全 文 ：2002年 3 月
March 2002
中国油料作物学报
Chinese journal of oil crop sciences
第 24 卷第 1 期
Vol.24 No.1
基因组原位杂交辨别芸薹属异源
四倍体 AA 、BB 、CC基因组研究
李宗芸1 , 栗茂腾2 , 黄荣桂2 , 伍晓明3 , 宋运淳1＊
(1.武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室 ,湖北 武汉 430072;
2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,湖北武汉 430070;3.中国农业科学院油料作物研究所 ,湖北武汉 430062)
摘要:利用基因组原位杂交(GISH)技术 , 以标记的白菜型油菜(AA , 2n=20)的基因组总 DNA 为探针 , 分别同
芥菜型油菜(AABB , 2n=36)和甘蓝型油菜(AACC , 2n=38)的中期染色体和间期核杂交 ,结果芥菜型油菜有 20 条
染色体表现大而明亮的杂交信号 ,其它染色体上信号很弱或无 ,可以区分 A、B基因组;甘蓝型油菜染色体上表现有
38 个信号 , A、C 基因组不能区分开来。以黑芥(BB , 2n=16)的基因组总 DNA 为探针与埃塞俄比亚芥(BBCC , 2n=
34)的中期染色体和间期核杂交 , 16 条染色体上显示明显的杂交信号 , 其它染色体上信号很弱。说明在长期的进化
过程中 ,芸薹属中 BB与 AA 和 CC 基因组间分化程度较大 ,而 AA 与 CC 基因组分化较小。基因组原位杂交表明最
强的信号多集中分布于着丝粒区 ,本文讨论了这种分布的可能原因。
关键词:基因组原位杂交;芸薹属;异源四倍体;基因组分化
中图分类号:S565.402.1　　　文献标识码:A　 文章编号:1007—9084(2002)01—0010—05
　　芸薹属(Brassica genus)植物中广泛种植有 6
个物种 ,包括二倍体白菜型油菜(B .rapa ,AA , 2n=
20)、黑芥(B .nigra , BB , 2n =16)、甘蓝(B.oler-
acea ,CC , 2n =18)和异源四倍体芥菜型油菜(B .
juncea ,AABB ,2n=36)、埃塞俄比亚芥(B .carina-
ta ,BBCC , 2n=34)、甘蓝型油菜(B .napus , AACC ,
2n=38)。这些重要农业资源的基因组组成 、起源 、
演化以及基因组间亲缘关系的研究是十分重要
的[ 1] 。比较基因组作图分析[ 2]表明 , A 、B 、C 基因组
的基因内容是基本相同的 ,具有高度的保守性 。但
在长期的进化过程中 ,染色体可能发生融合 、分裂以
及染色体片段的重复 、易位和重排 ,从而导致它们含
有不同的染色体结构 。Song 等[ 3]认为 ,在多倍体形
成后的早期世代中 ,可能伴随着快速基因组变化
(rapid genome change),复合种 B .juncea 基因组的
变化频率大于 B.napus。前人的研究[ 4～ 5]也表明
A 、C 基因组较为接近 , A 、B 基因组间同源性较低 。
利用荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization ,
FISH)技术对芸薹属 6 个物种 rDNA 物理定位研
究[ 6]也表明 , 复合种 rDNA 位点数并不是祖先种
rDNA位点数的简单组合 ,如 B.carinata 含有 4 个
rDNA位点 ,而它的祖先种 B.nigra 含有 2个 rD-
NA位点 , B .oleracea 含有 2 个主要 rDNA 位点 , 1
个次要位点 ,表明芸薹属双二倍体物种在进化过程
中发生了染色体重排。
植物中的多倍体现象普遍存在 ,大约 80%的被
子植物都是多倍体 。关于起源与进化路径 、距离 ,许
多植物还处于未知状态。基因组原位杂交(Genom-
ic in situ hybridization GISH)技术是分析异源多倍
体基因组组成 、起源 、演化以及基因组间亲缘关系的
一种有效的手段[ 7] 。这一技术是 20世纪 80年代末
90 年代初发展起来的 ,利用一个物种的基因组总
DNA作为标记探针 ,对另一物种的染色体进行原位
杂交 ,探测 2个物种间的亲缘关系 。GISH 技术可
准确评价各基因组的亲缘关系 ,快速而可靠地研究
各基因组的起源与进化[ 8 ～ 12] 。
本研究以芸薹属二倍体 B.nigra(BB , 2n=16)
和 B .rapa(AA ,2n=20)的基因组总 DNA为探针 ,
分别同异源四倍体 B .juncea(AABB , 2n=36)、B.
napus(AACC , 2n =38)、B .carinata(BBCC , 2n =
34)的中期染色体和间期核杂交 ,辨别芸薹属复合种
包含的AA 、BB和CC基因组 ,探讨AA 、BB和CC基
因组之间的关系。
收稿日期:2001—12—29
基金项目:国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金(97048607);国家自然科学基金重点项目(39830270)
作者简介:李宗芸(1964—),女 ,山东省日照市人 ,博士生,副教授 ,从事植物分子细胞遗传学研究。
＊联系人 , E-mai l:ycsong@whu.edu.cn
1　材料与方法
1.1　植物材料
供试材料包括白菜型油菜(B .rapa ,AA , 2n=
20)、黑芥(B.nigra , BB , 2n=16)、芥菜型油菜(B .
juncea ,AABB ,2n=36)、埃塞俄比亚芥(B .carina-
ta ,BBCC , 2n=34)、甘蓝型油菜(B .napus , AACC ,
2n=38)等 。
1.2　染色体制片
染色体制片按 Song 和 Gustafson[ 13] 的方法 。
当生长旺盛的供试材料根长 2 ～ 3cm 时 ,取 2mm 长
的根尖放入饱和α-溴萘溶液 25℃处理 2 ～ 4h ,去
离子水充分洗净后用新鲜甲醇和冰乙酸混合液(3∶
1)固定 3 ～ 24h ,水洗后置 2%纤维素酶(Sigma)和
2%果胶酶(SERVA)溶液中 , 28℃条件下酶解约
1.5h 。水洗并固定后采用火焰干燥法制片 , -20℃保
存备用。
1.3　基因组 DNA 的提取及标记
采用 CTAB 法提取白菜型油菜和黑芥的基因
组总 DNA。用生物素-11-dUTP(Sigma)标记白
菜型油菜和黑芥的基因组总 DNA 作为探针 , 所有
探针都用切刻平移法标记。50μl标记反应液中含
dATP 、dGTP 、dCTP 和 biot in-11 -dUTP 、DNase
Ⅰ 、DNA聚合酶 Ⅰ(华美公司)和 0.5μg 探针 DNA 。
15℃反应 4 ～ 5h后加 5μl 0.2mol/ L EDTA(pH8.0)
终止反应。标记探针用 Sepharose CL-6B(Sigma)
纯化 ,标记效率用链亲和素辣根过氧化物酶(BRL ,
Life Technologies)点印渍检测 。
1.4　原位杂交
染色体原位杂交按 Song 和 Gustafson[ 14]的方
法。每张制片大约需50μl杂交液 ,含有 50%去离子
甲酰胺(Sigma)和 10%硫酸葡聚糖(Sigma), 2 ×
SSC , 50 ～ 100ng/μl 鲑鱼精 DNA , 20 ～ 40ng 探针
DNA 。杂交混合液在沸水中煮 10min 后迅速置于
冰上放置 10min以上 ,然后将杂交混合液加到制片
上 ,盖上 24mm ×50mm 的盖破片 , 80℃共变性
4min ,于保湿盒中 37℃杂交 20 ～ 48h 。杂交后用
20%甲酰胺 、2×SSC 、0.1×SSC 于 42℃下分别洗脱
15min ,室温下0.1%Triton X-100漂洗 5min;PBS
漂洗 2次 ,每次 5min。
1.5　原位杂交信号的荧光检测及图象分析
染色体原位杂交的检测及洗脱按 Song 和
Gustafson[ 14]的方法 。每张玻片加 50μl st reptavidin
-Cy3(Sigma)于 37℃下温育 30 ～ 60min ,PBS漂洗
3次(每次 5min)后即可用 0.5μg/ml DAPI (4 , 6-
diamidino-2-phenylindole)复染染色体 , Olympus
BX60显微镜观察荧光原位杂交信号 , Photometrics
SenSys CCD(charge coupled device)1400E照相装置
俘获图象 ,V++ Precision Digital Imaging System 和
Photoshop软件进行图象叠加和处理。
2　结果与分析
以白菜型油菜 B .rapa(AA , 2n=20)基因组总
DNA作探针 ,与芥菜型油菜 B .juncea(AABB ,2n=
36)根尖细胞染色体基因组原位杂交 ,结果可清晰地
看到有 20条染色体上有杂交信号 ,染色体着丝粒部
分的信号特别大而明显 ,而在其它位置上的信号较
弱(图 1a);间期核中也可看到 20 个明显的信号点
(图 1b)。
以黑芥 B .nigra(BB ,2n=16)的基因组总DNA
为探针 ,与埃塞俄比亚芥 B.carinata(BBCC , 2n=
34)的根尖细胞染色体进行基因组原位杂交 ,结果所
有染色体上均有信号 ,但有 16条染色体上有强烈的
杂交信号 ,其它染色体的信号较弱 ,另外有一些小的
信号点 ,可能是 rDNA 等重复序列的杂交结果(图
2a);间期核的基因组原位杂交也可看出有 16个大
而明显的信号 ,同样也有一些小的信号(图 2b)。
用白菜型油菜 B .rapa(AA , 2n=20)的基因组
总 DNA为探针 ,与甘蓝型油菜 B.napus(AACC ,2n
=38)根尖细胞染色体进行基因组原位杂交 ,结果所
有染色体上都有杂交信号 ,不能区分 AA 和 CC 染
色体组(图 3a);间期核基因组原位杂交有 38个明
显的杂交信号(图 3b)。
3　讨论
本实验 GISH 结果表明 ,芸薹属中异源多倍体
B.juncea 的 A与 B基因组和 B.carinata的 B与 C
基因组可以通过 GISH 方法区分 ,但 B .napus 的 A
与 C基因组难以用这一方法区分 ,说明 B与A 、C基
因组间的差异大于 A 与 C 间的差异。这与前人利
用其他研究方法所得到的结论是一致的[ 4～ 5 ,15] 。
Axelsson等[ 15]建立了 2个 RFLP 连锁图 ,分析发现
芥菜型油菜基因组的 AA和 BB基因组与祖先种的
AA 、BB基因组十分接近 ,说明芥菜型油菜的基因组
在多倍体形成中仍然保留了潜在的不变化性。发现
芥菜型油菜的减数分裂过程中 A 和 B基因组染色
体同源配对现象很少 ,AB杂种中只有部分配对或只
有较低的染色体联系(association)。复合种 AACC
11李宗芸等:基因组原位杂交辨别芸薹属异源四倍体AA 、BB 、CC基因组研究
芸薹属基因组原位杂交结果
图 1　白菜型油菜基因组总 DNA 为探针与芥菜型油菜根尖细胞染色体(1a)和间期核(1b)的基因组原位杂交结果(2300×)
图 2　黑芥基因组总 DNA 为探针与埃塞俄比亚芥根尖细胞染色体(2a)及间期核(2b)的基因组原位杂交结果(2300×)
图 3　白菜型油菜基因组总 DNA 为探针与甘蓝型油菜根尖细胞染色体(3a)和间期核(3b)基因组原位杂交结果(2300×)
Genomic in situ hybridization in Brassica allotetraploid species
Fig.1　　GISH of B.juncea with genomic DNA probe of B.rapa , root tip cell on metaphase(1a)and interphase(1b)
(2300×)
Fig.2　　GISH of B.carinata with genomic DNA probe of B.nigra , root tip cell on metaphase(2a)and interphase(2b)
(2300×)
Fig.3　　GISH of B.napus with genomic DNA probe of B.rapa , root tip cell on metaphase(3a)and interphase(3b)
(2300×)
12 中国油料作物学报　2002 ,24(1)
的A 和C 基因组间分子标记遗传性的研究表明 ,它
们的同源染色体间存在着较高的配对现象;进一步
研究表明 ,B基因组中没有抑制同源配对的遗传因
素 ,说明在进化过程中 B 基因组染色体的结构发生
了变化 。A 、B 、C 基因组的比较作图也表明 ,B 基因
组与 A 、C 基因组相比分化较大 ,而 A 、C 间分化较
小。虽然A 、C 基因组难以用基因组原位杂交的方
法区分 ,但是 ,由染色体和间期核的基因组原位杂交
信号可看出信号点的大小差异 ,似乎可以分为大小
2种类型 ,产生这一结果的原因尚不清楚 。是否由
于白菜型油菜 B .rapa(AA ,2n=20)的基因组与甘
蓝型油菜 B .napus(AACC ,2n=38)的 A基因组具
有更高的同源性 ,从而形成了较大的信号点 ,而白菜
型油菜 B .rapa(AA , 2n=20)的基因组与甘蓝型油
菜 B .napus(AACC ,2n=38)的 C 基因组的同源性
与前者相比稍低 ,因而出现了较小的信号点 ,值得进
一步研究 。
另外 ,我们在芸薹属 GISH 研究中发现 ,杂交信
号多集中在着丝粒区域 ,染色体臂上信号很弱或很
少出现 ,这一现象在前人的研究中也有描述 ,Snow-
don等[ 16]推测可能是由于着丝粒区域重复序列高
度集中而容易杂交;Benabdelmouna 等[ 12]在谷子的
GISH 中发现亚着丝粒区域存在着较强的杂交信
号 ,认为与富含低或单拷贝序列的末端区域相比 ,亚
着丝粒区域可能存在着重复序列的集中分布 。近年
来 ,比较基因组学的研究表明 ,近缘物种间功能基因
具有很高的同源性 ,在 GISH 分析中这部分序列容
易被封阻 ,杂交信号主要由基因组或物种相对特异
的重复序列产生 ,本实验结果也表明了这一点 。
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13李宗芸等:基因组原位杂交辨别芸薹属异源四倍体AA 、BB 、CC基因组研究
Genomic in situ hybridization (GISH)discriminates the A , B
and C genomes in Brassica allotetraploid species
LI Zong-yun1 , LI M ao-teng2 , HUANG Rong-gui2 , WU Xiao-ming3 , SONG Yun-chun1
(1.Key Laboratory of MOE for Plant Developmental B iology , Wuhan University , Wuhan 430072 , China;
2.National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement , Huazhong Agricultural University ,
Wuhan 430070 , China ;3.Oil Crops Research Insti tute of CAAS , Wuhan 430062 , China)
Abstract:Genomic in situ hybridization (G ISH)was used to discriminate between the A and the B
genomes in allotetraploid B .juncea species , the B and C genomes in B .carinata .The labeled total DNA of B.
rapa was hybridized to the metaphase chromosomes and interphase of B .juncea and B .napus.20 large ,
strong signals w ere detected in B .juncea , 38 in B .napus.The A and B genome chromosomes w ere obviously
distinguished in B .juncea , but the A and C genomes w ere not discriminated in B .napus.Using the B .nigra
total DNA as probe , the 16 chromosomes showed strong signals and the other showed weak signals in B.cari-
nata.The results indicated that the B genome w as divergent f rom the A and C genomes and the A and C
genomes were relativety close.The hybridization signals w ere generally dist rlibuted on centromere other than the
arms of the chromosomes , the possible reason was discussed.
Key words:Genomic in situ hybridizat ion(GISH);Brassica;Allotetraploid;Genome divergent
14 中国油料作物学报　2002 ,24(1)