全 文 ：农业生物技术学报，2010年，第 18卷，第 6期，第 1189~1196页
Journal of Agricultural Biotechnology, 2010, Vol.18, No.6, 1189~1196
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.024
基金项目：本研究由国家自然科学基金（30771237）、国家高技术研究发展计划（863）（No.2006AA10Z110、No.2008AA10Z152和
No.2006AA10A113）、国家重点基础研究发展规划（973） 项目（No.2006CB101604） 和重庆市科技攻关项目（No.CSTC
2009AB1030）共同资助
收稿日期：2009-11-26 接受日期：2009-12-18
研究资源
Resources
pFGC5941的改造及芸薹属透明种皮 1基因(TT1)家族 RNA干扰载体构建
马丽娟 冯瑜 江丽萍 申敏 柴友荣 *
西南大学农学与生物科技学院，农业部生物技术与作物品质改良重点实验室，重庆市作物品质改良重点实验室，重庆市油菜工程技术研究
中心，重庆 400716
*通讯作者，chaiyourong1@163.com
摘 要 pFGC5941是使用较多的植物 RNA干扰载体，但其间隔区过长，间隔区与启动子间可用酶切位点
偏少。本研究采用基于甘蓝型油菜(Brassica napus) PAP2基因第 2内含子(BnPAP2I2)的新型间隔区取代了
pFGC5941的原有 PhChsA间隔区，并在新间隔区与启动子之间的多克隆位点处新增了一个 AatⅡ切点，改
进后的载体取名为 pFGC5941M。克隆了芸薹属透明种皮 1(TT1)基因家族 RNA干扰片段 BTT1Ⅰ，将其反义
片段和正义片段采用 NcoⅠ+AatⅡ和 BamHⅠ+XbaⅠ分别插入到 pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与
终止子之间，形成重组载体 pFGC5941M-BTT1Ⅰ(简称 pBTT1Ⅰ)，复合 PCR鉴定表明载体构建成功，转化根
癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404后获得工程菌株。pBTT1Ⅰ的构建有助于揭示芸薹属种皮发
育和种皮色素积累的机理和探索黄籽性状分子育种。
关键词 芸薹属，甘蓝型油菜，透明种皮 1 (TT1)，RNAi，载体
Modification of pFGC5941 and Construction of RNAi Vector of Brassica
Transparent Testa 1 Gene (TT1) Family
Ma Lijuan Feng Yu Jiang Liping Shen Min Chai Yourong*
Chongqing Rapeseed Technology Research Center; Chongqing Key Laboratory of Crop Quality Improvement; Key Laboratory of Biotechnology &
Crop Quality Improvement, Ministry of Agriculture; College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China
*Corresponding author, chaiyourong1@163.com
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.024
Abstract pFGC5941 is a widely used vector for RNA interference of plant genes, but its spacer is too long, and
the restriction sites between the promoter and the spacer are not enough. In this study, a novel spacer based on
the 2nd intron of Brassica napus PAP2 (BnPAP2I2) was used to substitute the original PhChsA spacer of
pFGC5941, and an AatⅡ site was introduced between the promoter and the spacer, yielding an improved vector
pFGC5941M. An RNAi fragment BTT1Ⅰ targeted to Brassica transparent testa 1 (TT1) gene family was cloned.
Its antisense and sense fragments were inserted to the promoter-spacer and spacer-terminator cloning sites using
NcoⅠ + AatⅡ and BamHⅠ + XbaⅠ double digestions, respectively. The resulted recombinant vector was
pFGC5941M-BTT1Ⅰ (simplified as pBTT1I), which was verified by multiple-PCR checking and successfully
transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 to form engineering strain. Construction of pBTT1Ⅰ will
promote the clarification of the mechanism of development and pigment deposition in the seed coat and
molecular breeding of yellow seed trait in Brassica.
Keywords Brassica, Brassica napus, Transparent testa 1 (TT1), RNA interference (RNAi), Vector
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Journal of Agricultural Biotechnology
甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是世界性油料作
物。与黑籽油菜相比，黄籽油菜的种皮薄，出油率高，
油和饼粕中的色素和木质素少 (刘后利 , 2000;
Rahman et al., 2001; Somers et al., 2001)。但是，天然
的甘蓝型油菜没有黄籽材料，甘蓝型油菜已有黄籽
性状是通过种间杂交而转育的，表型易随环境而变
化，影响世代间、地块间、株间甚至籽粒间的黄籽稳定
性和一致性。因此有必要克隆决定黄籽性状的相关基
因，阐明其机理，通过分子育种创造新型黄籽材料。
模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)等的研究
表明，种皮色素的主要成分是原花青素(proantho-
cyanidin, PA)的聚合物，即缩合单宁。PA通过类黄酮
-原花青素途径而合成，具有防护紫外线伤害、阻止
病原体侵染、抗氧化等生理功能。种子中的 PA在内
种皮中合成，单体和寡聚体是无色的，在种子成熟干
燥过程中则聚合成褐色的色素。拟南芥中，PA合成
与聚合的任意一步因突变而被阻碍后，种皮均会从
野生型的深褐色而变为透明种皮(transparent testa, tt)，
种籽呈黄色或浅褐色。拟南芥的主要 TT基因均已克
隆 ， 其 中 TT4、TT5、TT6、TT7、TT3、TT18、BAN 和
TT10 分别编码关键酶 CHS、CHI、F3H、F3H、DFR、
LDOX/ANS、ANR 和 LAC15，TT12、TT19 和 AHA10
分别编码 MATE、GST和 ATPase类型的 PA转运蛋
白，TT1、TT2、TT8、TT16、TTG1 和 TTG2 分别编码
C2H2-ZFP、R2R3-MYB、bHLH/Myc、MADS-box、WDR
和WRKY类型的转录因子调控蛋白(Debeaujon et al.,
2000; Winkel-Shirley, 2001)。TT1由 Sagasser等(2002)
利用玉米转座子标签(En-1)从拟南芥中分离得到，是
植物 PA积累的调控基因，在内种皮特异表达，调控
内种皮的细胞分化和 PA积累，tt1突变体的种皮薄，
细胞小，种皮色素不能积累，种子呈现黄色。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术介导靶
基因的转录后沉默，但效率比反义抑制更高。植物
RNAi的策略是构建可转录为 dsRNA的表达载体并
完成整合性转化，靶基因的沉默可遗传，是基因功能
鉴定和分子育种的有效手段(Travella et al., 2006;李
丽文等, 2007)。pFGC5941 (AY310901.1)是使用较多
的植物 RNA干扰载体，但存在间隔区(spacer)过长、
间隔区与启动子间可用酶切位点偏少等缺点。
采用 RACE技术，本课题组已经克隆了甘蓝型
油菜 TT1基因家族(BnTT1-1 和 BnTT1-2)、白菜 TT1
基因(BrTT1)和甘蓝 TT1 基因(BoTT1)的全长 cDNA
和基因组序列(待发表)。本研究针对 pFGC5941的缺
点对其进行了改造，构建了芸薹属 TT1基因家族的
RNAi载体，用于通过转基因性状变化来揭示芸薹属
内种皮发育和种皮色素积累的机理，探索创造转基
因黄籽油菜新材料的可能性。
1 结果与分析
1.1 间隔区的克隆
引物组合 FBnPAP2I2+RBnPAP2I2 扩增 5B 基
因组总 DNA后，电泳显示了一条与预期大小一致的
唯一亮带 (图 1)，胶回收、TA克隆、转化大肠杆菌
(Escherichia coli)DH5α后，2个菌液 PCR阳性(图略)
的单克隆的测序结果一致，均为 187 bp(图 1)，对应
区段与甘蓝型油菜 BnPAP2基因第 2内含子完全一
致。
1.2 植物表达载体 pFGC5941的改造
对含有 BnPAP2I2 的重组 pMD19-T 质粒进行
图 1 BnPAP2I2的 PCR扩增(A)和序列(B)
M：DNA marker DL2000 plus；1：扩增的 BnPAP2I2条带。人工添加的酶切位点用小写字母加下划线表示，大写斜体字母为
BnPAP2的第 2内含子，剪接边界为大写粗体字母，其中内含子边界 GT和 AG加框。
Figure 1 Amplification (A) and sequence (B) of BnPAP2I2
M：DNA marker DL2000 plus. 1：Amplified BnPAP2I2 band. Artificial restriction sites are in underlined lower case. The second intron
of BnPAP2 is in italic upper case. The splicing borders are in bold upper case, while the intron borders GT and AG are further boxed.
BA
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
M 1bp
1190
BamHⅠ+SwaⅠ完全双酶切，凝胶电泳表明获得了与
预期 182 bp一致的 BnPAP2I2片段(图 2A)，回收该
带。对 pFGC5941进行 BamHⅠ+SwaⅠ完全双酶切，
凝胶电泳表明切下了 1 366 bp的矮牵牛查尔酮合酶
基因 A (PhChsA) 内含子间隔区，回收 10 kb 的
pFGC5941 骨 架 ( 图 2B)。 pFGC5941 骨 架 与
BnPAP2I2 的连接产物 pFGC5941M 转化 DH5α，采
用 引 物 组 合 FBnPAP2I2+RBnPAP2I2 和
F35S3N+RBnPAP2I2 对抗 Kan 的单克隆菌液进行
PCR鉴定，结果与预期相符(图略)。选取 1个阳性克
隆子扩大培养后抽提质粒，用 BamHⅠ+EcoRⅠ进行
双酶切，产生了与预期的 1 625和 8 604 bp一致的 2
条带 (图 2C)，进一步说明 BnPAP2I2已定向克隆到
pFGC5941 中，替换了 PhChsA 间隔区，形成了新的
干扰载体 pFGC5941M。pFGC5941M 全长 10 221
bp，比 pFGC5941 (11 405 bp)略短，其间隔区内含子
(163 bp)比 pFGC5941的(1 349 bp)大大缩短，而且在
启动子与间隔区之间增加了一个 AatⅡ切点。
1.3 干扰片段 BTT1Ⅰ的克隆
5B总 cDNA模板经引物组合 FBTT1Ⅰ+RBTT1
Ⅰ扩增后，电泳显示了一条略大于 400 bp的特异条
带(图 3)。回收该片段，与 pMD19-T连接，转化 DH5α
感受态细胞，送 2个 PCR阳性单克隆测序后均为
432 bp，序列一致，对应区段与 BnTT1-1基因的 5相
应区段完全一致(图3)。
1.4 芸薹属 TT1基因家族 RNAi载体的构建和检测
NcoⅠ+AatⅡ完全双酶切 pMD19-T-BTT1Ⅰ后，
凝胶电泳显示了与预期一致的 T- 载体条带和 418
bp反义片段目的条带，但另有一条约 500 bp的杂带
(图 4A)。回收目的条带，记为 BTT1ⅠA。NcoⅠ+AatⅡ
完全双酶切 pFGC5941M后，电泳显示开环成功(图
4B)，回收该载体骨架。pFGC5941M骨架与 BTT1ⅠA
连接产生的重组质粒 pFGC5941M-BTT1ⅠA 转化
图 2 BamHⅠ+SwaⅠ双酶切 pMD19-T-BnPAP2I2 (A)和 pFGC5941 (B)，BamHⅠ+EcoRⅠ双酶切 pFGC5941M (C)
M：DNA marker；CK：酶切前的质粒；1：酶切结果
Figure 2 BamHⅠ+SwaⅠ double digestion of pMD19-T-BnPAP2I2 (A) and pFGC5941 (B), and BamHⅠ+EcoRⅠ double digestion of
pFGC5941M (C)
M: DNA marker; CK: Plasmid before digestion; 1: Digestion result.
图 3 BTT1Ⅰ的扩增(A)和序列(B)
M：DNA marker DL2000 plus；1：扩增的 BTT1Ⅰ条带
Figure 3 Amplification (A) and sequence (B) of BTT1Ⅰ
M: DNA marker DL2000 plus; 1: Amplified BTT1Ⅰ band
pFGC5941的改造及芸薹属透明种皮 1基因(TT1)家族RNA干扰载体构建
Modification of pFGC5941 and Construction of RNAi Vector of Brassica Transparent Testa 1 Gene(TT1) Family
5000
3000
2000
M CK 1bp
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750
500
250
100
A
1000
750
500
250
100
2000
3000
4361
6557
9416
23130
bp M CK 1
B
M CK 1
1000
750
500
250
100
2000
3000
4361
9416
23130
bp
C
B
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
bp M 1
A
1191
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
DH5α，涂 Kan平板，挑取克隆子进行液体培养，采用
引物组合 F35S3N+FBTT1Ⅰ和 RBnPAP2I2+RBTT1Ⅰ
作 PCR鉴定，分别扩增出了与理论值 536 bp和 599
bp相吻合的条带(图 4C)，意味着 BTT1ⅠA片段已反
义插入到启动子之后、间隔区之前，得到了中间载体
pFGC5941M-BTT1ⅠA。
凝胶电泳表明，pMD19-T-TT1Ⅰ质粒经 BamHⅠ
+XbaⅠ完全双酶切后产生了与预期 430 bp 一致的
正义片段 BTT1ⅠS (图 4D)，pFGC5941M-BTT1ⅠA
质粒经 BamHⅠ+XbaⅠ完全双酶切开环成功 (图
4E)。 回 收 二 者 ， 连 接 后 得 到 RNAi 载 体
pFGC5941M-BTT1ⅠA，转化 DH5α感受态细胞，涂
Kan平板并挑单菌落进行液体培养。对克隆子菌液
用引物组合 FBnPAP2I2 +RBTT1Ⅰ及 ROCST5N+
FBTT1Ⅰ分别作 PCR鉴定，电泳分别显示了与预期
613 bp和 551 bp吻合的条带(图 4F)，证明 BTT1ⅠS
片段已正义插入到间隔区之后、终止子之前。最后，
用引物组合 F35S3N+RBnPAP2I2 及 FBnPAP2I2+
ROCST5N对单克隆菌液进行 PCR鉴定，电泳分别
显示了与预期 703 bp和 732 bp吻合的条带(图 4G)。
综合结果认为，BnTT1ⅠA片段和 BnTT1ⅠS片段均
按正确方向插入到平台载体的相应位置，成功构建
了 RNAi 载体 pFGC5941M-BTT1Ⅰ (简称 pBTT1I)
(图 5)。
1.5芸薹属 TT1基因家族RNAi载体转化根癌农杆菌
取1.4中鉴定无误、含有芸薹属 TT1基因家族
RNAi载体 pBTT1Ⅰ的 DH5α单斑进行培养，抽提质
图 4 构建 pFGC5941M-BTT1Ⅰ的酶切和 PCR鉴定结果
A：NcoⅠ +AatⅡ双酶切 pMD19-T-BTT1Ⅰ；M：DNA marker DL2000 plus；B：NcoⅠ +AatⅡ双酶切 pFGC5941M；M：DNA
marker DL2000 plus 与 λ-HindⅢ的混合物；C：pFGC5941M-BTT1ⅠA 的克隆子菌液 PCR 检测；M：同 A；1~4：引物组合
F35S3N+FBTT1Ⅰ检测；5~8:引物组合 RBnPAP2I2+RBTT1Ⅰ检测。D：BamHⅠ+XbaⅠ双酶切 pMD19-T-BTT1Ⅰ；M：同 A；E：
BamHⅠ+XbaⅠ双酶切 pFGC5941M-BTT1ⅠA；M：同 B；F和 G：pFGC5941M-BTT1Ⅰ的克隆子菌液 PCR检测；M：同 A；F的
1~3: 引物组合 FBnPAP2I2+RBTT1Ⅰ 检测；F 的 4~6: 引物组合 ROCST5N+FBTT1Ⅰ 检测；G 的 1 ~3：引物组合
F35S3N+RBnPAP2I2检测；G的 4~6:引物组合 FBnPAP2I2+ROCST5N鉴定。
Figure 4 Endonuclease digestions and PCR checking in pFGC5941M-BTT1Ⅰ construction
A: pMD19-T-BTT1Ⅰ double-digested with NcoⅠ +AatⅡ ; M: DNA marker DL2000 Plus; B: NcoⅠ +AatⅡ double digestion of
pFGC5941M; M: A mixture of DNA markers DL2000 plus and λ-HindⅢ ; C: PCR checking of pFGC5941M-BTT1Ⅰ A colony
culture; M: the same as in A; 1~4: checked by primer pair F35S3N+FBTT1Ⅰ , 5~8: Checked by primer pair RBnPAP2I2+RBTT1Ⅰ .
D: BamHⅠ +XbaⅠ double digestion of pMD19-T-BTT1Ⅰ ; M: The same as in A; E: BamHⅠ +XbaⅠ double digestion of
pFGC5941M-BTT1ⅠA; M: The same as in B; F and G: PCR checking of pFGC5941M-BTT1Ⅰ colony culture; M: The same as in A;
1~3 of F: Checked by primer pair FBnPAP2I2+RBTT1Ⅰ , 4~6 of F: Checked by primer pair ROCST5N+FBTT1I; 1~3 of G: Checked
by primer pair F35S3N+RBnPAP2I2; 4~6 of G: Checked by primer pair FBnPAP2I2+ROCST5N.
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M CK 1bp
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500
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1000
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500
250
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6557
9416
23130
bp M CK 1
5000
3000
2000
M CK 1bp
1000
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100
2000
3000
4361
6557
9416
23130
bp M CK 1 1 2 3 4 5 6M 1 2 3 4 5 6M
1 2 3 4 5 6M 7 8
A
D
B
E F
C
G
1192
粒，转化根癌农杆菌 LBA4404，抗 Kan、Str和 Rif的
菌落进行与 1.4相同的多种 PCR鉴定，结果与 1.4
一致，表明 pBTT1Ⅰ已成功转入 LBA4404，冷冻保
存为植物转基因的工程菌株。
2 讨论
2.1 pFGC5941M的改进之处
pFGC5941是使用较多的植物 RNAi载体，其特
点是 T-DNA区段较小 (5 151 bp)，几乎不含重复序
列，使用 BAR作为标记基因的筛选效率较高。其缺
点是缺乏报告基因，转基因过程中不能进行 GUS染
色或 GFP荧光检测；另外其间隔区过大，间隔区与启
动子间可用的酶切位点偏少，干扰载体构建时在该
处的片段插入欠方便。pFGC5941的 BAR编码区等
处具有多种常见酶切位点，要把其它载体的 GUS或
GFP 表达盒亚克隆到 pFGC5941 并不容易，不过
BAR基因筛选的高效性在一定程度上可弥补缺乏报
告基因的不足。
RNA干扰载体构建中，由反义和正义片段形成
臂 /茎时，间隔区本身的序列特征会影响沉默效率，
若将由间隔区形成的环设计为可高效剪接的内含
子，尤其是采用合适的间隔区序列以提高双链 RNA
被 Dicer类复合物的加工效率，是提高 RNAi效率的
关键，但在 98~853 bp甚至 100~1800 bp范围内臂长
与干扰效率的相关性不大，均能引起强烈的干扰效
应(Wesley et al., 2001; Hirai et al., 2007)。另一方面，
马铃薯 GBSSI基因的研究表明，臂长 500~600 bp、间
隔区长 150 bp左右时介导的沉默效率较高，而臂长
1.1 kb或 1.3 kb、间隔区长 1.3 kb或 1.1 kb的大茎环
结构介导的沉默效率反而降低 (Heilersig et al.,
2006)。由此看来，在允许的长度范围内间隔区以短
者为宜，而且要能被高效剪接并使茎能被 Dicer类复
合物高效加工。
pFGC5941 的间隔区基于矮牵牛 PhChsA 的内
含子而设计，净内含子长为 1349 bp。过长的间隔区
会增加干扰载体构建过程中的 PCR检测灵敏度，其
上的 HindⅢ、PmlⅠ等酶切位点妨碍了在载体的其它
位置使用这些切点，在基因表达中增加浪费，形成臂
的速度和效率也可能比短间隔区的低，可能会降低
沉默效率。鉴于此，本研究采用基于甘蓝型油菜
BnPAP2基因 2号内含子的间隔区替换了 pFGC5941
的原有间隔区，净内含子长度仅为 163 bp，减少了
1186 bp，而且其上没有常见酶切位点，使 OCS Poly
A之后的 HindⅢ成为唯一切点，用它与其它切点组
合后可以从载体上方便地切下一些真核表达元件或
表达盒。本课题组在克隆甘蓝型油菜、白菜、甘蓝这 3
个物种的 PAP基因家族的总共 12个基因成员时发
现，在每次 cDNA克隆测序中它们的第 2内含子均
是完全且正确剪接的 (尽管它们的第 1内含子存在
可变性剪接的现象)。本研究采用的 BnPAP2I2间隔
区包含了完整内含子和其与两侧外显子交界的必要
边界序列。因此理论上预测，pFGC5941M中的间隔
区作为内含子能被高效剪接，目标基因干扰片段形
成的双链 RNA能被 Dicer类复合物高效加工，能够
介导目标基因的高效沉默。
在 pFGC5941的间隔区与启动子之间只有 3个
切点，其中 AscⅠ较贵和较难购买，它识别八碱基且
全为 G+C (GG↓CGCGCC)，添加到 PCR 引物上后
会大大增加 Tm值；SwaⅠ识别八碱基且为钝末端酶
(ATTT↓AAAT)，影响连接效率。pFGC5941M在间
隔区与启动子之间添加了一个 AatⅡ切点，它是一个
六碱基粘性末端酶，用它与 NcoⅠ组合，使此处干扰
片段的插入更方便和更有效。pFGC5941M可广泛向
同行发放，也可供同行参考进行类似改造。
2.2 pFGC5941M-BTT1Ⅰ的沉默效率和用途的预测
基因家族现象在植物中较为普遍，采用恰当的
载体构建策略，RNAi既可对单个成员进行沉默，也
可用于对整个基因家族进行沉默，因此是多倍体植
物基因功能研究和分子育种的有效手段 (Ishihara et
al., 2005; Miki et al., 2005; Travella et al., 2006)。马铃
薯 GBSSI基因的研究还表明，反向重复的序列本身
及长度均影响基因沉默效率，采用基因的 5序列比
采用基因的 3 序列构建的发夹结构具有高得多的
图 5 pFGC5941M-BTT1Ⅰ的示意图
Figure 5 Chart of pFGC5941M-BTT1Ⅰ
pFGC5941的改造及芸薹属透明种皮 1基因(TT1)家族RNA干扰载体构建
Modification of pFGC5941 and Construction of RNAi Vector of Brassica Transparent Testa 1 Gene(TT1) Family 1193
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沉默效率(87%/48%)(Heilersig et al., 2006)。本课题
组的 RACE克隆和 Southern杂交表明，甘蓝型油菜
只有 2条 TT1基因(BnTT1-1和 BnTT1-2)，其亲本物
种白菜和甘蓝中均只有 1 条 TT1 基因 (分别为
BrTT1 和 BoTT1)， 且 BnTT1-1 来 源 于 BoTT1，
BnTT1-2 来源于 BrTT1，BnTT1-1 与 BoTT1、BnTT1-2
与 BrTT1之间序列几乎一致，全长 mRNA一致性分
别为 99.6%和 99.1%。而且，BnTT1-1与 BnTT1-2之
间、BrTT1与 BoTT1之间也具有极高的同源性，全长
mRNA 水平的一致性分别达到 97.8%和 98.0%。
BTT1Ⅰ片段对应于 BnTT1-1 mRNA的 7~415 bp，该
区间避开了基因中部和后部的 WIP锌指蛋白的高
度保守区，而且该区间与 BnTT1-2、BrTT1和 BoTT1
分别只相差 15、13和 4 bp。因此，虽然 TT1是调控
基因且甘蓝型油菜又是多倍体，但芸薹属 TT1基因
拷贝数少且相对保守，本研究采用芸薹属 TT1基因
家族 5区段 (不含WIP锌指蛋白的高度保守区)构
建 RNAi载体，不会引起 TT1以外的其它基因的非
靶向沉默，但转化芸薹属后可高效沉默 TT1基因(家
族)的表达。
类黄酮物质的合成由复杂的调控基因网络协同
激活结构基因的表达，TT1与其他调控基因共同调
节类黄酮结构基因的表达和色素在细胞中的沉积
(Sagasser et al., 2002)。本研究构建了芸薹属 TT1基
因家族的 RNAi载体，有助于研究 TT1在芸薹属植
物种皮发育和色素积累中的作用，促进探索沉默
TT1基因创造转基因黄籽油菜新材料的可能性。
2.3 使用 pFGC5941M的 AatⅡ切点时的注意事项
本研究在 pFGC5941M 中引入的 AatⅡ切点方
便了干扰片段在启动子与间隔区之间的插入，但存
在注意事项。在 pMD19-T载体的M13F一侧、离 TA
克隆位点 500 bp处存在一个 AatⅡ切点，所以当采
用含有 AatⅡ的双酶切方案(如 NcoⅠ+AatⅡ)从重组
pMD19-T载体上切下目标基因片段时，会伴随产生
一个 500 bp的非特异片段，这就是图 4A中 418 bp
目标片段以外存在一个分子量稍大一点的非特异片
段的原因。这种现象在从 pMD18-T和类似载体上切
下目标基因片段时也会发生，会妨碍胶回收时对目
标片段的判断和切胶，所以操作中要严格区分目的
条带和杂带。但从 pGEM-T系列的载体上切下目标
基因片段时则不存在这种现象，因为其 AatⅡ位于多
克隆位点之中，采用 AatⅡ与其它酶进行双酶切，切
下目的基因片段的同时，产生的 44 bp杂质片段不妨
碍电泳检测和切胶。
3 材料与方法
3.1 材料
植物材料：黑籽甘蓝型油菜(Brassica napus)保持
系 5B 的基因组总 DNA，5B 生殖器官(蕾，花，花后
10、20、30 d的种子)的混合总 cDNA，均由本课题组
提供。
菌株和质粒：大肠杆菌 (Escherichia coli) 菌株
DH5α、含 pFGC5941 的 DH5α 菌株(购自国际拟南
芥生物资源中心 )、根癌农杆菌 (Agrobacterium
tumefaciens)菌株 LBA4404。
试剂：限制性内切酶为立陶宛MBI Fermentas公
司产品。引物在英维捷基(上海)公司合成。卡那霉素
(Kan)、利福平(Rif)、链霉素(Str)、氨苄青霉素(Amp)、
T4 DNA 连接酶等试剂为上海生工产品。琼脂糖、
DNA marker DL2000 Plus、Easy-Taq DNA 聚合酶和
buffer、dNTPs 等购自北京全式金公司。λ-HindⅢ
DNA marker、pMD19-T 载体、DNA Ligation Kit Ver.
2.0为宝生物工程(大连)公司产品。Biospin胶回收和
质粒小量提取试剂盒为杭州博日公司产品。
3.2 BnPAP2基因第 2内含子(BnPAP2I2)的克隆
对本课题组已克隆的甘蓝型油菜 PAP基因家族
(BnPAP)各成员序列(待发表)进行多重比对，设计了
引物：
正向引物 FBnPAP2I2：
(ATTTAAATGACGTCAGG TTTACATTCAAGACACA)
SwaⅠ AatⅡ
反向引物 RBnPAP2I2：
(GGATCCACCTAAGCATG CATTTGAAAA)
BamHⅠ
以 5B 基因组总 DNA 为模板，用于扩增
BnPAP2基因第 2内含子 BnPAP2I2。反应在 50 μL
标准 Taq PCR体系中进行：10× PCR Buffer 5 μL，25
mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，10
μmol/L正反向引物各 1 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合
酶 0.5 μL，350 ng/μL模板 DNA 1 μL，用 ddH2O补
足至 50 μL(以后的 Taq PCR体系除替换引物和模板
外，其余成分和浓度与此相同)。PCR扩增条件为：
94℃ 4 min；94℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃ 1 min，30
个循环；72℃ 10 min。经 1%琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物，在紫外观测仪中切下目的条带进行胶回
收，与 pMD19-T连接重组成 pMD19-T-Bn PAP2I2，
1194
转 化 DH5α (CaCl2 法 )， 抗 Amp (100 mg/L)、
IPTG/X-gal 筛选显白色的菌落 (Sambrook and
Russell, 2002)进行菌液 PCR 鉴定(预变性 5 min，35
个循环，其余同上)，阳性单克隆由英维捷基(上海)公
司采用M13F引物测序。
3.3 植物表达载体 pFGC5941 的改造(pFGC5941M
的构建)
经测序，含有正确序列的 pMD19-T-BnPAP2I2
的 DH5α单克隆经液体培养至对数晚期，提取质粒。
含有 pFGC5941的 DH5α采用 LB+Kan (100 mg/L，
下同)培养至对数晚期，提取质粒。两种质粒均采用
BamHⅠ+ SwaⅠ双酶切，50 μL体系含质粒 20 μg、
BamHⅠ和 SwaⅠ各 10 U、1× Tango－Y+ buffer，37℃
水浴 4 h以上。酶切完全后电泳，分别回收 BnPAP2I2
片段和 pFGC5941骨架，二者进行 10 μL标准体系
连接，形成重组质粒 pFGC5941M，转化 DH5α 感受
态，挑取抗 Kan的单克隆菌落培养。根据载体上的
CaMV35S启动子序列设计了位于其 3端的正向引
物 F35S3N (GGAAGTTCATTTCATTTGGAGAG)，
采用引物组合 FBnPAP2I2+RBnPAP2I2 和 F35S3N
+RBnPAP2I2进行菌液 PCR检测，同时提取质粒进
行 BamHⅠ+EcoRⅠ双酶切检测。
3.4 芸薹属 TT1基因家族干扰片段的扩增
在对甘蓝型油菜 TT1 基因家族 (BnTT1-1 和
BnTT1-2)、白菜 TT1基因 (BrTT1) 和甘蓝 TT1基因
(BoTT1) 的全长 cDNA和基因组序列进行多重比对
的基础上，设计引物：
正向引物FBTT1Ⅰ：
(GGATCCGACGTCGAGATCTATAAACAAACATTCCC)
BamHⅠ AatⅡ
反向引物RBTT1Ⅰ：
(TCTAGACCATGGTATGCCTTGCCGGAAACTTCAT)
XbaⅠ NcoⅠ
以 5B总 cDNA为模板，用于扩增芸薹属 TT1
基因家族干扰片段 BTT1Ⅰ。标准 50 μLTaq PCR体
系，以 58℃退火，30个扩增循环，其余参数同 3.2。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带
并与 pMD19-T连接形成 pMD19-T- BTT1Ⅰ，转化
DH5α感受态细胞，菌落液体培养物采用 PCR鉴定，
阳性克隆子送样进行M13F引物的测序。
3.5 芸薹属 TT1基因家族 RNAi载体的构建
分别抽提质粒 pMD19-T-BTT1Ⅰ和 pFGC5941M，
采用 NcoⅠ+AatⅡ对它们分别进行完全双酶切，琼脂
糖凝胶电泳后，分别切胶回收反义片段 BTT1ⅠA和
开环后的 pFGC5941M骨架；将二者进行 16℃常规
连接，重组载体 pFGC5941M-BTT1ⅠA转化 DH5α
感受态细胞，涂 Kan平板，并挑斑进行液体培养。采
用 引 物 组 合 F35S3N+FBTT1 Ⅰ 和 RBnPAP2I2+
RBTT1Ⅰ分别对单克隆进行 50 μL Taq PCR标准体
系的鉴定，预变性增加到 5 min，循环数增加到 35，均
58℃退火，其余参数同 3.2，提取 PCR阳性单克隆的
质粒。采用 BamHⅠ +XbaⅠ分别完全双酶切
pMD19-T-BTT1Ⅰ和 pFGC5941M-BTT1ⅠA质粒，电
泳 后 分 别 回 收 正 义 片 段 BTT1 Ⅰ S 和 线 状
pFGC5941M-BTT1ⅠA骨架，二者连接后得到重组质
粒 pFGC5941M-BTT1Ⅰ，转化 DH5α，挑取抗 Kan的
单克隆菌落培养。根据载体上的 OCS终止子序列设
计了位于其 5端的反向引物 ROCST5N (GCTCAGG
TTTTTTACAACGTGCAC)， 采 用 引 物 组 合
FBnPAP2I2+RBTT1I，ROCST5N+FBTT1I，F35S3N+
RBnPAP2I2 和 FBnPAP2I2+ROCST5N 对克隆子菌
液进行复合 PCR检测，标准 50 μL Taq PCR体系，
预变性为 5 min，循环数为 35，均采用 58℃退火，其
余参数同 3.2，阳性克隆子含有芸薹属 TT1基因家族
的 RNAi载体。
3.6芸薹属 TT1基因家族RNAi载体转化根癌农杆菌
取 3.5最终获得的大肠杆菌阳性单克隆进行液
体培养，抽提质粒 pFGC5941M-BTT1Ⅰ，采用液氮冷
激法转化用氯化钙法制备的根癌农杆菌 LBA4404
感受态细胞(柴友荣 , 2003)，抗 Kan (100 mg/L)、Rif
(40 mg/L)和 Str (20 mg/L)的单克隆菌液进行 PCR鉴
定(同 3.5)，保存阳性单克隆作为工程菌株。
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