全 文 ：第４２卷 第９期
２０１４年９月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４２ Ｎｏ．９
Ｓｅｐ．２０１４
网络出版时间：２０１４－０７－３０ １６：１３ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１４．０９．０１２
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｏｉ／１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１４．０９．０１２．ｈｔｍｌ
长白山区不同花色杓兰属植物
遗传多样性的ＩＳＳＲ分析
［收稿日期］ ２０１３－０６－２８
［基金项目］ 农业部野生植物资源调查项目（２０１２Ｚ３２）；吉林省科技厅项目（２０１００２５４）
［作者简介］ 孙叶迎（１９８８－），女，吉林舒兰人，在读硕士，主要从事分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｙｅｙｉｎｇ３９２８＠１６３．ｃｏｍ
［通信作者］ 刘洪章（１９５７－），男，吉林长春人，教授，博士生导师，主要从事果树种质资源学、经济作物资源与生物技术研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｈｚ９９９＠１２６．ｃｏｍ
孙叶迎ａ，陈丽飞ｂ，刘树英ａ，刘 昕ａ，曹 岩ａ，刘洪章ａ
（吉林农业大学ａ生命科学学院，ｂ园艺学院，吉林 长春１３０１１８）
［摘 要］ 【目的】分析长白山地区不同花色杓兰属植物的遗传多样性。【方法】采用ＩＳＳＲ分子标记技术，对长
白山区８个花色１１个杓兰属植物个体的遗传多样性进行分析，用Ｐｏｐｇｅｎ３２软件分析 Ｎｅｉ’ｓ基因多样性和Ｓｈａｎｎｏｎ
信息指数，采用ＵＰＧＭＡ法进行聚类分析。【结果】筛选出１１条ＩＳＳＲ引物，共扩增出９４条条带，其中多态性条带８６
条，多态基因位点比例为９１．５％，平均有效等位基因数为１．４１８ ２，平均Ｎｅｉ’ｓ基因多样性为０．２５０ ０，平均Ｓｈａｎｎｏｎ信
息指数为０．３６９ ７，样品间的遗传距离为０．０１０ ５～０．９６９ ７。【结论】长白山区杓兰属植物具有较丰富的遗传多样性，
聚类结果与形态学分类结果基本一致。
［关键词］ 长白山区；杓兰属；简单重复序列区间；遗传多样性
［中图分类号］ Ｓ６８２．３１ ［文献标志码］ Ａ ［文章编号］ １６７１－９３８７（２０１４）０９－０１３７－０７
ＩＳＳＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ
ｉｎ Ｃｈａｎｇｂａｉ Ｍｏｕｎｔａｉｎ ａｒｅａ
ＳＵＮ Ｙｅ－ｙｉｎｇａ，ＣＨＥＮ Ｌｉ－ｆｅｉ ｂ，ＬＩＵ Ｓｈｕ－ｙｉｎｇａ，
ＬＩＵ Ｘｉｎａ，ＣＡＯ Ｙａｎａ，ＬＩＵ Ｈｏｎｇ－ｚｈａｎｇａ
（ａＣｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｂ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ，Ｊｉｌｉｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｗａｓ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ
ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｒｓ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ １１ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ８
ｃｏｌｏｒ ｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｃｈａｎｇｂａｉ Ｍｏｕｎｔａｉｎ ａｒｅａ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ＩＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ．Ｎｅｉ’ｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ ａｎｄ
Ｓｈａｎｎｏｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ Ｐｏｐｇｅｎ ３２ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ
ｕｓｉｎｇ ＵＰＧＭＡ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｅｌｅｖｅｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ９４
ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ ８６ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＰＢ ｏｆ ９１．５％．Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｕｍ－
ｂｅｒ ｏｆ ａｌｅｌｅｓ，Ｎｅｉ’ｓ ｇｅｎｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｓｈａｎｎｏｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ ｗｅｒｅ １．４１８ ２，０．２５０ ０，ａｎｄ ０．３６９ ７，ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ １１ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗａｓ ０．０１０ ５－０．９６９ ７．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
ｉｎ Ｃｈａｎｇｂａｉ Ｍｏｕｎｔａｉｎ ａｒｅａ ｈａｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙ ｇｒｅａｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｇｅｎ－
ｅｒａｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｒｅｓｕｌｔｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｈａｎｇｂａｉ Ｍｏｕｎｔａｉｎ；Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ；ＩＳＳＲ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
杓兰属（Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ）是兰科的一个属，多年 生草本植物［１］。杓兰属植物最显著的特征是其花唇
瓣特化成兜状，因此，有人称之为“大口袋花”。杓兰
属植物低垂的花瓣酷似拖鞋，生活在终年云雾缭绕、
遍地野花的高山上，也被称为“仙女的拖鞋”，西方人
美其名曰“ｌａｄｙ’ｓ ｓｌｉｐｐｅｒ”，即拖鞋兰［２］。此属植物
花形奇特，颜色艳丽，株型优雅多姿，观赏价值极高，
深受园艺学家们的喜爱，并将收集杓兰属植物作为
目标［３］。杓兰属的地理分布式样较杓兰亚科中其他
４个属复杂［１，４］。５０余种杓兰属植物广泛分布在北
半球温带和亚热带山地，东亚和北美为主要的分布
中心［１，５］。我国杓兰属植物种类繁多，资源丰富，被
称作杓兰资源多样性中心［６－７］。据《中国植物志》记
载，中国有杓兰属植物３２种及１个变种，近年来报
道或正式命名的新品种有４个［８－１１］，共３６种，１个变
种，其中２１种及１变种是我国的特有种。据《东北
植物检索表》记载，东北地区分布的杓兰属植物有大
花杓兰、斑花杓兰、杓兰和黄铃杓兰４个种及大白花
杓兰１个变型［１２］。长白山地区除了上述杓兰属植
物外还有东北杓兰、山西杓兰，但在长白山地区，甚
至东北地区均未见黄铃杓兰的模式标本植物［１３］。
目前，杓兰属植物由于遭破坏性采挖加之其繁育困
难，造成其种群数量下降，已处于严重濒危状态［１４］，
被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》的保护
范围［１，１５－１６］。种群内遗传多样性的丢失会导致物种
对环境变化的适应性降低，增加了灭绝的危险，所
以，对于幸存的濒危物种而言，研究其遗传多样性，
对濒危物种的管理保护及遗传多样性的评定至关重
要［３，１７－１８］。
ＩＳＳＲ（Ｉｎｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ）又称简单
重复序列区间，是由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［１９］创建的新型分
子标记技术。它是在ＳＳＲ分子标记的基础上建立
起来的，与ＳＳＲ分子标记相比无需知道ＤＮＡ序列
的信息；重复性好，克服了ＲＡＰＤ分子标记不稳定
的缺点。在真核生物中，微卫星ＤＮＡ分布广泛，且
变异速度快，利用ＩＳＳＲ引物对微卫星ＤＮＡ序列进
行扩增，能够快速检测出差异位点，因此ＩＳＳＲ标记
在植物遗传育种研究中得到广泛应用。但在杓兰属
植物的研究中尚未见报道。
本试验采用ＩＳＳＲ分子标记技术对长白山区不
同花色的杓兰属植物进行研究探讨，对其遗传多样
性以及亲缘关系进行分析，全面掌握长白山区现有
杓兰属种质资源的遗传多样性，减少育种工作中亲
本选择的盲目性，提高育种效率，以期更好地对濒危
物种进行保护。
１ 材料与方法
１．１ 材 料
供试材料采自于长白山区，分别为大花杓兰
（Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｍａｃｒａｎｔｈｕｍＳｗ．）、东北杓兰（Ｃｙｐ－
ｒｉｐｅｄｉｕｍ×ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｍＳｗ．）、杓兰（Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ
ｃａｌｃｅｏｌｕｓ Ｌ．）、山西杓兰（Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｓｈａｎｘｉｅｎｓｅ
Ｓ．Ｃ．Ｃｈｅｎ）４个种，以萼片颜色区分，共８个颜色１１
个个体，具体如表１所示。于２０１２－０６采集各种植
物新鲜叶片置于冰盒中带回，于－８０℃低温冰箱保
存。
表１ 供试杓兰属植物材料的概况
Ｔａｂｌｅ １ Ｇｅｎｅｒａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｓｔｅｄ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
编号
Ｎｕｍｂｅｒ
种名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
萼片颜色
Ｓｅｐａｌｓ ｃｏｌｏｒ
编号
Ｎｕｍｂｅｒ
种名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
萼片颜色
Ｓｅｐａｌｓ ｃｏｌｏｒ
Ｂ１
大花杓兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｍａｃｒａｎｔｈｕｍＳｗ．
浅粉红色
Ｂａｂｙ ｐｉｎｋ
Ｂ７
杓兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｃａｌｃｅｏｌｕｓ Ｌ．
栗色
Ｍａｒｏｏｎ
Ｂ２
大白花杓兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｍａｃｒａｎｔｈｕｍＳｗ．
白色
Ｗｈｉｔｅ Ｂ８
杓兰变型
Ｆｏｒｍａ ｏｆ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ
紫红色
Ｐｕｒｐｌｅ
Ｂ３
大花杓兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｍａｃｒａｎｔｈｕｍＳｗ．
深粉红色
Ｒａｄｉａｎｃｅ Ｂ９
山西杓兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｓｈａｎｘｉｅｎｓｅ．Ｓ．Ｃ．Ｃｈｅｎ
褐色
Ｂｒｏｗｎ
Ｂ４
东北杓兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ×ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｍＳｗ．
粉白色
Ｐｉｎｋ－ｗｈｉｔｅ
Ｂ１０
东北杓兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ×ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｍＳｗ．
紫红色
Ｐｕｒｐｌｅ
Ｂ５
杓 兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｃａｌｃｅｏｌｕｓ Ｌ．
紫红色
Ｐｕｒｐｌｅ
Ｂ１１
山西杓兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｓｈａｎｘｉｅｎｓｅ．Ｓ．Ｃ．Ｃｈｅｎ
褐色
Ｂｒｏｗｎ
Ｂ６
大花杓兰
Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｍａｃｒａｎｔｈｕｍＳｗ．
粉红色
Ｐｉｎｋ
１．２ 方 法
１．２．１ 基因组 ＤＮＡ 提取及质量检测 采用
ＣＴＡＢ法［２０－２１］提取４种植物１１个个体的基因组
ＤＮＡ，并用１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测基因组
ＤＮＡ质量，凝胶成像系统（ＵＶＰ ＧｅｌＤｏｃ－ＩｔＴＭ 型）
照相，保存。再用Ｂｉ－ＰＨｏｔｏｍｅｔｅ（ＥＰｐｅｎｄｏｒ公司）
核酸检测仪测定ＯＤ２６０／ＯＤ２８０及ＯＤ２６０／ＯＤ２３０，检测
ＤＮＡ样品的纯度与浓度。
１．２．２ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增与电泳 试验用哥伦比亚
大学报道的植物通用的ＩＳＳＲ引物和相关文献报道
的引物［２２－２３］，均由北京三博远志生物技术有限责任
公司合成，共３７个。从中筛选扩增条带清晰、多态
８３１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４２卷
性高、重现性好的引物，参考不同引物的退火温度，
采用梯度ＰＣＲ确定每个引物的退火温度。扩增反
应在ＰＣＲ（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｐｅｒｓｏｎａｌ）
扩增仪上进行。ＩＳＳＲ 反应体系２５μＬ：１．５μＬ
ＤＮＡ模板（２０ｎｇ／μＬ），１．５μＬ引物（１０μｍｏｌ／Ｌ），２
μＬ ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，宝生物工程 （大连）有限
公司），２．５μＬ １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，０．１５μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ
聚合酶（５Ｕ／μＬ，宝生物工程 （大连）有限公司）；
１７．３５μＬ ｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ扩增程序：９４℃预变性４
ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ；５５～５７℃退火１ｍｉｎ，７２℃
延伸１．５ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃１５
ｍｉｎ终止反应。所得产物用６０ｇ／Ｌ聚丙烯酰胺凝
胶电泳（１×ＴＢＥ）检测，５６０Ｖ电压电泳１ｈ，再用体
积分数１０％醋酸溶液固定３０ｍｉｎ，银染１０ｍｉｎ，强
碱显影直至条带清晰，照相，观察扩增结果。所有试
验均重复２次。
１．３ 数据统计与分析
用聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行分离后，对
电泳图进行人工读带。其中每条带视为１个分子标
记［２１］，即１个引物的结合位点，以２５０ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄ－
ｄｅｒ为标准，对重复性好的条带进行统计，无论强弱
有则记为１，无则记为０，模糊不清的条带也记为０。
将数据输入数据矩阵，使用 ＮＴＳＹＳ－ｐｃ软件对不同
花色杓兰属植物之间的相似系数进行分析，采用
ＵＰＧＭＡ法分析样品间的遗传关系，进行聚类分析。
用Ｐｏｐｇｅｎｅ３２软件［２４］分析观测的等位基因数（ｎａ）、
有效等位基因数（ｎｅ）、Ｎｅｉ’ｓ基因多样性（Ｈｅ）、
Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数（Ｈｏ）和遗传距离。
２ 结果与分析
２．１ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ引物筛选及扩增
随机选取３份供试材料作为模板进行扩增，结
果显示，在３７个引物中筛选出１４个条带清晰、具有
差异的引物；再用这１４个引物分别对１１份材料进
行复筛，最终确定扩增效果较好的１１个引物（表
２）。引物 ＵＢＣ８３５对１１个个体的ＤＮＡ扩增结果
见图１。经统计１１个引物共扩增出９４条条带，平
均每个引物获得８．５条条带，其中多态性条带为８６
条，多态基因位点比例为９１．５％（表２）。
表２ 对１１份杓兰属植物材料扩增效果好的ＩＳＳＲ引物序列及多态性分析
Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
退火温度／℃
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐ．
扩增条带数
Ｎｂ
多态条带数
Ｎｐｂ
多态基因位点比例％
Ｒａｔｉｏ
ＵＢＣ８１１ （ＧＡ）８Ｃ ５６ ４ ３ ７５．０
ＵＢＣ８２６ （ＡＣ）８Ｃ ５７ ７ ６ ８５．７
ＵＢＣ８２７ （ＡＣ）８Ｇ ５８ ８ ８ １００．０
ＵＢＣ８３４ （ＡＧ）８ＹＴ ５５ １５ １５ １００．０
ＵＢＣ８３５ （ＡＧ）８ＹＣ ５７ １３ １１ ８４．６
ＵＢＣ８３６ （ＡＧ）８ＹＡ ５７ ５ ４ ８０．０
ＵＢＣ８４０ （ＧＡ）８ＹＴ ５７ ９ ９ １００．０
ＵＢＣ８４１ （ＧＡ）８ＹＣ ５５ ８ ８ １００．０
ＵＢＣ８４４ （ＣＴ）８ＲＧ ５６ ９ ９ １００．０
ＵＢＣ８５５ （ＡＣ）８ＹＴ ５７ ９ ８ ８８．９
ＵＢＣ８５６ （ＡＣ）８ＹＡ ５７ ７ ５ ７１．４
总计 Ｔｏｔａｌ － － ９４ ８６ ９１．５
图１ 引物ＵＢＣ８３５对１１份杓兰属植物材料的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
Ｆｉｇ．１ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １１ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ ＵＢＣ８３５
９３１第９期 孙叶迎，等：长白山区不同花色杓兰属植物遗传多样性的ＩＳＳＲ分析
２．２ 杓兰属植物的ＩＳＳＲ特异性标记
图２、３分别为引物 ＵＢＣ８４４、ＵＢＣ８５６对１１分
杓兰属植物材料基因组ＤＮＡ的扩增结果。本研究
中，１１条引物共产生了９条特异性条带，具有特异
性条带的植物样品见表３。由表３可以看出，深粉
色大花杓兰Ｂ３ 和栗色的杓兰Ｂ７ 特异性标记最多，
各有３条；紫红色杓兰Ｂ５、粉红色大花杓兰Ｂ６、紫红
色东北杓兰Ｂ１０各有１条特异性条带。
图２ 引物ＵＢＣ８４４对１１份杓兰属植物材料的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
箭头所示为特异性条带，下图同
Ｆｉｇ．２ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １１ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ ＵＢＣ８４４
Ａｒｒｏｗｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄｓ，ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ
图３ 引物ＵＢＣ８５６对１１份杓兰属植物材料的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
Ｆｉｇ．３ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １１ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ ＵＢＣ８５６
表３ 杓兰属植物的ＩＳＳＲ特异性标记样品
Ｔａｂｌｅ ３ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｓａｍｐｌｅｓ
样品编号
Ｓａｍｐｌｅ ｃｏｄｅ
种名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
萼片颜色
Ｓｅｐａｌｓ ｃｏｌｏｒ
特异性标记
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒ
Ｂ３ 大花杓兰Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｍａｃｒａｎｔｈｕｍＳｗ． 深粉红色 Ｒａｄｉａｎｃｅ ＵＢＣ８４４ １５ ０００ｂｐ，９００ｂｐ；ＵＢＣ８５６ １ ２００ｂｐ
Ｂ５ 杓兰Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｃａｌｃｅｏｌｕｓ Ｌ． 紫红色Ｐｕｒｐｌｅ ＵＢＣ８４０ ２ ０００ｂｐ
Ｂ６ 大花杓兰Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ａｃｒａｎｔｈｕｍＳｗ． 粉红色Ｐｉｎｋ ＵＢＣ８５５ ２ ０００ｂｐ
Ｂ７ 杓兰Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｃａｌｃｅｏｌｕｓ Ｌ． 栗色 Ｍａｒｏｏｎ ＵＢＣ８３４ ５００ｂｐ；ＵＢＣ８５６ ２ ０００ｂｐ，１ ０００ｂｐ
Ｂ１０ 东北杓兰Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ×ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｍＳｗ． 紫红色Ｐｕｒｐｌｅ ＵＢＣ８４４ １ ０００ｂｐ
２．３ 杓兰属植物的遗传多样性
表４显示，１１份材料的平均有效等位基因数为
１．４１８ ２，平均 Ｎｅｉ’ｓ基因多样性为０．２５０ ０，平均
Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数为０．３６９ ７。其中 Ｎｅｉ’ｓ基因多
样性最大值为０．５００ ０，最小值为０．００００；Ｓｈａｎｎｏｎ
信息指数最大值为０．６９３ １，最小值为０．００００，可
见，各位点遗传多样性程度存在较大差别。
表４ 不同花色杓兰属植物材料的遗传多样性
Ｔａｂｌｅ ４ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｒｓ
样品
Ｓａｍｐｌｅ ｃｏｄｅ
样本大小
Ｓａｍｐｌｅ ｓｉｚｅ
观测的等位基因数
ｎａ
有效等位基因数
ｎｅ
Ｎｅｉ’ｓ基因多样性
Ｈｅ
Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数
Ｈｏ
Ｂ１ ４ １．０００ ０ １．０００ ０ ０．０００ ０ ０．０００ ０
Ｂ２ ４ ２．０００ ０ １．６００ ０ ０．３７５ ０ ０．５６２ ３
Ｂ３ ４ １．０００ ０ １．０００ ０ ０．０００ ０ ０．０００ ０
０４１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４２卷
续表４ Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｔａｂｌｅ ４
样品
Ｓａｍｐｌｅ ｃｏｄｅ
样本大小
Ｓａｍｐｌｅ ｓｉｚｅ
观测的等位基因数
ｎａ
有效等位基因数
ｎｅ
Ｎｅｉ’ｓ基因多样性
Ｈｅ
Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数
Ｈｏ
Ｂ４ ４ ２．０００ ０ １．６００ ０ ０．３７５ ０ ０．５６２ ３
Ｂ５ ４ ２．０００ ０ １．６００ ０ ０．３７５ ０ ０．５６２ ３
Ｂ６ ４ １．０００ ０ １．０００ ０ ０．０００ ０ ０．０００ ０
Ｂ７ ４ １．０００ ０ １．０００ ０ ０．０００ ０ ０．０００ ０
Ｂ８ ４ ２．０００ ０ １．６００ ０ ０．３７５ ０ ０．５６２ ３
Ｂ９ ４ ２．０００ ０ １．６００ ０ ０．３７５ ０ ０．５６２ ３
Ｂ１０ ４ ２．０００ ０ ２．０００ ０ ０．５００ ０ ０．６９３ １
Ｂ１１ ４ ２．０００ ０ １．６００ ０ ０．３７５ ０ ０．５６２ ３
平均值 Ｍｅａｎ ４ １．６３６ ４ １．４１８ ２ ０．２５０ ０ ０．３６９ ７
２．４ 杓兰属植物的遗传距离和相似系数
１１份材料的遗传距离和遗传相似系数见表５。
表５显示，样本间的遗传距离为０．０１０ ５～０．９６９ ７，
其中Ｂ４ 大花杓兰（浅粉红色）与Ｂ６ 东北杓兰（粉白
色）之间的遗传距离最小，为０．０１０ ５；Ｂ４ 大花杓兰
（浅粉红色）与Ｂ５ 杓兰（紫红色）及Ｂ９ 山西杓兰（褐
色）与Ｂ１０东北杓兰（紫红色）的遗传距离均最大，为
０．９６９ ７。
表５ 不同花色杓兰属遗植物的遗传距离（对角线以下）和相似系数（对角线以上）
Ｔａｂｌｅ ５ Ｎｅｉ’ｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ（ａｂｏｖｅ ｄｉａｇｏｎａｌ）ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（ｂｅｌｏｗ ｄｉａｇｏｎａｌ）ｏｆ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｒｓ
编号
Ｃｏｄｅ Ｂ１ Ｂ２ Ｂ３ Ｂ４ Ｂ５ Ｂ６ Ｂ７ Ｂ８ Ｂ９ Ｂ１０ Ｂ１１
Ｂ１ ＊＊＊＊ ０．８４０ ６ ０．９７７ ３ ０．７１５ ２ ０．８９７ ９ ０．４４７ ７ ０．８４１ ７ ０．２６９ １ ０．７５８ ９ ０．６２８ ６ ０．４２２ ４
Ｂ２ ０．１５９ ４ ＊＊＊＊ ０．６３３ ４ ０．６６４ ７ ０．６６４ ７ ０．３４１ ６ ０．２１０ ２ ０．４３８ ２ ０．８２３ ５ ０．６０４ ４ ０．６８６ ３
Ｂ３ ０．０２２ ７ ０．３６６ ６ ＊＊＊＊ ０．４９１ ９ ０．２５３ ７ ０．７４１ ９ ０．７４２ ３ ０．２３２ ７ ０．２９２ １ ０．８９３ ９ ０．７１２ ７
Ｂ４ ０．２８４ ７ ０．３３５ ３ ０．５０８ ６ ＊＊＊＊ ０．０３０ ３ ０．９８９ ６ ０．４９１ ０ ０．６９６ ６ ０．９６１ ９ ０．４４１ ２ ０．２０２ １
Ｂ５ ０．１０２ １ ０．３３５ ３ ０．７４６ ３ ０．９６９ ７ ＊＊＊＊ ０．０４８ ７ ０．６６３ ６ ０．７５２ ２ ０．０４８ ７ ０．６３７ ４ ０．４８３ ３
Ｂ６ ０．５５２ ３ ０．６５８ ４ ０．２５８ １ ０．０１０ ５ ０．９５１ ３ ＊＊＊＊ ０．１２５ ５ ０．７２８ ７ ０．７３１ ３ ０．６０７ ３ ０．８８４ ０
Ｂ７ ０．１５８ ３ ０．７８９ ８ ０．２５７ ７ ０．５２９ １ ０．３３６ ４ ０．８７４ ７ ＊＊＊＊ ０．２１１ ８ ０．３３９ ８ ０．８１４ ６ ０．３６５ ５
Ｂ８ ０．７３０ ９ ０．５６２ ０ ０．７６７ ３ ０．３０３ ４ ０．２４７ ８ ０．２７１ ３ ０．７８９ ８ ＊＊＊＊ ０．５２４ ８ ０．７０５ ６ ０．４３４ ６
Ｂ９ ０．２４１ １ ０．１７６ ４ ０．７０７ ９ ０．０３８ １ ０．９５１ ３ ０．２６８ ７ ０．６６０ ２ ０．４７５ ２ ＊＊＊＊ ０．０３０ １ ０．９２２ ４
Ｂ１０ ０．３７１ ４ ０．３９５ ９ ０．１０６ １ ０．５５８ ８ ０．３６２ ６ ０．３９２ ７ ０．１８５ ４ ０．２９４ ４ ０．９６９ ７ ＊＊＊＊ ０．７８５ １
Ｂ１１ ０．５７７ ６ ０．３１３ ７ ０．２８７ ３ ０．７９７ ９ ０．５１６ ７ ０．１１６ ０ ０．６３４ ５ ０．５６５ ４ ０．０７７ ６ ０．２１５ １ ＊＊＊＊
２．５ 杓兰属植物的聚类分析
图５为８个不同花色１１个杓兰属植物个体的
ＩＳＳＲ聚类图。在相似系数为０．６２时，将１１个材料
分为２类，４种颜色的大花杓兰分为一类，另一类为
２种花色的杓兰、东北杓兰、山西杓兰以及紫红色杓
兰变型。相似系数为０．６６时，将第１类中的粉红色
大花杓兰单分为一组；第２类中分为２组：２种花色
的杓兰与２种花色的东北杓兰分为一组，２种花色
山西杓兰与杓兰变型分为一组。
图４ １１个杓兰属植物的聚类分析结果
Ｆｉｇ．４ ＵＰＧＭＡ ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｏｆ １１ Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
１４１第９期 孙叶迎，等：长白山区不同花色杓兰属植物遗传多样性的ＩＳＳＲ分析
３ 讨 论
３．１ 杓兰属植物的遗传多样性
本研究结果表明，长白山区杓兰属植物的多态
基因位点比例为９１．５％，平均 Ｎｅｉ’ｓ基因多样性
（Ｈｅ）为０．２５０ ０，平均Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数（Ｈｏ）为
０．３６９ ７，表现出较高的遗传多样性。Ｔａｋｅｓｈｉ等［３］
对日本礼文岛濒危大花杓兰的遗传多样性研究结果
表明，礼文岛的大花杓兰具有较高的遗传多样性，多
态基因位点比例为６２％，观测的等位基因数为
１．８５，有效等位基因数为１．２８，Ｎｅｉ’ｓ基因多样性为
０．１８７，Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数为０．１６３，较长白山区杓
兰属植物遗传多样性低；Ｂｒｚｏｓｋｏ等［２５］研究表明，
Ｃ．ｃａｌｃｅｏｌｕｓ的遗传多样性（多态基因位点比例为
４６％，观测的等位基因数为１．７３，Ｎｅｉ’ｓ基因多样性
为０．１５６，Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数为０．１８４）也比长白山
区杓兰属植物低。而蔡凝枫等［２６］采用ＲＡＰＤ标记
对云南中甸黄花杓兰的遗传多样性进行研究，发现
其多态基因位点比例为８２．６９％，Ｎｅｉ’ｓ基因多样性
为０．２８８ ４，Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数为０．４３１ ２；Ｍｉｃｈａｅｌ
等［２７］发现，欧洲西北部杓兰的多态基因位点比例为
８２．５％，观测的等位基因数为１．２７８，Ｎｅｉ’ｓ基因多
样性为０．４０～０．５３。可见以上地区杓兰属植物均
较长白山区杓兰属植物的遗传多样性高。推断野生
杓兰属资源遭到破坏的主要原因是人类的滥采滥
挖，对其进行保护可从以下２点入手：１）建立自然
保护区，加强对其生境的保护，禁止滥采滥挖，尤其
是商业性质的采集；２）生境破坏严重的地区可以进
行迁地保护。
３．２ 杓兰属植物的聚类分析
杓兰属植物隶属于兰科杓兰属，与其他兰科植
物一样，都是单子叶植物，杂交范围宽，种间甚至属
间都能杂交。兰科植物多适应虫媒传粉，花部特征
都表现出高度适应和特化，在自然杂交中变异性大，
种间种类很多，种的界限不清楚，一般多依照形态学
分类。本研究采用ＩＳＳＲ分子标记方法，对长白山
区８种不同花色１１个杓兰属植物个体进行了分类，
结果显示，分子标记的分类结果与形态学的分类结
果存在一定程度的一致性，大白花杓兰Ｂ２ 是大花杓
兰的一个变型，其花唇瓣与萼片颜色都为纯白色。
由聚类结果可知，大白花杓兰与浅粉红色的大花杓
兰Ｂ１ 关系更近，在聚类图上处于同一分支，这与形
态学分类结果一致；而东北杓兰是杓兰与大花杓兰
的天然杂交种，花型在形态上更接近于大花杓兰，但
却与杓兰聚为一类，由此可见，东北杓兰与杓兰的关
系更为密切。杓兰变型（Ｂ８）植物中，其每株植株上
具有２朵花，萼片颜色为紫红色，花唇瓣颜色为黄
色，具有褐色斑点，颜色与杓兰相似；此外，其上面花
朵的下萼片浅裂，下面花朵的下萼片深裂，与山西杓
兰相似，可见Ｂ８ 是介于杓兰与山西杓兰之间的一个
变型，但在有关的文献中并无记载，是一个新类型，
本研究将其暂定为杓兰变型，聚类结果显示其与山
西杓兰聚为一类，可见其与山西杓兰的亲缘关系更
近一些，是山西杓兰的一个变型。
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