全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１３（２４）：９２～９５
第一作者简介：孙叶迎（１９８９－），女，硕士研究生，研究方向为分子
标记。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｙｅｙｉｎｇ３９２８＠１６３．ｃｏｍ．
责任作者：刘洪章（１９５７－），男，博士，教授，博士生导师，研究方向
为植物资源。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｈｚ９９９＠１２６．ｃｏｍ．
基金项目：农业部野生植物资源调查资助项目；吉林省科技厅资
助项目（２０１００２５４）。
收稿日期：２０１３－０９－１３
长白山区杓兰属植物ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系的建立
孙 叶 迎，陈 丽 飞，刘 树 英，刘 　 昕，曹 　 岩，刘 洪 章
（吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春１３０１１８）
　　摘　要：以长白山区的５种杓兰属植物大花杓兰、杓兰、东北杓兰、山西杓兰、斑花杓兰为试
材，对影响ＰＣＲ扩增效果的模板浓度、引物浓度、ｄＮＴＰ浓度、Ｔａｑ酶量以及退火温度进行了优
化，以期建立杓兰属植物ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的反应体系。结果表明：２５μＬ反应体系中ＤＮＡ模板的量为
３０．００ｎｇ、引物０．６０μｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ　０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ酶０．７５Ｕ；该体系以５种杓兰属植物，４个
引物进行扩增验证，能够得到清晰的条带，且具有多态性，而且有可重复性；表明建立的杓兰属
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系适用遗传多样性的研究。
关键词：长白山区；杓兰属；ＩＳＳＲ；反应体系
中图分类号：Ｓ　６８２．３１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１３）２４－００９２－０４
　　杓兰属（ＣｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍＬｉｎｎ．）为兰科多年生草本植
物［１］。由于花唇瓣特化呈兜状，被称为“大口袋花”，西方
人称其拖鞋兰。杓兰属植物花形奇特、颜色艳丽，具有
极高的观赏价值。杓兰属共有５０余种，主要产于东亚、
北美、欧洲等温带地区和亚热带山地，向南可达喜马拉
雅地区和中美洲的危地马拉［１］。我国杓兰属植物种类
繁多，资源丰富，有３０余种，广布于东北至西南山地和台
湾地区高山［２］。在长白山区分布的杓兰属植物有大花
杓兰、斑花杓兰、杓兰、东北杓兰和山西杓兰。针对杓兰
属遗传学和分子生物学方面的研究较少，目前在遗传标
记方面的研究以ＡＦＬＰ、ＲＡＰＤ法为主，对其遗传结构以
及多样性进行分析［３－４］。ＩＳＳＲ（Ｉｎｔｅｒ－Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）简单重复区间序列标记，是由加拿大蒙特
利尔大学的Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［５］于１９９４年提出的一种建立
在ＰＣＲ技术上的分子标记技术。该技术具有操作简单、
成本低、条件稳定、快速、灵敏、检测多态能力强、所需
ＤＮＡ模板量少等优点，目前已被广泛应用于植物品种
鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生
态学等研究［６－１０］。
该研究对杓兰属植物ＩＳＳＲ反应体系进行优化，并
对ＰＣＲ反应程序中的退火温度进行优化，以期建立适合
杓兰属植物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，为利用ＩＳＳＲ标记技
术研究杓兰属植物的遗传多样性、种质资源研究、分子
育种等提供依据。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试大花杓兰、杓兰、东北杓兰、山西杓兰、斑花杓
兰５种杓兰属植物材料均采自吉林省长白山区。取材
料的嫩叶用锡箔纸包好放入到液氮中，置于－８０℃超低
温冰箱中备用。
Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）、ｄＮＴＰｓ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２　０００ｂｐ
ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ均购于大连宝生物工程有限公司，引物由
北京三博远志生物技术有限责任公司合成。ＣＴＡＢ、
ＰＶＰ、β?巯基乙醇、琼脂糖等为北京鼎国生物技术有限公
司生产的分析纯试剂。
１．２　试验方法
１．２．１　ＤＮＡ的提取以及检测　采用改良的ＣＴＡＢ法
提取ＤＮＡ。用１％ 的琼脂糖凝胶（含核酸染料）电泳检
测ＤＮＡ质量，同时取１μＬ样品用紫外分光光度计测定
ＤＮＡ的浓度以及纯度。将样品稀释为２０ｎｇ／μＬ并存放
于－２０℃冰箱中备用，以便用于ＩＳＳＲ反应条件的优化。
１．２．２　杓兰属ＩＳＳＲ反应体系的优化　试验以ＵＢＣ８４７
引物对影响杓兰属植物的ＩＳＳＲ反应的主要因素Ｔａｑ酶
浓度、ｄＮＴＰｓ浓度、ＤＮＡ模板量、引物浓度优化。每组
试验中除了试验的成分以外，其它成分与其它组试验成
分相同。参考文献［１１－１４］，采用２５μＬ体系，在基本反
应体 系 中 所 含 的 成 分 有：２．５μＬ　１０×ｂｕｆｅｒ，
０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ，０．４０μｍｏｌ／Ｌ引物，３０．００ｎｇ　ＤＮＡ
模板，最后加双蒸水补足。
１．２．３　退火温度的选择　在单因素筛选出最佳反应体
系后，设置退火温度为４７℃、５０℃、５３℃、５６℃、５９℃进行
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北方园艺２０１３（２４）：９２～９５ ·生物技术·
温度梯度退火，选择引物的最佳退火温度。
１．２．４　反应产物的电泳和检测　用６％聚丙烯酰胺凝
胶，１×ＴＢＥ电泳缓冲液，５００Ｖ电压６０ｍｉｎ，２　０００ｂｐ
Ｍａｒｋｅｒ进行分子量标记，银染，显影观察并照相、记录每
次试验至少重复２遍，记录和分析重复出现的条带。
表１ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的条件
　　Ｔａｂｌｅ　１ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
影响因素
浓度梯度
１　 ２　 ３　 ４　 ５
ＤＮＡ模板量／ｎｇ　 ２０．００　 ３０．００　 ４０．００　 ５０．００　 ６０．００
ｄＮＴＰｓ浓度／ｍｍｏｌ·Ｌ－１　 ０．１０　 ０．１５　 ０．２０　 ０．２５　 ０．３０
引物浓度／μｍｏｌ·Ｌ－１　 ０．４０　 ０．６０　 ０．８０　 １．００　 １．２０
Ｔａｑ酶浓度／Ｕ　 ０．５０　 ０．７５　 １．００　 １．２５　 １．５０
２　结果与分析
２．１　ＣＴＡＢ法提取的杓兰属植物ＤＮＡ的质量
图１　５种杓兰的ＤＮＡ电泳结果
注：Ｍ为２　０００ｂｐ　ｍａｒｋｅｒ，下同。１～５分别为大花杓兰、杓兰、东
北杓兰、山西杓兰、斑花杓兰。
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　５　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　Ｍａｒｋｅｒ　ｉｓ　２　０００ｂｐ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｅｌｏｗ．Ｔｈｅ　ｎｕｍ－
ｂｅｒｓ　１ｔｏ　５ａｒｅ　Ｃｈｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ａｃｒａｎｔｈｕｍＳｗ．，Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ｃａｌｃｅｏｌｕｓ
Ｌ．，Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ×ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｍＳｗ．，Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ｓｈａｎｘｉｅｎｓｅ　Ｃ．Ｃｈｅｎ．
ａｎｄ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ｇｕｔａｔｕｍＳｗ．．
表２ ＤＮＡ的质量
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＤＮＡ
编号 ＤＮＡ样品 ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ ＯＤ２６０／ＯＤ２３０　 ＤＮＡ浓度／ｎｇ·μＬ－１
１ 大花杓兰 １．９０　 １．９０　 １　０２９
２ 杓兰 １．９１　 ２．０６　 ２　４２４
３ 东北杓兰 １．９６　 １．９１　 ９９５
４ 山西杓兰 ２．１１　 ２．１６　 ３６８
５ 斑花杓兰 １．９５　 １．８７　 １　６０５
２．２　ＤＮＡ模板量对ＰＣＲ反应的影响
ＤＮＡ模板的质量是影响ＰＣＲ成败的重要因素之
一。由图２可知，２０．００、３０．００、４０．００、５０．００ｎｇ　ＤＮＡ均
能扩增出的产物条带，６０．００ｎｇ　ＤＮＡ没有扩增出产物
条带。在扩增出的产物条带中可以看出，３０．００ｎｇ
ＤＮＡ扩增出的产物条带比较清晰，容易判读，随着
ＤＮＡ浓度的升高，个别模板出现没有扩增条带的现
象。由此可见，并不是模板浓度越高越好。因此，杓兰
属植物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的最佳模板量为３０．００ｎｇ。
图２　不同ＤＮＡ模板的量的扩增效果
注：１～５分别为２０．００、３０．００、４０．００、５０．００、６０．００ｎｇ　ＤＮＡ模板的
量。５个重复为５个不同的杓兰品种，下同。
Ｆｉｇ．２　Ｂａｎｄｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　１ｔｏ　５ａｒｅ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ，ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｒｅ　２０．００，３０．００，４０．００，５０．００，６０．００ｎｇ．
２．３　引物浓度对ＰＣＲ反应的影响
在ＰＣＲ反应中，引物的浓度是反应的关键，ＰＣＲ反
应的特异性是由引物与模板的结合程度来决定的。当
引物的浓度过高时会引起错配、非特异性扩增，甚至形
成引物二聚体。引物浓度过低时，引物与模板结合的机
会减少，结合量减少，得到的产物少，扩增出来的条带就
比较弱。由图３可知，当引物浓度为０．４０ｍｍｏｌ／Ｌ时，
条带较弱；引物浓度为０．６０ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增条带较全
面、稳定、清晰，无特异性条带。因此，杓兰属植物的
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的最佳模板浓度是０．６０ｍｍｏｌ／Ｌ。
图３　不同引物浓度的扩增效果
注：１～５分别为０．４０、０．６０、０．８０、１．００、１．２０μｍｏｌ／Ｌ引物的浓度。
Ｆｉｇ．３　Ｂａｎｄｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ
ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　１ｔｏ　５ａｒｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ，ｒｅｓｐｅｃ－
ｔｉｖｅｌｙ　ａｒｅ　０．４０，０．６０，０．８０，１．００，１．２０μｍｏｌ／Ｌ．
２．４　ｄＮＴＰ浓度对ＰＣＲ反应的影响
从图４可以看出，ｄＮＴＰ浓度过高时，无扩增条带；浓
度过低时，条带较少，不清晰。在０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ时，条带较
清晰。因此，ｄＮＴＰ的最佳试验浓度为０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ。
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·生物技术· 北方园艺２０１３（２４）：９２～９５
图４　不同ｄＮＴＰ浓度的扩增效果
注：１～５分别为０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ的
浓度。
Ｆｉｇ．４　Ｂａｎｄｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ
ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｄＮＴＰ
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　１ｔｏ　５ａｒｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄＮＴ，ｒｅｓｐｅｃ－
ｔｉｖｅｌｙ　ａｒｅ　０．１０，０．１５，０．２０，０．２５，０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ．
２．５　Ｔａｑ酶浓度对ＰＣＲ反应的影响
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶的浓度对ＰＣＲ反应影响也很大，
是影响ＰＣＲ反应的重要因素之一。从图５可以看出，
Ｔａｑ　ＮＤＡ酶的浓度过高则会引起非特异性扩增，产生弥
散带，背景颜色重；浓度过低，扩增出来的条带较少，因
此，ＰＣＲ时要选择适当的酶浓度。该试验中５个不同浓
度梯度的酶浓度中０．７５Ｕ的酶含量扩增出来的条带最
清晰，无特异性扩增条带，最适合该ＰＣＲ体系。
图５　不同Ｔａｑ酶浓度的扩增效果
注：１～５分别为０．５０、０．７５、１．００、１．２５、１．５０ＵＴａｑ酶的量。
Ｆｉｇ．５　Ｂａｎｄｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　１ｔｏ　５ａｒｅ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅ　ｏｆ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒ－
ａｓｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｒｅ　０．５０，０．７５，１．００，１．２５，１．５０Ｕ．
２．６　退火温度对ＰＣＲ的影响
退火温度影响引物与模板结合，由５个退火温度梯
度可以看出，５６℃时，扩增产物特异性强，条带清晰；温度
低于或高于５６℃时，特异性较差，有些条带不明显，甚至
扩增不出来。因此，确定了引物ＵＢＣ８４７的最佳退火温
度为５６℃，其它引物由此方法得到最佳退火温度。
２．７　体系稳定性的检测
随机选取其余４个引物（ＵＢＣ８０７、ＵＢＣ８５５、ＵＢＣ８４１、
ＵＢ８７３）对优化好的ＰＣＲ体系的稳定性进行检测（图７）。
图６　不同退火温度的扩增效果
注：１～５分别为４７℃、５０℃、５３℃、５６℃、５９℃的退火温度。
Ｆｉｇ．６　Ｂａｎｄｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ
ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　１ｔｏ　５ａｒｅ　ｔｈｅ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ，ｒｅｓｐｅｃ－
ｔｉｖｅｌｙ　ａｒｅ　４７℃，５０℃，５３℃，５６℃，５９℃．
图７　扩增结果稳定性检测
注：１～５ 分 别 为 引 物 ＵＢＣ８４７、ＵＢＣ８０７、ＵＢＣ８５５、ＵＢＣ８４１、
ＵＢＣ８７３。　
Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔａｂｌｅ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　１ｔｏ　５ａｒｅ　ｔｈｅ　５ｐｒｉｍｅｒｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｒｅ
ＵＢＣ８４７，ＵＢＣ８０７，ＵＢＣ８５５，ＵＢＣ８４１，ＵＢＣ８７３．
所选的引物都能扩增出比较理想的的结果，说明优化的
体系比较稳定可靠。
２．８　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的确立
该试验建立了杓兰属植物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，
在２５μＬ的体系中含有２．５μＬ　１０×ｂｕｆｅｒ，３０．００ｎｇ
ＤＮＡ模板，０．６０μｍｏｌ／Ｌ引物０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ，Ｔａｑ
酶的量为０．７５Ｕ。扩增条件：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变
性１ｍｉｎ；５６℃退火１ｍｉｎ；７２℃延伸１．５ｍｉｎ，３５个循环，
７２℃完全延伸１０ｍｉｎ。
３　讨论与结论
在遗传多样性的研究中，体系稳定性是十分重要
的。ＩＳＳＲ体系的稳定性受很多因素的影响，如模板的
量、Ｔａｑ聚合酶、引物、ｄＮＴＰ以及退火温度等。其中一
般模板ＤＮＡ的量对扩增结果影响不大，浓度在５～
５００ｎｇ都能扩增出较好的结果，但该试验中ＤＮＡ的
用量达到４０．００～５０．００ｎｇ，扩增条带减少，６０．００ｎｇ无
扩增条带，这可能是由试验材料不同引起的。在ＰＣＲ反
应中，各个底物之间是相互作用，相互影响的。反应体
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北方园艺２０１３（２４）：９２～９５ ·生物技术·
系中ｄＮＴＰ能与 Ｍｇ２＋结合，使游离的 Ｍｇ２＋浓度降低。
因此，ｄＮＴＰ的浓度直接影响到反应中 Ｍｇ２＋浓度。同
时，高浓度ｄＮＴＰ引起非特异性扩增，低浓度降低反应
产物的量。因此控制好ｄＮＴＰ的浓度对于ＰＣＲ反应很
重要。Ｌｕ［１５］认为ｄＮＴＰ的浓度范围在０．０２～０．２０
ｍｍｏｌ／Ｌ之间。高丽等［１６］认为ｄＮＴＰ的浓度为０．２０
ｍｍｏｌ／Ｌ时，反应扩增出来的产物的量、特异性、忠实性
较好，与该试验结果相符。
Ｍｇ２＋是Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶活性所必需的元素，对
ＰＣＲ扩增的效率、特异性、退火温度都有影响［１７］。Ｔａｑ
酶的量对反应体系的影响较大，酶浓度过高不仅增加成
本，而且容易产生非特异性产物；酶浓度过低，扩增产物
减少。在ＰＣＲ反应中，退火温度的高低直接影响到引
物与模板ＤＮＡ的特异性结合［１８］。退火温度和退火时
间取决于引物的长度、碱基组成以及其浓度，通过温度
梯度ＰＣＲ仪对温度进行筛选可以保证得到清晰稳定的
扩增条带，客观地反映杓兰属植物的遗传多态性。
该试验建立的体系采用单因素梯度试验来进行最
佳组合的摸索，通过试验得到了清晰稳定的条带。因
此，该体系可以用于杓兰属遗传多样性的分析。
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Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｏｐｔｉｍｕｍ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｉｎ
ｔｈｅ　Ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈａｎｇｂａｉ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ
ＳＵＮ　Ｙｅ－ｙｉｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｌｉ－ｆｅｉ，ＬＩＵ　Ｓｈｕ－ｙｉｎｇ，ＬＩＵ　Ｘｉｎ，ＣＡＯ　Ｙａｎ，ＬＩＵ　Ｈｏｎｇ－ｚｈａｎｇ
（Ｃｏｌｏｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉｎｌｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ，Ｊｉｌｉｎ　１３０１１８）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ｍａｃｒａｎｔｈｕｍ，Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ｃａｌｃｅｏｌｕｓ，Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｍ，Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ｓｈａｎｘｉｅｎｓｅ
ａｎｄ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ｇｕｔａｔｕｍｏｆ　５　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　Ｃｈａｎｇｂａｉ　ｍｏｕｎｔａｉｎｓ　ａｓ　ｔｅｓｔ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅ　４
ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ａｆｅｃｔ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　３０．００ｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ，
０．６０μｍｏｌ／Ｌ　ｐｒｉｍｅｒ，０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ，ａｎｄ　０．７５ＵＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｉｎ　ａ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　２５μＬ　ｗａｓ　ｏｐｔｉｍａｌ．Ｔｈｅ
ｃｌｅａｒ，ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ　ａｎｄ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂａｎｄｓ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｂｙ
５　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍａｎｄ　４ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｈａｎｇｂａｉ　ｍｏｕｎｔａｉｎ；Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ；ＩＳＳＲ；ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
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