全 文 ：·蒙医药论坛·
收稿日期:2012 － 05 － 11;修回日期:2012 － 06 － 12
基金项目:内蒙古医学院博士启动基金项目(NY2008BQ005)
作者简介:李骁(1978 －) ，男，内蒙古医学院药学院副教授。
通讯作者:鞠爱华，教授，硕士研究生导师，E － mail:lx_leexiao@ 163． com 内蒙古医学院药学院，010059
铁线莲属蒙药材的 rDNA － ITS序列分析
李 骁， 王 佩， 赵 龙， 鞠爱华*
(内蒙古医学院药学院，内蒙古 呼和浩特 010059)
摘要:目的:比较研究铁线莲属入蒙药的 6 种药用植物(芹叶铁线莲、长瓣铁线莲、黄花铁线莲、棉团铁线莲、
辣蓼铁线莲、短尾铁线莲)的 rDNA － ITS序列差异性及其规律，寻找 6 种植物药之间的分子鉴别方法。方法:从
铁线莲属蒙药材中提取总 DNA，用 PCR 法扩增 ITS，运用 Clustal X、MEGA 等软件比较和分析 ITS 的序列特征。
结果:铁线莲属入蒙药的 6 种药用植物 ITS序列长度为 548 ～ 552bp，具变异位点 57 个，其中信息位点 23 个，特异
性鉴别位点 33 个。序列已提交至 NCBI数据库，登录号为 JN809679 － JN809684。结论:ITS序列对铁线莲属入
蒙药的 6 种药用植物具有较好的分辨性，为铁线莲属蒙药材分子鉴别提供了参考。
关键词:铁线莲属;蒙药材;ITS序列
中图分类号:R29 文献标识码:A 文章编号:1004 － 2113(2012)04 － 0325 － 06
rDNA － ITS SEQUENCE ANALYSIS OF THE TRADITIONAL
MONGOLIAN MEDICINAL PLANTS IN CLEMATIS L．
LI Xiao， WANG Pei， ZHAO Long， et al．
(Department of Pharmacy，Inner Mongolia Medical College，Hohhot 010059 China)
Abstract:Objective:To investigate the patterns and differences of the rDNA ITS sequences of six
traditional Mongolian medicinal plants in Clematis L． (C． aethusifolia，C． macropetala，C． intricata，C．
hexapetala C． mandshurica and C． brevicaudata)and to establish a molecular biological method in iden-
tification of these plants．Methods:DNA was extracted from the dry leaves of the plants，ITS gene frag-
ments were amplified by PCR and sequenced． The sequences were compared and analyzed using Clustal
X and MEGA softwares． Results:The length of ITS region varied from 548 ～ 552 bp with 57 variable
sites，23 parsimony information sites and 33 singleton sites in the 6 plants in Clematis L． The sequences
were submitted to NCBI database with the registry numbers of JN809679 － JN809684． Conclusion:ITS
sequences could be used to identify the six species in Clematis L． and also could provide a reference for
molecular identification．
·523·内蒙古医学院学报 2012 年 8 月 第 34 卷 第 4 期
DOI:10.16343/j.cnki.issn.2095-512x.2012.04.002
Key words:Clematis L．;the traditional Mongolian medicinal plants;ITS sequence
铁线莲属(Clematis)隶属于毛茛科，为多年生
木质或草质藤本，或为直立灌木或草本，分布于世
界各地，约 300 种，我国各地均有分布［1］。内蒙古
地区有 16 种 6 变种［2］，经本草考证［2 ～ 5］，其中入蒙
药的植物有:芹叶铁线莲(Clematis aethusifolia)、黄
花铁线莲(C． intricata)、长瓣铁线莲(C． macropeta-
la)、短尾铁线莲(C． brevicaudata)、棉团铁线莲(C．
hexapetala)和辣蓼铁线莲(C． mandshurica) (又名:
东北铁线莲［6，7］)。蒙医临床上，芹叶铁线莲、黄花
铁线莲和长瓣铁线莲枝叶同等入蒙药，蒙药名:特
木日 －敖日秧古，味辛、微甘，性热，破痞、助温、燥
希日乌素，治寒痞、积食，“希日乌素”症等;短尾铁
线莲茎入蒙药，蒙药名:奥日雅木格，味苦、性凉，清
热，止泻、止痛，用于治疗肝热、肺热、肠刺痛等;棉
团铁线莲和辣蓼铁线莲全草入蒙药，蒙药名:依日
绘，味辛、微甘、性热，破痞，助温，燥“希日乌素”，
用于治疗寒痞、食积、水肿、寒泻、疮痈等［2，5］。以
上 6 种铁线莲，从蒙医药性及功能主治方面，各有
差异，不能等同。但由于来源于同科同属不同种植
物，亲缘关系相近，原植物形态、药材性状及显微特
征方面相似，故临床用药混用、代用等现象较为严
重，因而从分子水平上对其进行分类鉴别尤为
重要。
DNA分子标记技术用于中药材鉴定和品质评
价等方面的研究已有很多报道，关于植物核糖体
DNA中的内转录间隔区(ITS)序列测定已广泛用
于中药材近缘属间，属内以及种内居群间的差异性
研究［8 ～ 10］。普春霞等［11］对云南铁线莲属 12 种药
用植物进行了 RAPD 分析，蒋明等［12］运用 ITS 序
列对铁线莲属柱果铁线莲(C． uncinata)等 8 种药
用植物进行了鉴别研究，但将 ITS 序列用于铁线莲
属入蒙药的上述 6 种药用植物鉴别，尚未见这方面
的报道。本研究通过测定 rDNA ITS 序列，构建了
铁线莲属入蒙药的 6 种药用植物的系统发育树并
探讨其亲缘关系，从而为铁线莲属蒙药材的分子鉴
定及其新药用资源的开发研究提供参考。
表 1 供试样品来源
Tab． 1 Source of materials
名称 凭证标本 采集地点 采集时间 注册登记号
芹叶铁线莲 Clematis aethusifolia Turcz．
QYT20090820 凉城县蛮汉山 2009 － 8 － 20
JN809679
QYT20100809 凉城县蛮汉山 2010 － 8 － 9
CBT20090822 乌兰察布市黄花沟 2009 － 8 － 22
长瓣铁线莲 C． macropetala Ledeb．
CBT20100707 呼和浩特市小井沟 2010 － 7 － 7
JN809684
黄花铁线莲 C． intricata Bunge．
HHT20090715 凉城县蛮汉山 2009 － 7 － 15
JN809683
HHT20100809 凉城县蛮汉山 2010 － 8 － 9
MTT20090717 呼和浩特市小井沟 2009 － 7 － 17
棉团铁线莲 C． hexapetala Pall．
MTT20100709 凉城县蛮汉山 2010 － 7 － 9
JN809681
辣蓼铁线莲 C． mandshurica Rupr．
LLT20100727 辽宁省鞍山市千山 2010 － 7 － 27
JN809682
LLT20100730 辽宁省丹东市凤凰山 2010 － 7 － 30
DC． DWT20090820 呼和浩特市白石头沟 2009 － 8 － 20
短尾铁线莲 C． brevicaudata
DWT20100813 呼和浩特市小井沟 2010 － 8 － 13
JN809680
1 材料和方法
1． 1 材料
于 2009 ～ 2010 年药材采收期采集 6 种铁线莲
植物全草，置于阴凉通风干燥处储存，本实验采用
干燥药材叶片进行 DNA 提取。6 种原植物均经笔
者鉴定，凭证标本保存于内蒙古医学院药学院药用
植物学标本室，材料来源(见表 1)。
1． 2 总 DNA提取、纯化
采用改良 CTAB 法［13］进行药材 DNA 提取，并
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做适当改进。产物于 － 20℃保存备用。
1． 3 ITS序列的扩增、纯化、测序
以提取的 DNA 为模板，ITS 的扩增引物参照
陈晓颖等［14］和 Takaiwa F 等［15］的引物设计，ITS1:
5’－ AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG － 3’;
ITS4:5’－ TTCTCCGCTTATTGATATGC － 3’(均由
大连宝生物公司合成)进行扩增。PCR 扩增体系
总体积为 20μL，包括:10 × Buffer 2μL，10 mmol /L
dNTP 0． 5μL，10μmmol /L 正向引物和逆向引物各
1μL，Taq 聚合酶(5U /μL)0． 1μL，DNA 模板(适宜
浓度)2μL，灭菌三蒸水(3d H2O)13． 4μL。PCR 扩
增 ITS 序列的程序为:94℃预变性 4 min，94℃ 1
min，50℃2 min，72℃ 2min，循环 36 次，最后 72 ℃
延伸 10 min。同时以 3dH2O 代替模板 DNA 作空
白对照。扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳进行
分析。
将扩增的目的 ITS序列进行琼脂糖凝胶电泳，
通过 DNA胶回收试剂盒(北京康为世纪公司)对
凝胶目的条带进行回收纯化，将回收纯化产物送上
海英俊公司直接测序，所有序列均进行双向测序并
用 CLC Sequence Viewer 6． 3 软件反向互补、对位排
序、手工校正。同一物种的两个测序结果中 ITS 序
列一致，故将其一序列提交 NCBI 中 GeneBank 数
据库。
表 2 ITS序列(包括 ITS1 和 ITS2)长度及其 G + C含量
Tab． 2 Length of ITS(including ITS1 and ITS2)and content of G + C
ITS ITS1 ITS2
Sample
Size(bp) G + C(%) Size(bp) G + C(%) Size(bp) G + C(%)
C． aet 549 61 171 61 219 67
C． mac 548 60 170 59 219 66
C． int 552 60 164 59 229 66
C． hex 549 61 169 59 221 69
C． man 548 61 168 59 221 70
C． bre 550 60 172 59 219 67
表 3 铁线莲属蒙药材的特异性鉴别位点
Tab． 3 ITS sequence singleton sites of six species in Clematis
位点 /bp
Sample
2 4 53 59 68 74 99 139 143 147 149 150 157 163 215 251 293
C． aet A C A C C C T T A A G A G G G G G
C． mac A C A T C C A T T A G A G G G G G
C． int A C G T C A A T A A G A G G G G G
C． hex A G A G A C A T A G G A G G G G G
C． man T C A A C C A C A A G A G G G G G
C． bre A C A T T C A T A A C C A A A A A
位点 /bp
Sample
304 343 357 358 377 394 434 452 466 479 484 528 535 544 551 552
C． aet G G C G C C G T C G G G C － T T
C． mac G G C T A C G T C C G G C － T T
C． int G G A C C T G T C T G A T T T T
C． hex G G C G C C G T C G G G C G T T
C． man G G C G C C G T C G G G C G C T
C． bre A C C G C C A G T G A G C － T C
1． 4 序列分析及系统树构建
用 Clustal X1． 8 软件［16］进行 DNA 序列比对
(alignment)。用 MEGA 4． 0 分别计算各样品 ITS
序列的差异性，以 Kimura － 2 参数计算遗传距
·723·内蒙古医学院学报 2012 年 8 月 第 34 卷 第 4 期
离［17，18］，采用 UPGMA 法构建系统发育树，并以
bootstrap作 2000 次可信度分析。
表 4 ITS序列间的 Kimura进化距离
Tab． 4 Pairwise divergence of ITS sequences using Kimura －
2 － parameter distance
Sample C． aet C． mac C． int C． hex C． man C． bre
C． aet
C． mac 0． 021
C． int 0． 032 0． 042
C． hex 0． 042 0． 052 0． 046
C． man 0． 042 0． 048 0． 050 0． 015
C． bre 0． 042 0． 044 0． 061 0． 069 0． 067
2 结果
2． 1 ITS序列特点
所测 6 种蒙药材铁线莲 ITS 序列的 GeneBank
序列注册登记号见表 1。依据基因库中铁线莲属
近缘种小木通(Clematis armandii)已报道的序列资
料(GeneBank FJ572047)确定 rDNA内转录区 ITS1
和 ITS2 与 3 个编码区 18S、5． 8S、26S的界限。6 种
蒙药药用植物 ITS 序列长度为 548 ～ 552bp，包括
57 个变异位点，其中信息位点 23 个，特异性鉴别
位点 33 个，GC 含量为 60% ～ 61%。该片段包括
ITS1、5． 8S和 ITS2，其中 ITS1 长度为 164 ～ 172bp，
GC含量为 59% ～ 61%;ITS2 长度为 219 ～ 229bp，
GC含量为 66% ～ 70%;ITS2 序列长于 ITS1 序列。
ITS2 序列中 GC含量高于 ITS 序列和 ITS1 序列中
的 GC含量。
2． 2 ITS序列间进化距离
根据 Kimura － 2 参数遗传距离模型计算得到
的 ITS序列间进化距离见表 4。棉团铁线莲和辣
蓼铁线莲之间的遗传距离最小(0． 015) ，芹叶铁线
莲和长瓣铁线莲之间的遗传距离次之(0． 021) ，短
尾铁线莲和棉团铁线莲、辣蓼铁线莲之间的遗传距
离最大，分别为:0． 069、0． 067。
2． 3 ITS序列系统发育分析
采用 UPGMA 法进行 6 种蒙药药用植物的亲
缘关系分析，并构建系统发育树(如附图)。棉团
铁线莲和辣蓼铁线莲具有较高的同源性，二者聚为
一类;芹叶铁线莲、长瓣铁线莲和黄花铁线莲之间
的同源性较高，大体可以聚为一类;而前五种铁线
莲与短尾铁线莲的同源性较低，短尾铁线莲单独为
一类。
附图 基于 ITS序列的铁线莲属蒙药材系统发育树
Fig． Molecular phylogenetic tree inferred from ITS of six species in Clematis
3 讨论
近年来，分子标记技术和 DNA 指纹分析技术
的迅猛发展及其广泛应用，为揭示药用植物的遗传
差异和鉴定中药材品种提供了新的方法和手
段［19，20］，其中核糖体 DNA(即 nrDNA)ITS 区(包括
ITS1、5． 8S 和 ITS2)序列已被广泛用于植物属内、
近缘属间及同一物种不同居群间的系统发育分析
等。ITS序列等分子标记直接根据生物 DNA 的多
态特征，通过序列比对分析得到相当稳定的信息位
点，结果更为客观和准确。通过序列比对与同源性
分析相结合，可以准确鉴定每一种药用植物。因此
·823· Journal Of Inner Mongolia Medical College Aug． 2012 Vol． 34 No． 4
建立合理的检测方案对于不同药材尤其是易混药
材的鉴别具有重要意义［21，22］。
本研究以铁线莲属入蒙药的 6 种药用植物为
材料，运用 PCR 技术分离并测定了各自的 ITS 序
列，将其提交至 NCBI 数据库，登录号为 JN809679
－ JN809684。本研究中，6 种蒙药药用植物 ITS 序
列长度为 548 ～ 552bp，具有 57 个变异位点，其中
信息位点 23 个，特异性鉴别位点 33 个，通过序列
特征及同源性分析，ITS 序列具有丰富的信息位点
和特异性鉴别位点，可作为 6 种蒙药药用植物之间
鉴定的分子标记。
通过基于 ITS 序列构建的系统发育树及遗传
距离分析，我们发现芹叶铁线莲、长瓣铁线莲和黄
花铁线莲之间的亲缘关系较近，聚为一类;棉团铁
线莲和辣蓼铁线莲之间的亲缘关系较近，聚为一
类;而短尾铁线莲单独为一类。这与芹叶铁线莲、
长瓣铁线莲和黄花铁线莲入蒙药“特木日 －敖日
秧古”，棉团铁线莲和辣蓼铁线莲入蒙药“依日
绘”，而短尾铁线莲以入蒙药“奥日雅木格”文献记
载取得了较为一致的结果。植物系统进化关系和
植物化学分类学揭示出:亲缘关系越近的物种，其
所含的化学成分越相似，甚至具有相同的活性成
分［23］。本研究结果是否说明同等入药的药用植物
具有更为相似的化学成分，甚至更近的亲缘关系
呢?笔者认为，还需结合叶绿体 matK、rbcL和 trnH
－ psbA等多个基因序列的分析，以及 6 种药用植
物的药理、药化及药效学研究，才能得到更为详实
的结果。如果上述假设得以证实，则为我们通过药
用植物亲缘关系来寻找可替代的植物新药源提供
了一个崭新的思路。
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(责任编辑:额尔德木图)
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