全 文 ：2004年 9月 内蒙古大学学报 (自然科学版 ) Sep. 2004第 35卷第 5期 Acta Scientiarum Naturalium Univ ersi tati s NeiM ongol Vol. 35 No. 5
　　文章编号: 1000- 1638( 2004) 05-0550-07
内蒙古蒿属沙生地理替代种的
IT S序列的比较分析
王铁娟 1, 2 ,杨　持 1 ,尹　俊 3
( 1. 内蒙古大学生态与环境科学系 ,呼和浩特 010021;
2.内蒙古师范大学生命科学与技术学院 ,呼和浩特 010022;
3.内蒙古农业大学生物工程学院 ,呼和浩特 010018)
摘要: 对内蒙古蒿属 6个沙生地理替代种以及同属龙蒿组的龙蒿 (A . dracunculus)和猪毛蒿 (
A . scoparia)的 ITS序列进行分析 ,以大籽蒿 (A . sieversiana )作为外类群 .结果表明 ,这 6个替
代种以及猪毛蒿的 ITS序列有着高度的一致性: ITS1序列为 251bp, GC含量为 53. 78%或
54. 18% ,只有 2个变异位点 . ITS2序列为 218～ 221bp, GC含量为 56. 42% ～ 58. 26% ,有 16
个变异位点 .种间同源性高达 98. 5% ～ 99. 7% ,与龙蒿的同源性为 91. 3% ～ 92. 1% ,与外类群
为 88. 5% ～ 89. 4% .反映出 ITS序列在替代种间高度保守 .
关键词: 蒿属 ; 地理替代种 ; ITS
中图分类号: Q941+ . 2　　文献标识码: A
　　分布在内蒙古草原区沙地和荒漠地区的蒿属半灌木种类 ,根系粗大、木质、深长 ,耐旱 ,茎、枝抗风
沙压埋 ,萌蘖能力强 ,均为沙地植被的建群种或优势种 ,是内蒙古乃至中国北部防风固沙的重要植物 .
差不嘎蒿 ( A. halodendron Turcz. ex Bess. )、褐沙蒿 ( A. intramongolica H. C. Fu)、油蒿 ( A. ordosica
Krasch. )、籽蒿 ( A. sphaerocephala Krasch. )、准噶尔沙蒿 ( A. songarica Sch renk. )、乌丹蒿 ( A. wu-
danica Liou et W. Wang )是同属于蒿属龙蒿组的半灌木蒿类 ,亲缘相近 ,形态特征十分相似 ,分布于
内蒙古及邻近省、区的草原区沙地和荒漠区〔1, 2〕 ,它们的分布区具有明显的区域性 ,在空间上相互替
代 ,构成了沙生地理替代分布系列〔3～ 5〕 .
近些年来 ,核糖体 DNA内转录间隔区 ( ITS)序列分析已广泛用于植物系统发育的研究 ,成为探
讨科内属间及属内种间关系十分有效的手段 .关系密切的物种间 I TS长度接近 ,而序列有一定的变
异 ,因此 ,该片段特别适合属、组级的系统发育和分类研究〔6～ 9〕 .虽然由于位点内、位点间的同步进化 ,
在许多物种内 ITS不存在位点多态性 ,但仍有不少报道发现 I TS序列存在种内多态性 ,既不同亚种、
居群的同一位点有 2或 2个以上的核苷酸类型 ,有些种内多态性还可用于种、亚种间关系的分析〔10〕 .
本文采取 PCR产物直接测序法 ,对这 6个地理替代种的 ITS序列进行分析 ,以大籽蒿 ( A. siever-
siana Ehrhart ex Willd)作为外类群 ,探讨这些近缘种的 ITS序列的变异程度 ,分析其亲缘关系 ,为进
一步利用该片段来探讨蒿属的分类与进化提供一些基础资料 .
1　材料和方法
1. 1　材料来源
收稿日期: 2003-11-18
基金项目: 国家重点基础研究发展规划 ( G2000048704) ; 内蒙古自治区自然科学基金资助项目
( 200308020509) ;农业部草地资源生态重点开放实验室资助项目 ( 203047)
作者简介: 王铁娟 ( 1969～ ) ,女 ,河北任丘人 ,讲师 ,博士 .
实验材料采自于内蒙古、陕西和宁夏的 12个地区 (表 1) ,采集植物嫩叶 ,装入 15× 20 cm带封口
的塑料袋中加变色硅胶使其快速干燥 ,带回实验室后 , - 20℃保存 .
1. 2　总 DNA的提取
①称取 0. 2 g经硅胶干燥后的植物样品至于研钵中 ,加入少许石英砂和 PV P干粉 ,在液氮中迅
速研磨成粉状 ,置于已灭菌的 7 ml离心管中 .②加 2 ml预热至 90℃的 CTAB提取液 [2% ( w /v )
CT AB, 1. 4M Nacl, 20 mM EDTA PH8. 0, 100 mM Tris-HCL PH8. 0, 2% (v /v )巯基乙醇 (使用前加
入 ) ] ,充分混合后在 65℃水浴下温浴 60～ 90 min,期间不断颠倒摇匀 ,使其抽提完全 .③加 2 ml氯仿
/异戊醇 ( 24∶ 1) , 5000 g离心 10 min,取上清液放入新的灭过菌的 7 m l试管中 .④加 0. 6倍体积的-
20℃异丙醇 ,颠倒摇匀 , 5000 g离心 5 min.⑤弃上清液 ,加 1 m l 65℃的 CTAB,颠倒摇匀 , 65℃水浴
30 min使沉淀溶解 .⑥加等体积氯仿 /异戊醇 ,再抽提一次 , 5000 g离心 10 min.⑦取上清液到 1. 5 ml
的 Eppendo rf管中 ,加 2 /3体积- 20℃的异丙醇 ,颠倒混匀 ,静置 5 min.⑧ 12000 rpm离心 5 min,弃
上清液 .⑨用 76%冷乙醇冲洗两次后风干 .10依据 DNA的量 ,加 100～ 300μL 0. 1TE缓冲液回溶 .
表 1　材料来源
Table 1　 The origin of materials
种 采样地 采集号 Co lletion No. o r Voucher
准噶尔沙蒿 A . songarica 内蒙古鄂济纳旗 赵天飙 额 - 05
白沙蒿 A . sphaerocephala
　
　
　
内蒙古乌海市
内蒙古阿拉善左旗
宁夏中卫县沙坡头
陕西榆林市
王铁娟 乌 - 02
赵天飙 阿 - 02
王铁娟 02- 003
王铁娟 榆 - 03
油蒿 A .ordosica
　
　
　
内蒙古达拉特旗
内蒙古鄂托克旗
宁夏中卫县沙坡头
陕西榆林
智颖飙 7102
王铁娟 鄂 - 04
王铁娟 001
王铁娟 榆 - 01
褐沙蒿 A . intramongolica
　
内蒙古镶黄旗
内蒙古锡林浩特市
马春明 05
王铁娟 锡 - 018
差不嘎蒿 A . halodendron
　
内蒙古海拉尔市
内蒙古翁牛特旗
马春明 海 - 04
马春明 翁 - 03
乌丹蒿 A . wadanica 内蒙古翁牛特旗 王铁娟 乌 - 01、乌 02
猪毛蒿 A . scoparia
　
内蒙古多伦县
内蒙古乌海市
王东波 001
王铁娟 乌 010
大籽蒿 A . sieversiana 内蒙古镶黄旗 马春明 02- 194
1. 3　 IT S片段的扩增
PCR扩增试剂购自上海生工生物工程公司 ,用混和引物 P1+ P2扩增 ITS序列 (包括 ITS- 1, 5. 8
S和 ITS- 2) . P1位于 18S rDN A 3 端 ,序列为 5′- CGT AAC AAG GTT TCC G TA GG- 3′; P2位
于 26S 5′端 ,序列为 5′- TCC TCC GCT TAT TGA T AT GC- 3′. 50μl体系含: 33. 7μl双蒸水 , 5μl
10× PCR缓冲液 , 4μl ( 25mM ) Mg Cl2 , 1μl ( 10mM ) dN T P, 3μl (每种含 7. 5pmo l /μl)混和引物 , 0. 3μl
( 5U /μl ) Taq以及 3μl (约 12ng /μl )模板溶液 .扩增反应在 PTC- 100TM型 PCR仪上进行 ,扩增 ITS
的程序为: 94℃预变性 5 min,接以 94℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 1 min,循环 30次 ,最后在 72℃补平
5 min, 4℃保温 .
1. 4　外类群的选择
根据林有润 ( 1982)的研究〔 4〕 ,莳萝蒿组是蒿属中最原始的组 ,而大籽蒿又是该组中原始的种 ,本
研究取了大籽蒿为外类群 .
1. 5　序列数据的处理
ITS1和 ITS2的界限根据已知蒿属植物的 rDN A序列确定 .从 Genebank中选取与这 6个替代
551第 5期 王铁娟等　内蒙古蒿属沙生地理替代种的 ITS序列的比较分析
种同组的龙蒿 ( A. dracunculus L. ) 和猪毛蒿 ( A. scoparia Waldst . et Ki t )的 ITS1和 ITS2序列一起
进行分析 ,用 DNAStar软件中的 ClustalW进行排序 .
2　结果与分析
2. 1　 IT S扩增和测序结果
以 P1+ P2对 8种植物 18个个体样品的 ITS进行了扩增 ,扩增产物在 1. 5%的琼脂糖凝胶上电
泳 ,结果显示各样品均扩增出特异性较好的单一条带 . 18个个体及取自 Genebank的猪毛蒿、龙蒿排
列好的 IT S1+ ITS2见图 1.
2. 2　 IT S区的长度和序列变异分析
本研究共测得 8种植物 (见表 1)完整的 IT S(包括 ITS1、 5. 8s和 ITS2)序列 ,每种植物取了 2- 4
个个体 ,共 18个个体 .此 18个个体序列和取自 Genbank中的龙蒿、猪毛蒿的 ITS1和 ITS2序列的长
度、 GC的百分含量见表 2.
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图 1　 9种植物 20个个体排序后的 ITS序列
Fig. 1　 Aligned ITS sequences of 20 individuals in 9 species
　　从表中可以看出 ,除大籽蒿外 , 8个种 19个个体的 ITS1长度完全一致 ,为 251bp. ITS2长度略有
变异 ,从 218- 221bp.外类群大籽蒿 IT S1长 253bp, ITS2长 223bp.地理替代种及猪毛蒿的 GC含量
也高度一致 , ITS1为 53. 78%或 54. 18% , IT S2为 56. 42% ～ 58. 26% .龙蒿和大籽蒿略偏低 .由图 1
可见 ,地理替代种间以及猪毛蒿的 ITS序列变异很小 , 19个个体加上空格一共得到 475个位点 (不计
外类群 ) ,替代种间的变异位点 18个 (变异位点为出现两种及以上碱基类型的位点 ) ,其中 , ITS1 2
个 , ITS2 16个 .但所存在的变异基本上是个体之间的变异 ,并不表现在物种之间 .只有在比对后的
453位点处 ,乌丹蒿为 G,而其它种均为 A,是一个反映物种的变异位点 .作为龙蒿组原始种的龙蒿 ,
与上述种存在一定的差异 ,而外类群大籽蒿则有明显的不同 .根据 20个个体计算出 9种植物的平均
序列间一致度与序列分化的结果见表 3,地理替代种间以及猪毛蒿的序列间一致度高达 98. 5%～
553第 5期 王铁娟等　内蒙古蒿属沙生地理替代种的 ITS序列的比较分析
99. 7% ,序列间分化只有 0. 3%～ 1. 1% ,与龙蒿的一致度为 91. 3%～ 92. 1% ,序列间分化为 5. 3%～
6. 1% ,与外类群大籽蒿的一致度为 88. 5%～ 89. 4% ,序列间分化高达为 10. 7%～ 11. 5% .从图 2的
系统发育树结果看 ,龙蒿与外类群最近 ,而其它种由于序列间高度一致 ,不同种的个体聚到了一起 ,不
能把种区分开来 .
表 2　 9种植物 20个个体的 ITS1和 ITS2的序列长度及其 GC含量
Table 2　 Sequence sizes and G+ C percent content of ITS1 and ITS2 of 20 individuals in 9 species
编号 种 采样地点 ITS1
Size ( bp)
% ( G+ C)
ITS2
Size( bp)
% ( G+ C)
1 A . songarica( Son) 额济纳旗 251 53. 78 220 56. 82
2 A . sphaerocephala 1( Sph 1) 榆林市 251 54. 18 220 57. 73
3 A . sphaerocephala 2( Sph 2) 阿左旗 251 54. 18 221 57. 47
4 A . sphaerocephala 3( Sph 3) 沙坡头 251 54. 58 221 57. 47
5 A . sphaerocephala 4( Sph 4) 乌海市 251 54. 18 220 57. 73
6 A . ordosica 1(Ord 1) 榆林市 251 54. 18 220 57. 73
7 A . ordosica 2(Ord 2) 鄂托克旗 251 53. 78 220 57. 73
8 A . ordosica 3(Ord 3) 达拉特旗 251 53. 78 221 57. 47
9 A . ordosica 4(Ord 4) 沙坡头 251 54. 18 220 57. 73
10 A . intramongolica 1( Int 1) 镶黄旗 251 53. 78 220 57. 27
11 A . intramongolica 2( Int 2) 锡林浩特 251 54. 18 218 56. 42
12 A . halodendron 1( Hal 1) 海拉尔 251 53. 78 219 56. 62
13 A . halodendron 2( Hal 2) 翁牛特旗 251 54. 18 219 56. 62
14 A . wudanica 1(Wud 1) 翁牛特旗 251 54. 18 218 58. 26
15 A . wudanica 2(Wud 2) 翁牛特旗 251 54. 18 218 58. 26
16 A . scoparia 1( Sco1) 多伦县 251 53. 78 220 57. 73
17 A . scoparia 2( Sco2) 乌海市 251 53. 78 220 57. 73
18 A . scoparia 3( Sco3) Genbank 251 54. 18 219 57. 75
19 A . dracunculus(Dra ) Genbank 251 52. 59 219 52. 05
20 A . sieversiana ( Sie ) 镶黄旗 253 50. 59 223 52. 91
表 3　 9种植物 ITS序列间的一致度与分化 (% )
Table 3　 Identity and Divergence of rDNA ITS sequences of 9 spec ies (% )
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1. A . songarica * * * 99. 3 99. 5 99. 1 99. 4 99. 1 99. 0 92. 1 89. 4
2. A . sphaerocephala 0. 8 * * * 99. 7 99. 0 99. 4 99. 6 98. 9 91. 9 88. 7
3. A . ordosica 0. 5 0. 3 * * * 99. 2 99. 4 99. 6 99. 0 91. 8 89. 0
4. A . intramongolica 0. 9 1. 0 0. 8 * * * 99. 0 98. 7 98. 5 91. 3 89. 0
5. A . halodendron 0. 6 0. 7 0. 6 0. 9 * * * 99. 2 98. 9 91. 7 89. 0
6. A . wudanica 0. 9 0. 4 0. 3 1. 1 0. 9 * * * 98. 6 91. 5 88. 5
7. A . scoparia 0. 5 0. 8 0. 6 0. 9 0. 6 0. 8 * * * 91. 6 88. 6
8. A . dracunculus 5. 3 5. 6 5. 7 6. 1 5. 6 5. 6 5. 6 * * * 88. 5
9. A . sieversiana 10. 7 11. 4 11. 1 11. 1 11. 1 11. 5 11. 2 8. 8 * * *
　　注:下三角为序列间分化度 ,上三角为一致度
3　讨　论
　　 ITS序列在蒿属沙生地理替代种以及猪毛蒿间高度保守 ,反映出这些种间亲缘关系密切 ,且在蒿
属中为较年轻的类型 ,在进化过程中还未引起 ITS这一保守区域发生多少变异 .
但有趣的是 ,所存在的一些微小变异位点既存在于种内又存在于种间 ,即不能反映物种之间的变
554 内蒙古大学学报 (自然科学版 ) 2004年
异 .只有在比对后的 453位点处 ,乌丹蒿为 G,而其它种均为 A,是一个反映物种的变异位点 .其它的
位点 ,如比对后的 46位点 ,在序列峰图中 (未列出 ) ,所测的 18个个体中 ,均存在 C、 T两个峰 , C的峰
高于 T的峰时 ,读 C,反之读 T.这样 ,在油蒿与差不嘎蒿中有的个体为 C,而有的个体为 T,而籽蒿、
乌丹蒿、龙蒿为 C,其余种为 T.因为 IT S为高度重复的串联序列 ,在串联序列内存在着变异 ,同一位
点 ,有的为 C,有的为 T,当 C的含量高于 T时则 C的峰值高于 T,读为 C,反之 ,读为 T.其它的变异
位点也多为这种情况 .
图 2　根据 ITS1+ ITS2得到的系统发育树
Fig . 2　 The phylog enetic tr ee constructed from sequences o f ITS1 and ITS2
林有润在 “论蒿属的演化系统兼论蒿属和邻近属的亲缘关系”一文中 ,通过形态及分布等特征提
出 ,蒿属中一年生草本是原始类型 ,而后衍生出多年生草本或半灌木与灌木 ,并以与这几个种同组的
猪毛蒿作为一个进化的小例证 ,认为猪毛蒿为龙蒿组的一个原始种 .在各种“植物志”中均把龙蒿放到
龙蒿组的最原始的位置 .龙蒿为中生植物 ,多年生草本 ,分布区广 ,是北温带种 .我们所研究的沙生地
理替代种均为多年生半灌木 .为了验证龙蒿组中是否为多年生草本比半灌木更原始 ,且谁为最原始的
种 ,我们选了龙蒿和猪毛蒿做比较 ,并以蒿属中的原始种莳萝蒿组的大籽蒿为外类群 .结果显示 , ITS
序列在蒿属沙生地理替代种间高度保守 ,且与猪毛蒿高度一致 .而龙蒿的序列有着一定的变异 ,且与
大籽蒿的遗传距离最小 .所以 ,龙蒿这个多年生草本在龙蒿组中是最原始的种 .而猪毛蒿与替代种间
有着密切的亲缘关系 .
ITS序列在探讨蒿属近缘种间关系时 ,分辨率不够 ,作用不大 .在属内组的划分及组间的系统发
育关系上有较大的应用价值 .
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The Comparison Analysis among IT S Sequences
of th e Sand-geog raphical Subs titute Species
of Artemisia in NeiM ongol
WANG Tie-juan
1 , 2 , YAN G Chi
1 , YIN Jun
3
( 1. Department of Ecology and Environmental Science, NeiMongol University , Hohhot 010021;
2. College of L if e Science and Technology ,N eiMongol Normal Universi ty , Hohhot 010022;
3. Inst itute of Biotechnology , NeiMongol Agricul tural University , Hohhot 010018)
　　 Abstract: ITS sequences w ere analy zed in six sand-geog raphical substi tute species o f g enus
Artemisia L. in NeiMongo l and two same section species A. dracunculus and A. scoparia. A.
sieversiana were cho sen as an outg roup. The resul ts show n that: ITS sequence of six substitute
species and A. scoparia were very high homogeneous, the size of ITS1 was 251bp, G+ C content
w as 53. 78% or 54. 18% , and there w ere 2 va rious si tes in I TS1; the size of ITS2 is 218～ 221bp, G
+ C content was 56. 42%～ 58. 26% , and there are 16 various sites in ITS2. The homogeneous se-
quences w ere 98. 5% ～ 99. 7% among the seven species, 91. 3%～ 92. 1% among the seven species
and A. dracunculus , and 88. 5% ～ 89. 4% among them and the outg roup. It indicated that IT S se-
quences o f substi tute species w ere relativ ely conserva tiv e.
Key words: Artem isia; the geog raphical substi tute species; ITS
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