RNA干扰载体，有助于揭示 DFR 参与芸薹属色素
积累、花色形成、种皮色泽等性状形成的分子机理，
为创造黄籽油菜和修饰芸薹属的茎叶色彩奠定了基
础。
1 材料与方法
1. 1 材料、载体和菌株
甘蓝型油菜品系 5B 生殖器官(蕾、花、花后 3
个发育阶段的种子)的混合总 cDNA 为本课题组从
前制备并保存于 － 20 ℃。大肠杆菌(Escherichia co-
li)菌株 DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefa-
ciens)菌株 LBA4404。pMD19-T 载体购自大连宝生
物工程有限公司。植物 RNA 干扰平台载体 pF-
GC5941M是由本课题组在 pFGC5941 (购自位于俄
亥俄州立大学拟南芥生物资源中心)的基础上改进
而成［14］。
1. 2 试剂盒和主要试剂
各种限制性内切酶为 Roche 公司产品，DNA 连
接试剂盒、Taq DNA 聚合酶及 PCR 相关试剂、
DL2000 plus和 λ-HindIII 分子量标准购自大连宝生
物工程有限公司。胶回收试剂盒、小量质粒抽提试
剂盒购自杭州博日科技有限公司。氨苄青霉素
(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、链霉素
(Str)等试剂购自上海生工生物工程技术服务有限
公司。引物合成和测序由上海英骏(Invitrogen)公
司完成。
1. 3 芸薹属 DFR基因家族 RNA干扰片段的克隆
根据已克隆的甘蓝型油菜 DFR (BnDFR)、甘
蓝 DFR (BoDFR)、白菜 DFR (BrDFR)基因家族全
长序列及与拟南芥 DFR基因进行多重比对，针对该
基因家族的特异的保守区，以 BnDFR1 基因全长
cDNA对应的区段作为干扰片段，设计了引物 FBDFRI
(GGATCCGACGTCTATAACAACATCTATGCCGCCTA )
和 RBDFRI (TCTAGACCATGGCAATAGATCCATATT-
AGATACGGG)。为便于定向克隆，在上游引物的 5’引
入一个 BamH I和一个 AatII位点，在下游引物的 5’
引入一个 XbaI和一个 NcoI位点。
以甘蓝型油菜 5B总 cDNA为模板，用引物组合
FBDFRI + RBDFRI扩增芸薹属 DFR 基因家族干扰
片段 BDFRI，50 μl标准体系含 0． 5 μl模板和 1． 5 U
Taq DNA聚合酶，其它成分为常规含量。PCR 循环
条件为:94 ℃预变性 2 min;94 ℃变性 1min，58 ℃退
火 1 min，72 ℃延伸 1 min，35 个循环;72 ℃最后延
伸 10 min。PCR 产物经 1 % 的琼脂糖凝胶电泳，
Goldview 染色后，在紫外观测仪中切下目的条带
BDFRI，依照 Biospin 胶回收试剂盒的说明进行回
收。
将回收的 BDFRI 片段与 pMD19-T 载体按照连
接试剂盒说明进行 10 μl 标准体系连接，得到
pMD19-T-BDFRI，然后转化用 CaCl2 二次重悬法制
备的 DH5α感受态细胞，通过 Amp (100 mg /L)抗性
和 IPTG /X-gal 蓝白斑筛选［15］，白色菌落克隆子的
菌液采用 PCR 鉴定，程序同上，只是预变性时间增
15013 期 呼丽君等:芸薹属 DFR基因家族 RNA干扰载体的构建
加到 5 min，循环数增加到 35 个，阳性克隆子送样测
序。
1. 4 反义片段的插入
引 物 FBnPAP2I2、 RBnPAP2I2、 F35S3N、
ROCST5N的序列请见参考文献［14］。
将含有 pMD19-T-BDFRI 的 DH5α 单克隆培养
到对数晚期，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。用
NcoI + AatⅡ完全双酶切 pMD19-T-BDFRI，50 μl 体
系含质粒 20 μg、两种酶各 10 U和 1 × Tango buffer。
pFGC5941M也进行相同的完全双酶切。37 ℃酶切
过夜，酶切完全后分别进行电泳，纯化回收反义片段
BDFRIA和 pFGC5941M 载体骨架。将回收的两个
片段通过连接试剂盒进行 10 μl 标准体系连接，将
反义片段亚克隆到 pFGC5941M 中 CaMV 35S 启动
子与间隔区之间。连接产物转化大肠杆菌 DH5α感
受态，挑取抗 Kan (100 mg /L)单克隆菌落培养，用
引物组合 F35S3N + FBDFRI 和 RBDFRI + RBn-
PAP2I2 对克隆子进行菌液 PCR 检测，体系及程序
同前。选取全阳性克隆子提取质粒，命名为 pF-
GC5941M-BDFRIA。
1. 5 正义片段的插入
用 BamHI + XbaI 完全双酶切质粒 pMD19-T-
BDFRI和 pFGC5941M-BDFRIA，体系同前。37 ℃酶
切过夜，酶切完全后分别进行电泳，电泳后回收正义
片段 BDFRIS 和开环的 pFGC5941M-BDFRIA 骨架，
将二者进行 10 μl 标准体系连接，转化 DH5α 感受
态，挑取单克隆菌落，进行多种菌液 PCR检测，全阳
性者为重组质粒 pFGC5941M-BDFRI，即 BDFR 基因
家族 RNA干扰载体。
1. 6 RNA干扰载体转化根癌农杆菌
根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备同
DH5α，采用液氮冷激法转化 pFGC5941M-BD-
FRI［16］，涂布于含 Kan (100 mg /L)、Rif (40 mg /L)
和 Str (20 mg /L)的 YEB平板，28 ℃倒置培养 2 d，
长出直径 2 mm 左右的菌落，挑取抗性菌落接种于
含有与前面相同抗生素的 YEB液体培养中培养，菌
液 PCR检测同 1． 5，全阳性单克隆经液体培养后作
为植物转化的工程菌株。
2 结果与分析
2. 1 芸薹属 DFR基因家族 RNA干扰片段的克隆
以甘蓝型油菜 5B 生殖器官混合总 cDNA 为模
板，用引物组合 FBDFRI + RBDFRI 进行扩增，得到
一个约 650 bp的特异条带，胶回收、T-载体克隆后，
送 2 个 PCR 阳性的克隆子测序，得到一致的序列，
均为 624 bp (含人工酶切位点) ，为 BDFRI片段(图
1)。经与本课题组所克隆的芸薹属 DFR 基因家族
各成员进行多重比对，发现其对应于 BnDFR1 全长
cDNA的 654 ～ 1253 bp，与其它基因成员的一致性
为 98． 0 % ～100 %。经 NCBI BLASTn比对，该片段
与已登录的甘蓝、大白菜、芥菜型油菜 DFR mRNA
的一致性分别为 99 %、98 %和 98 %，其 1 ～590 bp与
同科的拟南芥的 DFR/TT3 mRNA的一致性为 84 %。
2. 2 反义片段的插入和鉴定
对 pFGC5941M载体也进行 NcoI + AatII 进双酶
切，1 %琼脂糖凝胶电泳检测，和预期的酶切图谱一
致(图 2A) ，回收约 10kb 的载体骨架。对含有干扰
片段 BDFRI的质粒 pMD19-T-BDFRI 用 NcoI + AatII
进行相同的双酶切，经过 37 ℃过夜彻底酶切后，经
1 %琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条约 624 bp 的条
带，与预期片段大小相一致(图 2B) ，回收该反义片
段。反义片段与载体骨架进行 10 μl 标准连接，转
化 DH5α 感受态，挑取单克隆，采用引物组合
F35S3N + FBDFRI 和 RBDFRI + RBnPAP2I2 同时进
行 PCR检测，分别扩增出与预期的 728 和 791 bp一
致的条带(图 2C、图 2D) ，说明反义片段已插入到
pFGC5941M的启动子与间隔区之间，形成了中间载
体 pFGC5941M-BDFRA。
2. 3 正义片段的插入和鉴定
对 pMD19-T-BDFRI进行 BamHI + XbaI双酶
M:DL2000 plus marker
图 1 干扰片段 BDFRI的 PCR扩增(左)和序列(右)
Fig． 1 Amplification (left)and sequence of BDFRI (right)
2501 西 南 农 业 学 报 23 卷
切，经过 37 ℃过夜彻底酶切后，经 1 %琼脂糖凝胶
电泳检测，得到一条约 624 bp 的条带，与预期片段
大小相一致(图 2E) ，回收该正义片段。提取 2． 2 中
构建成功的中间载体 pFGC5941M-BDFRA 的质粒，
进行 BamH I + XbaI 双酶切，电泳后回收开环的载
体骨架(图 2F)。正义片段与中间载体骨架采用试
剂盒进行 10 μl 标准体系连接，转化 DH5α 感受态
细胞，用引物 FBnPAP2I2 + RBDFRI 和 FBDFRI +
ROCST5N 检测克隆子，扩增出了与预期 805 和
743bp一致的条带(图 2G)。同时，对单克隆菌液还
采 用 F35S3N + RBPAP2I2 和 FBnPAP2I2 +
ROCST5N进行 PCR 检测，再次验证反义片段和正
义片段插入的位置和大小，结果分别扩增得到与预
期 895 和 924 bp 一致的片段，与预计大小相符合
(图 2H)。综合 PCR鉴定表明，BDFRIA片段在 35S
启动子与间隔区之间反义插入，BDFRIS片段在间隔
区与终止子之间正义插入，两个片段的插入大小和
方向均正确，表明 RNA 干扰载体 pFGC5941M-BD-
FRI构建成功。
2. 4 转化农杆菌及菌株的鉴定
提取重组质粒 pFGC5941M-BDFRI，通过液氮冷
激法转化根癌农杆菌菌株 LBA4404，挑取抗 Kan +
图 2 RNAi载体 pFGC5941M-BDFRI构建中的酶切和 PCR鉴定
Fig． 2 Restriction digestions and PCR checking involved in construction of RNAi vector pFGC5941M-BDFRI
35013 期 呼丽君等:芸薹属 DFR基因家族 RNA干扰载体的构建
图 3 RNAi载体 pFGC5941M-BDFRI质粒图
Fig． 3 Plasmid map of RNAi vector pFGC5941M-BDFRI
Str + Rif的单克隆子，采用与图 2C、图 2D、图 2G 相
同的方案进行 PCR 检测，得到相同的检测结果，说
明 RNA干扰载体已成功转入到农杆菌，形成了工程
菌株。pFGC5941M-BDFRI 大小为 11 400 bp，其质
粒图见图 3。
3 讨 论
由于甘蓝型油菜中没有天然的黄籽材料，现有
的甘蓝型油菜黄籽材料都是通过种间杂交选育而来
的，黄籽性状的表现型极易受环境影响而不稳定，黄
籽度和黄籽率还不够理想，一直是妨碍黄籽油菜育
种的主要因素［2］。甘蓝和白菜中稳定表现型的黄
籽材料种子中 DFR接近零水平的表达，为我们对通
过基因工程抑制 DFR 表达成功创造稳定表型的黄
籽甘蓝型油菜提供了重要参考。本研究构建了芸薹
属 DFR基因家族 RNAi 载体，有望通过转基因抑制
所有 DFR 成员的表达，阻断种皮色素合成，揭示
DFR在油菜黄籽性状分子育种中的潜力。
在类黄酮途径中，第一步由查尔酮合酶(CHS)
催化，以丙二酰 CoA及 4-香豆酰 CoA为底物，生成
四羟基查尔酮，随后被查尔酮异构酶(CHI)催化而
形成黄烷酮，然后在黄烷酮-3-羟化酶(F3H)的催化
下生成二氢黄酮醇。DFR、花青素合成酶(ANS /
LDOX)将无色的二氢黄酮醇转化成花青素［17］，其中
DFR是花色素特异途径的第一个酶。类黄酮途径
的基因分为“早期”基因和和“晚期”基因，且两者具
有独立的表达调控模式，CHS /TT4、CHI /TT5、F3H /
TT6 等基因属于“早期”基因，而 DFR 属于“晚期”
基因且编码“晚期”基因中的第一步关键酶［18］，所以
认为 DFR可能主要参与种皮色素、花色素苷的合
成。通过基因工程抑制 DFR表达后，种皮色素及植
株花青素苷应有明显减少。拟南芥的研究表明，类
黄酮途径的一些调控因子如 TT2、TT8、TTG1 等参与
了 DFR基因的表达调控［5］，所以通过构建二元或多
元载体对芸薹属物种的黑籽 /黄籽材料中这些转录
因子及其与 DFR表达的关系的研究，将有助于阐明
芸薹属种皮色泽性状的调控机理。DFR 将类黄酮
途径引向花青素特异途径，是花色基因工程的重要
操作对象，矮牵牛、蓝猪耳等花卉转化 DFR 以后均
显示了花色修饰效果。油菜等芸薹属植物花色的成
分、代谢途径、是否有 DFR参与等问题均不清楚，因
此调查 RNAi抑制其 DFR 以后花色是否获得修饰，
有助于回答上述问题。
RNAi在各种生物中是保守的，在植物中 RNAi
是通过双链 RNA区产生发夹结构的转基因实现的。
已证明发夹结构诱导的 RNAi 比反义的基因沉默更
有效［13］。RNAi 既可用于对不同成员进行分别沉
默，也可用于对整个基因家族进行有效沉默。因此
基因沉默也可以作为多倍体植物调控基因表达和探
究整个基因组基因功能研究的有效工具。本课题组
经过近几年对芸薹属物种甘蓝、白菜和甘蓝型油菜
类黄酮途径中基因家族的克隆和功能比较基因组学
研究，进一步证明了甘蓝和白菜是甘蓝型油菜的亲
本物种，对芸薹属 DFR基因家族的克隆和全长两两
比对也表明，BnDFR、BoDFR、BrDFR 基因家族所有
成员间在全长 mRNA水平上的一致率介于 96． 9 %
～ 100 %之间，相似率介于 98． 7 % ～100 %之间，相
互之间的同源性非常高。因此理论上推测干扰载体
pFGC5941M-BDFRI可用于甘蓝型油菜、白菜、甘蓝
等多个芸薹属物种的转基因，介导 DFR 基因家族的
高效沉默，为明确 DFR在芸薹属种皮色素和植株花
青素苷合成途径中的分子生物学机理和分子育种奠
定了基础。
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(责任编辑 李正华)
55013 期 呼丽君等:芸薹属 DFR基因家族 RNA干扰载体的构建