全 文 ：中国农学通报 2013,29(10):92-96
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
游离小孢子培养是植物组织培养发展的一个分
支，以植物细胞全能性为其理论基础。通过游离小孢
子的培养可获得加倍单倍体植株，即DH植株，具有完
全可育及基因纯合的特点。利用其可控制杂种分离，
加快育种速度，提高育种的选择效率，得到的DH株系
是进行遗传作图的理想材料系统。1982年Lichter首
次报道在甘蓝型油菜上成功地用游离小孢子培养方法
获得了胚状体，为之后的芸薹属游离小孢子研究指明
了大致的研究方向。此后，游离小孢子培养相继在多
种芸薹属蔬菜上获得成功。近年来，国内许多学者对
十字花科芸薹属蔬菜的游离小孢子培养技术进行了深
入研究并提出了改进方法，完善游离小孢子培养技术，
致力于为小孢子提供最为适宜的培养条件，提高成功
率，扩大其应用范围。笔者对近10年国内芸薹属蔬菜
游离小孢子培养研究中，影响小孢子胚胎发生的因素
进行综述，主要包括：供试材料的基因型、生长环境、小
孢子发育时期、分离方法、热激处理、低温预处理、激素
基金项目：安徽省高校自然基金重点项目“安徽乌塌菜游离小孢子培养研究”(KJ2012A109)。
第一作者简介：张慧，女，1988年出生，安徽六安人，硕士研究生，主要从事蔬菜遗传育种与分子生物学研究。通信地址：230036安徽省合肥市长江西
路130号安徽农业大学园艺学院，Tel：0551-5786212，E-mail：littlebear_2008@sina.com。
通讯作者：汪承刚，男，1966年出生，安徽金寨人，研究员，硕士生导师，主要从事蔬菜遗传育种与分子生物学研究。通信地址：230036安徽省合肥市
长江西路130号安徽农业大学园艺学院，Tel：0551-5786212，E-mail：ahscyzwcg@ahau.edu.cn。
收稿日期：2012-09-24，修回日期：2012-11-25。
芸薹属蔬菜游离小孢子成胚影响因素研究进展
张 慧，汪承刚，宋江华，赵 颖
（安徽农业大学园艺学院，合肥 230036）
摘 要：游离小孢子培养也称花粉培养，是以植物细胞全能性为基础，植物组织培养发展的一个分支。利
用此项技术，可获得纯合体植株，缩短常规育种年限，为基因工程、细胞工程等学科提供载体或目的基
因。笔者综述了近年来国内研究中的关于芸薹属蔬菜游离小孢子培养中的成胚影响因素，主要包括：供
试材料的基因型、生长环境、小孢子的发育时期、分离方法、预处理、激素及活性炭的添加等，并结合实际
提出了小孢子培养研究中存在的一些问题和对其未来发展的期望。
关键词：芸薹属；游离小孢子；组织培养
中图分类号：S6 文献标志码：A 论文编号：2012-3220
The Research Progress of the Influential Factors in Isolated Microspore
Culture Embryogenesis of Brassica Vegetables
Zhang Hui, Wang Chenggang, Song Jianghua, Zhao Ying
(Horticulture College of Anhui Agricultural University, Hefei 230036)
Abstract: Isolated microspore culture is also called pollen culture, which is a branch of the development of
plant tissue culture dependent on totipotency of plant cell. Making use of this technology, we could obtain
homozygote, shorten the period of conventional breeding, and provide vector or objective genes for other
subjects such as genetic engineering and cellular engineering. This paper summarized the influential factors in
isolated microspores of Brassica vegetables, such as genotype of thematerials, plants physical condition,
developing phase of microspore, physiological status of donorplants, separation methods and pretreatment way
etc. for lasted years. And the existing problems of the microspore culture in the research and expectations in
the future development has been came up, combining with the practical situation.
Key words: Brassica; isolation microspore; tissue culture
张 慧等：芸薹属蔬菜游离小孢子成胚影响因素研究进展
及活性炭的添加等的研究情况，并以此提出小孢子培
养中现存的问题以及对未来的展望。
1 供试植株的基因型及其生长环境的影响
1.1 基因型
大量的前人研究结果表明，十字花科芸薹属蔬菜
游离小孢子培养成功的关键在于供试植株的基因
型。相同条件下，不同基因型的小孢子胚胎发生率存
在显著差异。现已有研究者采用双列杂交法对小孢
子胚发生能力的主控基因进行研究，发现其由核基因
控制，存在加性-显性效应，且显性效应作用较大 [1]。
杨平安等[2]研究结果表明，将产胚能力强的结球甘蓝
与产胚能力弱的作为亲本材料进行杂交，无论正反
交，其 F1代的产胚能力介于二者之间，能显著提高产
胚能力弱或无产胚材料的产胚能力。这与方淑桂
等 [3]的研究结果一致。在大白菜 [4-5]、花椰菜 [6]以及结
球芥菜上[7]也有类似报道。研究发现，利用无胚或产
胚能力弱的材料自交得到的 F2代做试材可提高产胚
能力[2]。由袁素霞等[8]的报道中可知，近年来，植物游
离小孢子胚胎形成机制方面的研究已在分子水平上
取得了一定的进展，但也只有在甘蓝型油菜小孢子中
分离得到的 BBM基因被公认为具有胚胎发生的能
力。游离小孢子胚胎形成过程中，其他基因的功能及
这些基因、蛋白在胚胎发生过程中的基因表达程序中
的诱导表达、信号转导等的机理尚不明确，有待进一
步地深入研究。
1.2 生长环境
供试植株的生长环境对其生理状态的影响极大，
间接影响了小孢子的产胚率，尤其光照与温度的影
响。张凤兰等[9]利用人工气候室，采用不同光照、温度
对供体植株进行培养，研究结果表明，日照时数在12~
14 h，温度保持在 15~25℃时利于小孢子胚胎的发生，
超出此范围则产胚率下降。其中，高温短日照最不利
于小孢子的培养。供试植株生长在人工气候室内较之
温室，产生的小孢子具有发育同步性强、细胞生理活性
高、产胚率高的优点[10]。取自大田的试验材料则表现
出小孢子发育同步性差、污染率高、活力差的特点[11]，
脱分化启动及胚状体诱导较困难，导致产胚率不稳定
或很难获得胚状体。而赵小萍等[12]研究结果表明，在
取蕾合适且其他诱导培养条件一致的情况下，气温变
幅相对较小的环境更适宜于供试植株的生长及小孢子
的发育。综上所述，无论是栽种在哪里，关键是避开高
温季节及病虫害高发期，做好病虫害防治工作，因为蚜
虫及其他昆虫叮咬会导致污染率上升[13]。降低污染率
也是试验成功的关键之一。
2 取材时的注意事项
2.1 小孢子发育时期
有研究者提出，芸薹属游离小孢子胚胎发生的激
发启动，一般发生在单核中期至单核靠边期这一短暂
的发育过程中[13]。姜立荣等[14]在大白菜游离小孢子培
养中发现，诱导胚状体发生的小孢子所处的最佳时期
是单核后期。申书兴等[15]认为，4倍体大白菜同2倍体
类似，单核靠边期小孢子占多数时，胚胎产量最高。对
于小白菜，单核中期至单核靠边期的小孢子易诱导胚
胎发生[16]。而赵前程等[6]、宋立晓等[17]研究发现，处于
单核晚期至双核期的小孢子是诱导小孢子胚状体发生
的最佳时期。上述研究结论的细微差别，可能是由基
因型差异所致。
2.2 花期
不同品种、基因型以及不同的栽培条件、环境温
度决定了适宜的取材时期的不同。‘科萌 78’盛花期
取蕾培养的出胚率为每蕾 79.5个胚，是初花期的 3.0
倍、末花期的 6.3倍；‘科萌 45’盛花期出胚率为每蕾
2.8个胚，而初花期和末花期出胚率为 0[18]。张亚丽
等 [19]也认为盛花期是最佳取蕾期。马丽华等 [20]在不
结球白菜的研究中则得到相反结论，认为供试植株主
花序第1朵花开后第7~14天取样，即初花期是最佳取
样时期。而赵小萍等[12]则认为，初花后 1周内是最佳
花期阶段，此时温度较低，花粉生长较慢，小孢子发育
同步均一性以及花蕾大小对应性皆最高，只要花蕾大
小合适一致，单核靠边期的花粉比例一般保持在
80%~90%以上。
2.3 花蕾长度或花瓣/花药长度比
有研究者提出用花蕾大小或花瓣/花药长度比来
衡量小孢子发育时期将更为直观简便。花蕾大小与小
孢子发育时期有一定的关系，不同基因型之间最适花
蕾的长度也有一定的差异[21]。蕾长3.0~5.5 mm的羽衣
甘蓝花蕾中，单核靠边期至双核早期的小孢子所占比
例较大[22]。赵前程等[6]研究发现，随着取材时期不同，
花蕾中发育时期为单核晚期至双核期的小孢子占60%
以上的花蕾长度也随之变化，开花前期5.1~5.5 mm，开
花中期4.6~5.0 mm，开花后期4.1~4.5 mm。这说明，单
核靠边期的合适花蕾大小除与基因型有关外，主要与
蕾形成期的环境温度密切相关；小孢子与花蕾发育阶
段，温度低，生长发育慢，蕾较大；反之温度高，小孢子
发育快，花蕾生长虽也快，但较之低温下小孢子达到单
核晚期的花蕾，同基因型下体积较小，变小程度与温度
升高呈正相关[12]。温度高，花蕾稍选小；温度低，花蕾
稍选大。
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2.4 小孢子提取法
小孢子提取方法有 4种。（1）自然散落法，选取适
宜花蕾，清洗消毒后，无菌取出花药，接种于培养基上，
任其花粉自然散落。（2）挤压法，使用平头玻璃棒，在放
有适量提取液的研钵中，对清洗消毒后的适宜花蕾进
行轻轻碾压，挤出小孢子。（3）研磨法，与挤压法相比唯
一不同的是，需要使用研棒对花蕾进行研磨。挤压法
与研磨法相比较而言，对小孢子造成的伤害更小，利于
后续试验的进行。（4）旋切法，王亦菲等[12]利用小型搅
拌旋切法提取小孢子，旋切速度以 2700~3000 r/min，
时间以 2次 5 s旋切间间隔 10 s为宜。旋切过程中保
持提取液的低温状态，避免旋切时产生的高温伤害。
旋切法具有每次可处理材料量大，操作简单，重复性
好，省时的特点。但是，尽管在旋切过程中注意保持低
温状态以避免因高速旋切形成的高温对小孢子形成的
伤害，所提取的小孢子活性仍较差，培养效果没有挤压
法好[23]。现有的关于芸薹属小孢子研究的试验中，普
遍采用的还是挤压法。
3 预处理、活性炭及激素对小孢子发育的影响
3.1 低温预处理
对于不同基因型的材料，低温预处理的最佳时间
及适宜温度有所差异。现有研究中，普遍认可4℃低温
处理。有研究表明对供试材料过长时间的低温处理，
会降低产胚率[17,24]。李必元等[25]研究发现4℃低温处理
72 h时，小孢子胚诱导率开始有明显下降，因此花蕾低
温预处理不宜超过3天，以处理24~48 h为佳。在小孢
子分离过程中应用低温无菌水、低温B5小孢子清洗液
等发现有一定的促进胚发生的作用[26]。包美丽等[27]首
次采用低温缺氧的方法处理花序，发现其最佳时间为
24 h。牛永超等[28]研究发现，难成胚基因型D214低温
预处理与否结果都为 0，Y496处理后虽获得胚但产胚
数极少，易成胚材料D449则产胚率显著提高，D216虽
高于对照但差异不显著，而D448和Y491却出现胚产
量较之对照明显下降的现象。结果说明，不同材料的
遗传基础决定低温预处理的产胚效果。
3.2 高温热激处理
大量研究证明，高温热激处理是小孢子培养、胚状
体诱导中不可或缺的关键一步，适宜的处理时间和温
度，可提高小孢子的产胚率。但不同基因型的材料，在
热激处理温度及时间上存在明显差异。在芥兰[29]、甘
蓝[30]游离小孢子培养研究中认为 33℃，24 h是最佳的
热激培养温度与时间。结球白菜则在处理时间上微有
差异，以24~48 h为宜[25]。芥蓝的最佳热激温度和时间
则是32℃，24 h[31]。石淑稳等[32]认为，在30~35℃的热激
温度范围内，随着温度的降低，培养时间越长。在牛永
超等[28]的试验中，32℃热激培养5天对大多数材料的小
孢子再生成胚状体最有效。大白菜游离小孢子在35℃
下处理 12 h效果最佳，12~48 h范围内出胚率差异不
大，超出此范围则明显下降[33]。虽然高温热激处理对
小孢子的脱分化启动是必需的，但高温处理对小孢子
的损伤也非常明显，有时在热激处理结束时小孢子的
存活率只有 10%左右，有的甚至为 0[23]。因此，找寻提
高热激处理后小孢子成活率的有效措施也尤为重要。
3.3 秋水仙碱
杨安平等[35]在甘蓝小孢子培养中发现，培养基中
秋水仙碱的适量添加，可使部分难成胚材料产胚，使易
成胚材料的产胚量提高，促进胚胎良好发育。根据所
研究蔬菜种类的不同，研究者们在秋水仙碱的有效用
量及处理时间上存在不同看法。甘蓝[34]小孢子培养基
中添加1、10、50 mg/L的秋水仙碱，处理48 h均能有效
提高产胚量。青花菜[23]则以500 mg/L秋水仙碱处理1
天为宜。最佳的处理浓度和处理时间因供试材料不同
而有所不同，处理后的效果也存在一定差异。李浩杰
等[35]在诱导培养基中加入一定浓度的秋水仙碱，结果
则显示其有利于提高小孢子岀胚率，但差异不显著。
3.4 活性炭
蒋武生等 [36]研究发现 N16、N19在添加活性炭
0.5 g/L的NLN培养基中，胚的诱导率较高，而在未添
加活性炭的培养基中均未诱导出小孢子胚，表明活性
炭处理对游离小孢子培养胚诱导率的提高具有显著的
促进作用，最适的处理浓度为 0.5 g/L。而培养基中
0.01~0.02 g/L活性碳的添加有利于促进大白菜小孢子
胚状体的形成[37]。由此可知，根据试材的不同，适量的
添加活性炭对小孢子胚胎发生和形成具有促进作
用[33,38-40]。其原因可能是活性炭吸附了小孢子培养过
程中产生和释放的有毒物质[36]。活性炭的过量添加则
导致产胚率下降，可能与培养过程中吸附有毒害物质
的同时也吸附了培养基中的营养物质有关[37]。
3.5 6-BA和NAA
多数试验结果表明，在NLN-13培养基中添加适宜
浓度的6-BA有利于提高小孢子胚状体诱导率[37,41-43]，而
浓度过高则可能对小孢子发生产生抑制作用，增加畸
形胚的比例。NAA虽然会抑制某些材料的胚发生，但
其同时也减少了畸形胚的发生率[43]。部分试验结果表
明，同时添加适宜浓度的 6-BA和NAA也有利于促进
小孢子胚胎发生 [39,44-45]。然而，对于某些难出胚的材
料，不论是加入6-BA还是6-BA和NAA,出胚率都不会
发生变化。某些试验材料在加入NAA后，还会出现受
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张 慧等：芸薹属蔬菜游离小孢子成胚影响因素研究进展
抑制的现象[38,43,46]。这可能是不同基因型对激素反应
及含量的要求不同所致。
4 问题及展望
近年来，芸薹属蔬菜游离小孢子培养技术在育种
工作和基础研究的应用中取得了丰硕的成果，并且得
到了进一步的完善，但是该技术的一些作用机制还不
十分清楚。多数试验已证实，小孢子胚胎发生能力的
主控基因存在于细胞核中，但除了已经被认可的从甘
蓝型油菜中分离的BBM基因外，其余的作用基因及其
功能仍属未知，需加大在此方向的研究，深入了解基因
型的本质，这有利于后期试验中更有针对性的选择基
因型，减少试验的盲目性。深入探讨环境温度、花蕾长
度、小孢子发育时期这三者之间的关系，有利于确定最
佳的取材时间。在实际操作中，人们也急需找到一种
可快速、简便、具有低伤害率且适用于大量处理材料的
小孢子提取法。激素与活性炭的添加量、处理时间及
处理后的效果因材而异，就具体试验来说，激素与活性
炭的使用可参考借鉴相关研究的成果，这有利于更加
便捷的找到最佳用法。低温预处理与高温热激处理，
虽然对提高产胚率具有一定的作用，但它们的作用机
理尚不明确，且高温热激处理后的小孢子成活率也有
待提高。实际的游离小孢子培养研究中，需综合考虑
上述问题，以期找到使小孢子培养技术更为完善的方
法，从而扩大其应用范围，使其成为应用其他生物技术
的桥梁。
参考文献
[1] Zhang F L, Takahala Y. Inheritance of microspore embryogenetic
ability in Brassica crops [J]. Theor Appl Genet, 2001,103(2-3):
254-258.
[2] 杨安平,张恩慧,尚丽荣,等.结球甘蓝F1、F2、双交种及其亲本的游
离小孢子胚胎发生能力分析[J].西北农林科技大学学报:自然科
学版,2009,37(8):171-176.
[3] 方淑桂,陈文辉,曾小玲,等.结球甘蓝游离小孢子培养及植株再生
[J].园艺学报,2006,33(1):158-160.
[4] 余凤群,刘后利.供体材料和培养基类型对甘蓝型油菜小孢子胚状
体产量的影响[J].华中农业大学学报,1995,14(4):327-331.
[5] 张凤兰,高田义.甘蓝型油菜游离小孢子培养胚发生能力的遗传分
析.华北农学报[J],2001,16(1):27-32.
[6] 赵前程,蔡荣旗,刘莉莉,等.影响花椰菜游离小孢子培养因素的研
究[J].江苏农业科学,2007(4):93-95.
[7] 王长龙,杨培新,郑奕雄.结球芥菜游离小孢子培养的胚状体发生
[J].江西农业学报,2011,23(11):31-33.
[8] 袁素霞,孙继峰,刘玉梅,等.植物游离小孢子胚胎形成机理[J].生物
技术通报,2011(10):7-16.
[9] 张凤兰,钉贯靖久,古川宏昭.环境条件对大白菜小孢子培养的影
响[J].华北农学报,1994,9(1):95-100.
[10] 官春云.油菜小孢子培养和双单倍体育种研究[J].作物学报,1995,
21(6):665-670.
[11] 王亦菲,陆瑞菊,孙月芳,等.大田油菜游离小孢子培养高频胚状体
诱导及植株再生[J].中国农学通报,2002,18(1):20-23.
[12] 赵小萍,王灏,李殿荣,等.甘蓝型油菜双单倍体高效诱导技术体系
的优化研究[J].现代生物医学进展,2009,19(13):2487-2491.
[13] 王秀英.大白菜游离小孢子培养胚胎发生率的影响因素[J].山西农
业大学,2008,36(5):84-87.
[14] 姜立荣,刘凡,李怀军,等.大白菜游离小孢子胚胎发生早期的超微
结构研究[J].北京农业科学,1996,60(1):28-31.
[15] 申书兴,赵前程,刘世雄,等.四倍体大白菜小孢子植株的获得倍性
鉴定[J].园艺学报,1999,26(4):232-237.
[16] 李岩,刘凡,曹鸣庆.通过游离小孢子培养方法获得小白菜三个变
种的胚胎及植株[J].华北农学报,1993,8(3):92-97.
[17] 宋立晓,冯翠,曾爱松,等.影响青花菜游离小孢子培养胚胎发生的
因子[J].江苏农业学报,2010,26(6):1319-1322.
[18] 王秀英,巫东堂,赵军良,等.影响大白菜游离小孢子培养因素的研
究[J].中国瓜菜,2009(2):10-12.
[19] 张亚丽,张鲁刚,张华敏,等.早熟大白菜游离小孢子胚诱导及植株
再生的研究[J].甘肃农业大学学报,2009,44(3):45-49.
[20] 马丽华,沈火林,郭爽,等.不结球白菜游离小孢子培养成胚影响因
素的研究[J].华北农学报,2007,22(5):63-66.
[21] 冯翠,曾爱松,严继勇,等.影响青花菜游离小孢子培养的因素[J].南
京农业大学学报,2011,34(6):20-24.
[22] 冯辉,姜凤英,冯建云,等.羽衣甘蓝游离小孢子培养技术研究及应
用[J].园艺学报,2007,34(4):1019-1022.
[23] 陆瑞菊,王亦菲,孙月芳,等.提高青花菜游离小孢子培养反应的研
究[J].上海农业学报,2006,22(2):1-4.
[24] 耿建峰,侯喜林,张晓伟,等.影响白菜游离小孢子培养关键因素分
析[J].园艺学报,2007,34(1):111-116.
[25] 李必元,叶国锐,王五宏,等.结球白菜游离小孢子培养与植株再生
[J].浙江农业科学,2012(4):503-506.
[26] 龙卫华,浦惠明,戚存扣,等.油菜小孢子高效培养体系构建Ⅰ.影响
小孢子成胚的若干因素研究 [J].江苏农业学报,2008,24(6):
792-796.
[27] 包美丽,付颖,郑鹏婧,等.黄心春结球白菜游离小孢子培养体系的
优化[J].沈阳农业大学学报,2011,42(4):417-421.
[28] 牛永超,李加纳,殷家明,等.基因型和处理温度对芥菜型油菜游离
小孢子培养的影响[J].西南大学学报,2010,32(8):23-28.
[29] 谢映忠,蒋武生,黄邦海,等.芥兰游离小孢子培养研究[J].广东农业
科学,2010(10):55-56.
[30] 桑玉芳,张恩慧,杨安,等.甘蓝游离小孢子培养中影响胚状体形成
的主要因素[J]西北农业学报,2007,16(2):125-129.
[31] 赵前程,李素文,文正华,等.芥蓝游离小孢子培养及植株再生研究
[J].北方园艺,2007(9):4-6.
[32] 石淑稳,吴江生,周永明,等.甘蓝型油菜小孢子单倍体二倍体化技
术研究[J].中国油料作物学报,2002,24(1):1-5.
[33] 王秀英,巫东堂,赵军良,等.影响大白菜游离小孢子培养若干因素
的研究[J].山西农业大学学报:自然科学版,2009,29(3):243-247.
[34] 杨安平,张恩慧,郑爱泉,等.秋水仙碱对甘蓝游离小孢子胚胎发生
及发育的影响[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2010,38(8):
131-137.
·· 95
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
[35] 李浩杰,蒲晓斌,张锦芳,等.甘蓝型油菜NER游离小孢子培养能力
研究[J].西南农业学报,2009,22(6):1518-1521.
[36] 蒋武生,张晓伟,姚秋菊,等.活性炭对小白菜游离小孢子培养的影
响[J].华北农学报,2008,23(5):93-96.
[37] 徐艳辉,冯辉,张凯.大白菜游离小孢子培养中若干因素对胚状体
诱导和植株再生影响[J].北方园艺,2001,3:6-8.
[38] 田保明,蒋武生,张晓伟,等.提高油菜游离小孢子胚诱导频率的研
究[J].华北农学报,2007,22(1):116-119.
[39] 徐文玲,王翠花,牟晋华,等.大白菜游离小孢子胚状体诱导影响因
素的研究[J].山东农业科学,2007(6):8-10.
[40] 盛鹏,岳艳玲,李祥,等.活性炭对大白菜游离小孢子成胚和成苗的
影响[J].北方园艺,2010(19):13-15.
[41] 轩正英,徐书法,冯辉.大白菜游离小孢子培养成胚影响因素的研
究[J].辽宁农业科学,2005(2):18-19.
[42] 付文婷,张鲁刚,胥宇建,等.大白菜游离小孢子胚诱导及植株再生
[J].西北农业学报,2010,19(3):139-143.
[43] 盛鹏,张秀荣,岳艳玲,等.光照和激素对耐热型大白菜游离小孢子
培养的影响[J].吉林农业大学学报,2011,33(6):649-653.
[44] 刘艳玲,简元才,李成琼,等.结球甘蓝游离小孢子培养胚发生能力
的研究[J].西南农业大学学报,2006,28(3):439-446.
[45] 付颖,杨硕,包美丽,等.小菘菜游离小孢子培养技术研究[J].中国蔬
菜,2011(8):51-54.
[46] 蒋武生,原玉香,张晓伟,等.小白菜游离小孢子培养及其再生植株
[J].河南农业大学学报,2005,39(4):398-401.
·· 96