全 文 ：第 18卷　第 3期
2006年 9月 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
塔　里　木　大　学　学　报
JournalofTarimUniversity 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Vol.18No.3
Sep.2006
　　文章编号:1009-0568(2006)03-0046-05
芸薹属蔬菜游离小孢子培养技术研究进展
轩正英
(塔里木大学植物科技学院 , 新疆 阿拉尔 　843300)
摘要　回顾了芸薹属蔬菜游离小孢子培养技术的研究历史与现状 ,阐述了影响芸薹属游离小孢子胚胎发生的主要因素 , 包括
材料的基因型 、株龄及采花期 、小孢子发育时期 、亲本植株的生理状况 、环境条件 、培养方法和培养条件等。同时对芸薹属蔬
菜游离小孢子培养技术发展前景进行了展望。
关键词　芸薹属蔬菜;游离小孢子;培养基
中图分类号:S634.03.6　　　　　　　　　　　　文献标识码:A
ProgressofStudyonIsolationMicrosporeofVegetablesinBrassica
XuanZhengying
(ColegeofPlantScienceandTechnology, TarimUniversity, AlarXinjiang843300)
Abstract　TherecentprogressonisolationmicrosporeofvegetablesinBrassicawasreviewed.Thepaperreviewedinfluentialfactors
inmicrosporecultureembryogenesisofBrasicavegetables, suchasgenotypeofthematerials, donorplantsageandcolectingbudat
differentfloweringdate, developingphaseofmicrospore, physiologicalstatusofdonorplants, environment, culturalmethodandcondi-
tionsetc.Theprospectsandproblemswereputforward.
Keywords　Brassicavegetables;isolationmicrospore;media
　　芸薹属蔬菜属于异花授粉作物 ,其杂种优势十
分明显 。近年来 ,常规育种的不足在实际工作中日
渐明显 ,因此 ,各国学者开始寻找育种的新途径 、新
方法。游离小孢子培养技术是近年来兴起的一门加
快育种进程的新方法 。它具有单细胞 、单倍体和较
高胚胎发生率及较高同步性等特点 ,通过这种途径
可以迅速获得纯合双单倍体 ,进而获得纯合亲本系
统 ,大大加快育种进程 。
1　研究概况
1982年 ,在芸薹属作物上 ,德国的 Litcher首先
报道了采用游离小孢子培养诱导小孢子胚胎发生和
植株再生[ 1] 。在此后的几十年时间里 ,游离小孢子
培养技术得到了迅速发展 。这期间最有意义的研究
进展有五:其一是创造了从完整的花蕾机械分离小
孢子的方法[ 2] ;其二是明确了适宜于培养的小孢子
发育时期 [ 3] ;其三是开始了胚状体发生细胞学特点
的研究;其四是将热激处理用于游离小孢子培
养[ 4] ;其五是以小孢子培养技术体系为平台的生物
技术研究得到了进一步的发展。
游离小孢子培养消除了小孢子和花药壁 、绒毡
层细胞之间可能存在的营养竞争现象 ,可以更高的
频率诱导小孢子胚胎发生 。在芸薹属蔬菜中 ,小孢
子培养已在埃塞俄比亚芥 (B.carinata),黑芥 (B.
nigra),大白菜(B.campestrissp.pekinensis),结球甘
蓝(B.oleraceasp.capitata),小白菜(B.campestris
sp.chinensis)和芜菁(B.rapasp.oleifera)等蔬菜上
获得成功 。目前 ,我国学者在大白菜中利用小孢子
培养产生了纯合的自交不亲和系 [ 5 ～ 6] ,配制的 F1杂
种已经在河南 、北京等地广泛种植 。
收稿日期:2005-11-09
作者简介:轩正英(1979 -),女,讲师 ,硕士 ,主要从事蔬菜遗传育种方面的研究。
第 3期 轩正英:芸薹属蔬菜游离小孢子培养技术研究进展
2　供体植株
2.1　基因型对小孢子胚状体发生的影响。
基因型是影响小孢子胚胎发生率的关键性因
素 。不同基因型的供体材料在同样试验条件下 ,胚
状体产量不同。徐艳辉 [ 7]认为 ,基因型对大白菜小
孢子胚状体发生能力的影响作用体现在两个方面:
第一是基因型的反应范围 ,第二是胚胎发生频率 。
曹鸣庆 [ 8]等报道 ,将 17个基因型大白菜进行游离小
孢子培养 ,由 16个基因型获得小孢子胚 ,各基因型
之间发生频率差异很大 。以 100个蕾产胚量计算 ,
有些基因型达 30, 000个以上 ,有些基因型只有 60
个胚。 Chuong等 [ 4]实验结果表明胚状体发生能力
是可遗传的 。他们认为 ,胚产量高的材料间杂交可
提高小孢子胚状体发生频率 。余凤群等 [ 9]提出 ,将
易成胚的材料之间杂交 ,或易成胚材料与难成胚材
料之间杂交所得的 F1用于小孢子培养 ,可望得到大
量的胚状体 。张凤兰等 [ 10]也得到了相同的研究结
果 。
2.2　株龄及采花期对小孢子胚状体发生的影响
株龄和采花期对小孢子胚胎发生也有很大的影
响 。申书兴等[ 11]研究结果表明 ,株龄对小孢子胚胎
发生率影响显著 。植株主花枝和一级侧枝的花蕾少
量开花到一级侧枝的花蕾已有 2 /3开花以前(即盛
花期),采集适宜花蕾进行小孢子培养是适宜时期 。
Chuong等人[ 4]曾报道在油菜小孢子培养中 ,供体植
株的花期对胚状体诱导频率也有一定的影响 ,取材
于开花一个星期的诱导频率显著高于取材于将要开
花和开花两个星期的诱导频率 。也有与此不同的研
究结果 ,陈军 [ 12]研究的多数品种是从开花第 3天至
第 7天这段时期取材才得到的胚状体 。笔者的研究
经验表明 ,初花期的胚状体诱导频率要高于其它花
期的诱导频率。
2.3　小孢子发育时期对胚状体发生的影响
小孢子发育时期对胚状体发生率有直接影响 。
一般用花蕾长度 ,花瓣长 /花药等确定小孢子发育时
期 。王怀名等[ 13]在嫩茎花椰菜花粉培养中 ,发现花
瓣达到花药长度 1/3 ～ 1/2,花药淡绿 ～淡黄色 ,长
度为 2.5 ～ 3.0mm的花蕾单核靠边期比例较大 ,培
养效果较好。曹鸣庆 [ 8] 等研究了大白菜蕾长与小
孢子发育进程的关系 。当蕾长为 2.0 ～ 2.5mm时 ,
小孢子胚发生率最高 ,此时小孢子处于单核中期至
单核靠边期;而当蕾长为 2.6 ～ 3.9mm时 ,小孢子胚
发生率次之 , 此时处于单核中期的小孢子占 9.
12%,处于单核靠边期的占 70.0%;而当蕾长小于
2.0mm或大于 3.9mm时 ,不能诱导小孢子胚发生。
因此 ,严格挑选适宜时期的小孢子是能否培养成功
的关键问题之一。
2.4　环境条件及植株生长状况对小孢子胚状体发
生的影响
一般认为供体植株生长的环境条件对小孢子胚
胎发生率有一定的影响 ,而且不同品种的适宜环境
条件不同 。张凤兰 [ 14]在大白菜小孢子培养中 ,以生
长在 14 ～ 16h日照及 15 ～ 20℃的温度条件下的供
体植株胚状体发生率和植株再生率高。据官春
云[ 15]以油菜为试材研究表明:生长在人工气候室内
的植株 ,其小孢子发育同步性强 ,而且小孢子细胞核
的体积和核质比都较大 ,即细胞生理活性高 ,小孢子
产胚率为 5.11%,而取自温室供体植株的花蕾产胚
率为 2.09%。申书兴 [ 11] 研究表明 ,在植株处于初
花期过后末花期以前这段时间采集适宜花蕾 ,并配
合实施连续摘除将开花花蕾 ,可明显提高大白菜小
孢子胚胎发生率。这可能与花蕾发育有较充足的营
养供给 ,从而花蕾内小孢子发育同步性和细胞生理
活性得到提高有关。也有学者的研究结果与此相
反 , DuijsJC[ 16]认为供体植株花序形成时的生长环境
不太重要 。
3　培养技术对小孢子胚状体发生的影
响
3.1 　培养基成分
芸薹属蔬菜游离小孢子培养中 ,最常用的培养
基是 NLN培养基 [ 17] 。在游离小孢子培养中 ,通常
采用蔗糖作为碳源和渗透调节剂 ,其浓度的大小对
小孢子存活以及是否发育成胚具有很大的影响。陈
军等 [ 12] ,牛应泽 [ 18]等研究表明 ,蔗糖浓度在 16%的
培养基中含有活力的小孢子最多 ,但胚状体诱导频
率最高来自于 13%蔗糖的培养基 。
申书兴 [ 11]研究发现 NLN培养基中添加活性炭
对促进小孢子胚胎发育的效果非常显著:一是提高
小孢子胚胎发生率 ,尤其是对胚胎发生难的基因型
效果更显著;二是提高子叶形胚率 ,尤其是胚胎发生
率高时 ,效果更显著 。这可能是活性炭吸附了培养
基中小孢子代谢产生的抑制胚胎发生和发育的产物
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塔　里　木　大　学　学　报 第 18卷
所致 ,并且不同基因型产生的有毒代谢产物的量有
差异。 Gland等 [ 19]在油菜小孢子培养中也发现添加
活性炭可促进胚的发育 ,有利植株再生 ,但不增加胚
产率。徐艳辉[ 7]也报道适量的活性炭 (0.01 ～ 0.
02g.L-1)有利于胚状体的形成。
在一些研究中 ,在小孢子培养的培养基中不附
加任何激素或附加低浓度的 NAA、BA、IAA、2, 4-D
等均可获得胚状体。但石淑稳 [ 20] 、余凤群等 [ 9]研究
表明 , 2 , 4-D、NAA有时表现促进作用 ,有时表现负
作用;IAA不起作用 , 6-BA则可显著提高胚产量 ,
产生此种现象的机制不甚明了 。
3.2　培养条件及预处理方法
3.2.1　花粉预处理
为了提高小孢子培养的诱导效率 ,通常要对材
料进行预处理。操作包括离心 、低温 、高温 、射线 、甘
露醇预处理和预培养等方式 ,其目的是改变细胞生
理状态 、分裂方式和发育途径。
自从 Keler[ 21]在甘蓝型油菜花粉培养中首次用
高温处理提高了花粉胚的诱导频率以来 ,该方法被
广泛用于芸薹属植物的花药培养和游离小孢子培
养 。实验结果表明 ,花粉培养温度一般以 25℃为
宜 ,但许多研究表明变温处理 ,即 ,在高温下处理一
定的时间之后再转至低温培养有利于提高胚状体的
诱导率 。刘公社等[ 22]认为在结球白菜游离小孢子
培养开始时 , 12h高温处理能大大促进小孢子均等
分裂 , 24h的高温处理则能大大提高小孢子胚的诱
导率。刘公社[ 22]在实验中发现 ,高温处理有效地抑
制了小孢子的配子体发育途径 ,提高了单核小孢子
核对称分裂的频率 ,认为小孢子对预培养敏感的时
期是最初的 24h,更长时间并非必要 。李岩 [ 23]在试
验中发现 ,高温处理仅仅起激发小白菜小孢子向胚
胎方向发育的作用 ,一旦激发作用完成就不再需要
高温条件;后两天持续的高温环境对小白菜小孢子
胚胎发育进程有负面影响 。
Zhao等 [ 24] 、Hansen等 [ 25] 、余风群等 [ 26] 、周伟
军 [ 27]对油菜小孢子进行了 32℃热击暗培养 1 ～ 3天
处理 , 取得了较好的效果 。而 Iqbal等 [ 28] 、Molers
等 [ 29]和 Fletcher等 [ 30]对小孢子进行 30℃暗培养 5
天至 14天 ,也取得较为理想的结果 ,表明一定温度
(30 ～ 32℃)的热击处理均能获得良好胚状体 。
3.2.2　花蕾预培养
芸薹属植物主要采用低温预培养方法 ,即将选
取的花序浸在 MS液体培养基或水中 ,然后在分离
小孢子进行培养。林呐 [ 31]曾观察发现 ,花粉培养对
低温预处理没有高温预处理好 ,高温预处理长出了
胚状体 ,但低温预处理没有 ,而且低温预处理的小孢
子发育虽然都出现膨胀 ,但因为膨胀的程度都较大 ,
使花粉外壁破裂 ,其含有的对小孢子发育有启动作
用的物质受到了破坏 ,因而小孢子的活力受到了影
响 ,以致于产胚量下降。王亦菲等[ 32]在大田油菜小
孢子诱导中认为低温 4℃处理 1 ～ 2天对小孢子脱
分化启动最为有利 。余风群 [ 33]报道 ,甘蓝型油菜 6
～ 9℃处理 1天最好 。
3.3　接种密度
试验证明 ,接种密度是小孢子培养能否成功的
一个至关重要的因素 ,但也是在试验操作中常常被
忽略的问题。一般用玻璃棒捣碎花蕾提取小孢子的
情况下 ,每毫升培养基接种 1.4 ～ 2个花蕾的小孢子
较适宜 ,每毫升超过 2个花蕾的小孢子较适宜 ,每毫
升超过两个花蕾其产胚率下降 ,甚至不能形成胚状
体[ 34] 。陈玉萍 [ 35] 研究表明每皿 5 ～ 10个花蕾较
好。据官春云 [ 36]报道 ,每毫升 NLN培养基中接种 1
个花蕾的产胚率达 5.11%,而接种 0.75个花蕾和
1.25个花蕾的处理 , 产胚率分别为 2.34%和 1.
86%。因为适宜培养的花蕾数目 ,可能与操作方法
有关 ,所以较为准确的接种密度应该利用血球计数
板观测出的小孢子密度 。一般认为 2×104 ～ 4×104
个 /ml密度最合适 [ 16] ,而最近的研究表明 1×105 ～
2×105的密度最为合适 。
4　胚状体发生及植株再生研究
4.1　胚状体发生以及植株再生
一般培养 2 ～ 3d可见小孢子第一次分裂 , 7 ～
10d或 20d左右能见到球形胚和心形胚 ,随后可形
成鱼雷形 、子叶形胚 。胚状体的发育并不同步 ,同时
还会出现许多畸形胚。当各种类型的胚状体转移到
改良的 MS培养基或 B5培养基时 ,其再生植株的能
力有很大差异 。子叶型 、鱼雷形胚再生胚率高 ,心形
胚少数能再生植株 ,球形胚和异常胚不能进一步发
育。
周伟军[ 27]发现胚状体转移到固体培养基后立
即进行低温诱导(2℃),常温(24℃)光下培养能很
好地萌发并直接 、迅速地再生成苗 ,继代后可长成完
全正常的再生植株 。低温诱导处理 10天 ,其萌发胚
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第 3期 轩正英:芸薹属蔬菜游离小孢子培养技术研究进展
率和成苗率均显著高于无低温处理的品种 。Fletch-
er等 [ 30]报道 ,对培养三周龄以上的子叶形胚进行特
定的逆境胁迫 (ABA处理 、切除子叶 、使胚干燥
45min),能够明显提高植株的再生能力 。
此外 , Polsoni[ 37]曾报道 ,甘蓝型油菜小孢子培
养 14d后 ,由静止培养改为 60r/min震荡培养 ,能促
进胚状体的直接成苗 。
4.2　染色体加倍技术
小孢子经培养所产生的单倍体小植株常常表现
高度不孕 ,为了使之能正常结籽 ,与育种实践相结
合 ,必须诱导染色体加倍 。有些芸薹属蔬菜自然加
倍率很高 ,如张凤兰等 [ 38]报道 ,白菜由小孢子培养
得到的植株无需人工加倍处理 ,有自然加倍成为二
倍体植株的特点 。而油菜小孢子培养获得的植株
70 ～ 90%为单倍体 ,自然加倍率仅 10 ～ 30%[ 39] 。
Cao[ 40]等对芜菁游离小孢子培养植株倍性进行了鉴
定 , 2个品种中单倍体比例分别为 25%和 33%。
诱导染色体加倍的化学药剂多为秋水仙碱 ,加
倍的方法有两种 ,一是将栽培成活的植株从土壤中
拔出来 ,洗净根部泥土后将根浸泡在秋水仙溶液中 ,
随后再栽到土壤中;二是在植株的顶芽或腋芽重复
滴抹秋水仙溶液 。这两种方法的操作既繁琐又费
工 ,难以用于大批量苗的加倍。石淑稳于 1992年对
此进行了研究 ,发现用 10 ～ 50mg.L-1秋水仙素处理
小孢子 48h的染色体加倍方法最佳[ 34] 。 Chen等人
发现小孢子经冷冻处理后 ,再生植株的二倍化比率
高 ,但至今未见在遗传育种中实际运用的报道 。研
究表明 ,离体小孢子用秋水仙碱或抗微管的除草剂
处理并培养成植株 ,加倍率达 44% ～ 94%。[ 41]这种
方法加倍率高 ,而且加倍植株极少是可育和不育花
的嵌合体 ,实用价值也较大 。
5　问题及展望
经过国内外学者数十年的研究探索 ,游离小孢
子培养的技术已越来越完善 ,各种方式培养方法的
应用 ,大大提高了胚状体的诱导频率 ,也为游离小孢
子的广泛应用奠定了基础 。但是由于小孢子培养技
术本身的机理 、小孢子培养的启动等方面我们还不
很清楚 ,还没有建立起完善的 、高频的再生体系 ,故
使这一技术的应用受到了很大限制。
此外 ,利用游离小孢子培养得到的植株 ,混倍现
象比较普遍 ,常常出现嵌合植株 ,我们应在今后针对
混倍现象出现的原因以及预防方法进行深入研究。
我们还应针对抗病虫害 、耐涝 、耐旱 、耐盐等抗原的
缺少 ,积极开展远源杂交结合花粉培养导入异源基
因的研究 ,这是创造新的种质资源的重要手段和有
效方法。
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