全 文 ：2 0 0 3年 12 月
D e e em b e r 2 0 0 3
中日 油料作 物母很
C h i
n e s e
j
o u r n a l o f 0 11 e or P s e i e n e e s
第 2 5 卷第 4 期
V o l
.
2 5 N o
.
4
甘蓝与芸蔓属 5 个近缘物种
的基因组原位杂交分析
李宗芸 ` ,2 , 伍晓明 2 .3 , 王秀琴 ` , 宋运浮 , `
` 1 . 徐州师范大学生物系 , 江苏 徐州 22 J l l 6 ; 2 . 武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室 , 湖北 武汉 43 0 72 ;
3
, 中 国农 湘科学院油料作物研究所 .湖北 武汉 43 0 62)
摘要 :利用基因组原位杂交 ( GI S H ) 技术 , 研究 了甘蓝基因组与芸墓属其它 5 个近 缘物种基 因组间 的相互关
系 。 以标记的甘蓝 ( C C , Z n 二 18) 的基因组 总 D NA 为探针 , 分别同二倍体甘蓝 、 白菜型油菜 ( A A , Z n 二 2 0 ) 、 黑芥
( B B
,
Z n 二 一6 )和异源四倍体芥菜型油菜 ( A A B B , Z n 二 3 6 ) 、埃塞俄比亚芥 ( B B C C , Z n 二 3 4 ) 、甘蓝 型油菜 ( AA e C , Z n 二
3 8) 的中期染色体杂交 , 甘蓝 、 白菜型油菜和甘蓝型油菜的所有染色体上都有杂交信号 , 不能区分 A 、 C 基 因组 。 黑
芥染色体上 只有零星的弱小信号 ,埃塞俄比亚芥的中期染色体显示 出 18 个明显 的信号 , 可 以 区分 出 C 、 B 基 因组 ;
芥菜型油菜的中期染色体显示出 20 个明显 的信号 ,其余染色体上信号很弱或无 ,可 以区分出 A 、 B 基因组 。 说明在
长期的进化过程中 ,甘蓝与白菜型油菜 、 甘蓝型油菜的亲缘关系较近 ,基因组的分化程度较小 , 而甘蓝与黑芥的亲
缘关系较远 ,基因组的分化程度较前者高 ;甘蓝与芥菜型油菜和埃塞俄 比亚芥间的亲缘关系介于上述二者之 间 。
关键词 : 基因组原位杂交 ; 芸墓属 ; 甘蓝 ; 基因组分化
中图分类号 : 5 5 6 5 . 4 0 2 . 1 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 7一9 0 5 4 ( 2 0 0 3 ) 0 4一0 0 26一 0 4
芸夔属 ( B ar s s i e a g e n u s )植物 中广泛种植 的异源
四倍体 物种 芥菜 型油菜 ( B . j un ce a ) ( A A B B , Z n 二
3 6 )
、埃塞俄 比亚 芥 ( B . c a r in a , a ) ( B B C C , Z n = 3 4 ) 、
甘蓝型油菜 ( B . n aP us ) ( AA C C , Z n 二 38 )分别是在 自
然条件下 ,通过二倍体物种白菜 ( B . arP a) ( A A , Z n 二
2 0 )
、黑芥 ( B . n ig r a ) ( B B , Z n = 16 ) 、 甘蓝 ( B . o le ar -
e e a ) ( C C
,
Z n = 18 )的祖先种相互间杂交和染色体加
倍 、进化后形成的 。 但是从基因组含量来看 , 二倍体
白菜为 4 7 0 一 5 2 0 M b , 黑芥为 0 . 9 7 p g / Z c ( 4 6 8 M b /
I C
,
C 为单倍体核 D N A 含量 ) , 甘蓝 为 1 . 37 p岁Z C
( 6 6 2 M b / I C )
, 异源四倍体芥菜型油菜 为 2 . 5 6 Pg / ZC
( 12 35 M b/ I )C
、 埃 塞 俄 比亚 芥 和 甘 蓝 型 油 菜 为
2
.
2 9 p g / ZC ( 1 10 5 M b / I C ) [
’ · , ] ,表 明芸墓属双二倍体
物种的基因组大小并不是二倍体物种的简单相加 ,
芸墓属双二倍体物种的基因组与其祖先二倍体物种
相 比可能发生了一定 的变化 。 s on g 等「’ ]认 为 , 在多
倍体形成后的早期世代 中 , 可能伴随着快速基因组
变化 。 芸墓属 6 个物种 的 : D N A 物理定位研究 [’, , 1
也表明 ,芸整属双二倍体物种在进化过程中发生了
染色体的重排 。
芸荃属异源四倍体油菜的进化是高等植物多倍
体物种进化的一个很好典型 , 多倍体化在高等植物
的进化中是一个重要的历程 , 是物种形成过程 中染
色体数 目增加的一种主要力量 。 研究分析异源多倍
体基因组组成以及基因组间亲缘关系对于了解多倍
体物种的起源和演化是十分重要的 。 基因组原位杂
交 ( G e n o m ic i n s i t u h y b r i d i z a t io n G I SH )技术作为研
究多倍体 物种基 因组 组成 的一种 非 常有效 的手
段 [’] ,从 20 世纪 80 年代末产生以来 , 已得到了很大
的发展 。
本研究以芸墓属的二倍体物种甘蓝 ( B . ol er a -
e e a ) ( C C
,
Z n 二 18 ) 的基 因组总 D N A 为探针 , 分别同
二倍体种 B . ar a ( A A , Z n = 2 0 ) 、 B
.
n ig r a ( B B
,
Z n =
16 )
、 刀 . 。 l e ar e e a ( e e , Z n = 1 8 ) 和异源 四倍体种 B .
ju n e
e a ( A A B B
,
Z n = 3 6 )
、
B
.
e a r i n a r a ( B B C C
,
Z n =
34 )
、
B
. 。
aP us ( A A c c
,
2 。 = 38 ) 的中期染色体杂交 ,
探讨 B . 口 le ar ce a 与 B . 阴户a 、 B . n l g r a 、 B . ju n ce a 、 .B
ca inr at
a 、 B
.
n aP u
: 等近缘物种基 因组结构之间的关
系 。
1 材料与方法
植物材料包括 白菜型油菜 ( B . r即a) 烯水白 、 黑
收稿 日期 : 2 00 3一 10一2 5
基金项 目 : 国家自然科学基金项 目 ( 30 17 0 5 85 , 3 9 8 30 2 7 0 ) ;徐州师范大学自然科学基金重点项 目 ( 02 人X加0 6)
作者简介 : 李宗芸 ( 19 6 4一 ) .女 ,山东省 日照市人 , 博士 , 副教授 , 从事植物分子细胞遗传学研究 。
* 联 系人 , E 一 m a i l : 2 0 。邵。 n l i@ y a h o o . e o m , y e s o n g @ w h u e d u . e n
李宗芸等 : 甘蓝与 芸荃属 5 个近缘物种的基因组原位杂交分析
芥 ( B . n 烤ar )尤嫩斯 、 甘蓝 ( B . ol e ar ce a) 羽衣甘蓝和
芥菜型油菜 ( B . j’u cn ea )西堡 高秆 黄油菜籽 、 埃塞俄
比亚芥 ( B . 。 a r i n a ra ) 7 7 一 12 2 6 、 甘 蓝型油菜 ( B . n a -
p us ) 中双四号 ,所有材料均 由国家油料 中期 种质资
源库提供 。
染色体制片 :按 S o n g 和 G u s t a fs o n 川 的方法稍加
改进 。 当生长旺盛 的植株根长为 2 一 c3 m 时 , 取根
尖 Z m m 通过饱和 。 一 滨蔡溶液处理 、 d H 2 0 充分洗
净 、 新鲜固定液固定 、 d H 2 0 充分洗净 、 2 % 的纤维素
酶和 2% 的果胶酶 28 ℃下酶解 、 水洗并 固定 等步骤
后 , 采用火焰干燥法制片 , 一 20 ℃ 保存备用 8[] 。
基 因组 DN A 的提取及标记 : 采用 C TA B 法提取
甘蓝的基因组总 D N A 。 用生物素 一 n 一 d U T P ( 51 9 -
m a )标记甘蓝的基因组总 D N A 作为探针 ,所有探针
都用切 刻 平 移 法 标 记 。 50 林 L 标 记 反 应 液 中含
d A T P
、
d G T P
、
d C T P 和 b io t i n 一 1 1 一 dU T P , DN a s e l ,
D N A 聚合酶 I (华美公 司 ) 和 0 . 5卜g 探针 D N A 。 标
记及点印渍检测方法见参考文献【8 〕。
染色体原位杂交 : 按 s o n g 和 Gus at fs on 〔 , ]的方法
稍加改进 , 每张制片大约 5 0林L 杂交液 , 含 50 % 的去
离子甲酞胺 ( Si g m a )和 10% 的硫酸葡聚糖 ( S i gm a ) ,
Z x s s e
,
5 0 一 10 o n g / 卜L s s s D N A , 2 0 一 4 0 n g 探 针
D N A [8 ]
。
原位杂交信号的荧光检测及图象分析 : 每张玻
片加 5 0 卜L s t r e p t a v i d i n 一 C v 3 ( S i gm a )于 3 7℃下温育
3 0 一 6 o m i n , P B S 漂 洗 3 次 , 每 次 s m i n , 然 后 用
0
.
5 卜g/ m L D A PT ( 4
’ ,
6 一 d i a m i d i n o 一 2 一 p h e n v l i n -
d o l e )复染 , o lv m p u s B X 6 0 显微镜观察荧光原位杂交
信号 , p h o t o m e t r i e s S e n s y s C C D ( e h a r g e e o u p l e d d e -
v i e e ) 14 0 0 E 照相装置俘获图象 , V 十 十 P r e e i s i o n D i g it -
a l Im a g in g Sy s t e m 和 p h o to s h o p 软件进行图象叠加和
处理 。
2 结果与分析
2
.
1 B
.
o l e ar e e a 基因组总 D N A 与 B . o l e ar e e a 染色
体杂交
以甘蓝 ( B . ol e ar ce a) 的基 因组总 D N A 为探针 ,
对甘蓝 ( B . o le ar ce a) 的染色体进行 自杂交 (图版 1 ) ,
l a 为甘蓝 ( B . 。 le ar e e a )的染色体 ; l b 为甘蓝 ( B . 。 le r -
ac ea )基因组总 D N A 为探针的杂交信号 , 杂交信号
涂满了整条染色体 ,可以清晰地看出 18 条染色体的
形态 ,但杂交信号在染色体的着丝粒部位特别突出 ;
I C 为 l a 与 1b 的合成图象 , 染色体上 都涂满 了红
色 ,着丝粒部位信号很强 ,而由于蓝色对红色的叠加
作用 ,使非着丝粒部位较弱的信号部分被覆盖 ,有些
部位信号不明显 。
.2 2 .B ol e ar ce a 基因组总 D N A 与 B . arP a 染色体杂
交
用甘蓝 ( B . ol e ar ce a) 基因组总 D N A 为探针 , 与
白菜型油菜 ( B . arP a )的染色体基 因组原位杂交 , 20
条染色体上都有红色 的杂交信号 ,只是 2 条染色体
上的杂交信号较弱 ,说明 A 、 C 基 因组间具有很强的
同源性 ( 图版 2) 。
2
·
3 B
.
o l e r a e e a 基 因组总 D N A 与 B . n ig r a 染色体
杂交
用甘蓝 ( B . ol e ar ge a )的基 因组总 D N A 为探针 ,
与黑芥 ( B . n ig ar )的染色体杂交 , 染色体上的杂交信
号非常弱 , 只有一些小 的信号点 , 可能是 rD N A 等重
复序列 ,说明 B 、 C 基因组间同源性较弱 ( 图版 3) 。
2
.
4 刀 . o le ar e e a 基因组总 D N A 与 B . j u n e e a 染色体
杂交
用甘蓝 ( B . o le r ac ea )的基因组总 D N A 为探针 ,
与芥菜型油菜 ( B . uj cn ea )的染色体杂交 , 可清晰地
看到 2 0 条染色体具有信号 ,染色体的着丝粒部位杂
交信号比较强烈 ,其它染色体上只有不明显的信号 ,
这表明 C C 可以 识别 AA B B 基 因组 中的 A 基 因组
(图版 4 ) 。
2
.
5 B
.
o le ar e e a 基因组总 D N A 与 B . 。 a r i n a t a 染色
体杂交
用甘蓝 ( B . ol er ac ae ) 的基因组总 D N A 为探针 ,
与埃塞俄 比亚芥 ( B . ca ir an at ) 的染 色体杂交 , 18 条
染色体上有强烈的杂交信号 ,其余染色体信号较弱 ,
另外有一些小的信号点 ( 图版 5 ) 。
2
.
6 B
.
o le ar e e a 基 因组总 n N A 与 B . n ap u s 染色体
杂交
用甘蓝 ( B . 。 le ar ce a) 的基 因组总 D N A 为探针 ,
与甘蓝型油菜 ( B . n aP us ) 的染色体杂交 , 38 条染色
体上都基本涂满 了红色 , 不能识 别 A 和 C 基 因组
(图版 6 ) 。
3 讨论
本实验表明 ,利用 C 基 因组 D N A 作为探针 ,可
以检出异源 多倍体 油菜 中 A A B B 或 B B c C 中的 A
或 C 基因组 ,但不能区分 AA C C基 因组 中 A 和 C 基
因组 ,而且 C 基因组 D N A 和 A 基因组染色体可以
杂交 ,信号强烈 。 在前期的实验中 s{] , 利用 A 基 因
组 D N A 作为探针 , 可以检 出异源多倍体油菜 A A B B
基因组 中的 A 基 因组 ,但不能区分 A A c C 基因组中
中已油抖作 物李报 2 003 , 2 5 ( 4 )
A 和 C 基 因组 , 这两种实验结果得到 了相互印证 ,
说明 C 与 A 基因组间存在 着高度的同源性 。 同时
C 基因组 D N A 难以与 B 基因组染色体杂交 ,也不能
与多倍体油菜 A A B B 、 B B C C 基因组中的 B 基因组
杂交 ,证实了利用 B 基因组 D N A 作 为探针 , 只能检
出异源多倍体油菜中 B B C C 中的 B 基 因组 , 而 C 基
因组不能检出 ,表明 C 基因组与 B 基因组间的同源
性比 C 与 A 基 因组 间弱 , 具有相对较远的关 系 ,这
和前人的研究结果是一致的「’ 。 一 ` , 〕 。 s on g 等〔 ’ 0 〕在芸
签属 R F L p 的研究中 , 发现在 B . r叩 a x B . o l e r a e e a 异
源多倍体 ( A 和 C 基因组 ) 中 , R F L P 片段没有明显
的变化 。 但在 B . r aP a x B . n咭ar 异源多倍体 ( A 和 B
基因组 )中 , 9 个 A B 异源多倍体的 F , 个体中 B 基
因组出现了明显的 R F LP 片段 的丢失 ,认为 A 、 C 基
因组比 A 、 B 更为相似 , 因此在 A C 异源多倍体基 因
组中缺乏细胞质效应 , 而 A B 异源多倍体中细胞质
的影响可能与核质相容性有关 。 在芸蔓属异源多倍
体的进化过程中 , 祖先种的核基 因组和细胞质对异
源多倍体基因组的进化都有很大的影响 ,这 可能导
致了染色体的重排 、 重复等变化 。 这些研究表明 ,在
长期的进化过程中 ,甘蓝与白菜型油菜 、甘蓝型油菜
的亲缘关系较近 ,基因组的分化程度较小 ,而甘蓝与
黑芥的亲缘关系较远 ,基因组的分化程度较前者高 ;
甘蓝与芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥间的亲缘关系介
于上述二者之间 。
近 10 年的相关研究表明 ,大多数多倍体是多起
源的 ,而且是周期性发生的 , 可 以频繁地发生在一个
较短的时间和较 小的范围内 。 大量染 色体通过染
色 、 遗传作图和比较遗传学研究等表明 ,在多倍体的
形成过程中 ,基因组进行了重建 ,尽管百万年来科内
植物基因顺序是保守的 ,但也同时发生着基因组的
重建 ,而且多倍体中的基 因组重建 比二倍体更为快
速和广泛 [” , “ 〕 。 在多倍体的形成过程中 ,亲本基因
组的组成可能发生了结构性重排或基 因组的重组 ,
为了克服核质基因组 间不利的相互作用 , 促进新物
种的形成 ,有些染色体变化在杂交后迅速产生 , 因此
在多倍体化的过程中 , 基因组 内和基 因组间的重新
组织 ( r e o r g a n i z a t i o n )是广泛存在 的 , 对于芸墓属物
种的起源 , T r u e 。 等 [ ’ ] 比较 刀 r a s s i e a 3 个二倍体基 因
组的连锁图时发现 ,基 因组间存在着保守的区域 ,这
些保守的 区域在基 因组 中具 有广泛 的重 排现象 。
A
、
B
、
C 基因组内的一些染色体也存在着同源保守
性 ,基因组内染色体的相互关系表 明 B ar s ica 染色
体系统发生的可能依据是至少具有 5 条染色体和不
超过 7 条染色体的祖先基因组 , 从较小的祖先基因
组形成 B ar s ic a 基因组的过程中发生了广泛的重复
和重排 。
s n o w d o n 等 [` , ]利用 5 5 和 4 5 5 r D N A 作探针对
早中期染色体进行 F IS H 分 析 ,结合 D A PI 染色 , 通
过比较 B . arP a 、 B
.
o le ar ce a 和 B . n aP us 的 rD N A 杂交
信号位点和 D API 染色的模式 , 能够在一定程度上
识别 B . n aP us 的 A 与 C 染色体 。 但是 , 由于 5S 和
45 5 rD N A 在染色体上的位点数有限 , 而且油菜染色
体很小 ,有些染色体的 D A PI 带模式非常一致 , 因此
还不能将 A 、 C 基 因组的染色体完全区分开来 。 为
了更确切地识别 A 、 C 基因组的染色体 ,寻找和分离
基因组专一性的重复序列是一项十分必要的措施 。
近年来 ,基因组原位杂交在杂交多倍体 、杂交植
物 、 部分异源多倍体 、 多元单倍体和重组品系的基因
组和染色体特征 、 异源染色质渗人的检测 、 B 染色体
的起源 、体细胞克隆变异的检测 、染色体配对和其它
染色体进 化等诸 多方 面得 到 了极 大 的发展 和应
用 [` 6 ] 。 随着多色基 因组原位 杂交 ( M e G IS H ) 、 比较
基因组原位杂交等技术手段的改进和发展 ,基 因组
原位杂交 ( GI S H )在植物基因组研究中的应用将十
分广泛 。
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F r ie d t W
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G e n o m i c i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ( G IS H ) a n a l y s i s o f B
.
o le ar e e a a n d 5 r e l a t e d B ar s s ic a s P e e i e s
L l z o n g 一 y u n l , 2 , W U X i a o 一 m i n g Z
·
3 ,
W A N G X i
u 一 q i n l , S o N G Y u n 一 e h u n Z
( 1
.
D叩 a rt m e n r of B io le gy , X u z h o u No r m a l nU i o e sr i t y , 尤淞人o u 2 2 1 1 16 , Ch i n a ;
2
. 从少 aL bo ar ot yr of M O E fo r P la n t D o e loP m e n t a l B i o l o gy , 叭 h a n nU 动e sr i t了 , W“ ha n 4 3 0 0 7 2 , C h i n a ;
3
.
0 11 C r o p s R es e a cr h nI
s r i r u et of CA A S
,
W“ h a n 4 3 0 0 6 2
,
Ch i n a )
A b s t r a e t : G e n o m i e i n s it u h y b r id i z a t i o n ( G IS H ) w a s u s e d t o s tu d y th e
r e l a ti o n s h i p b e t w e e n B
.
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n o m e a n d 5 r e la t e d B ar s s i e a s p e e i e s
.
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o t a l D N A o f B
.
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z e d ot t h e m e ta p h a s e e h or m o
-
s o m e s o f B
.
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.
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B
.
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,
B
.
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B
.
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.
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.
S t r o n g s i g n a l s w e r e d e t e e t e d i n e a e h
e h
r o m o s o m e s o f B
.
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.
m p a a n d B
.
n aP 琳 , t h e A a n d C g e n o m e s w e r e n o t d i s e r im i n at e d . T h e s e a t te r e d 5 19 -
n a ls d e t e e t e d i n B
.
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r e v e yr fa i n t a n d s m a l l
、
T h e 1 8 e h or m o s
o m e s s h o w e d s t or n g
s i g n a l s a n d t h e o th e r s h o w
w e a k s i g n a l s i n B
.
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,
t h e C a n d B g e n o m e e h or m o s
o m e s w e r e o bv i o u s l y d i s t in g u i s h
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.
T h e 2 0 e h r o m o s o m e s
s h o w e d s t r o n g 5 1即 a ls a n d th e o th e r s h o w w e a k s ig n a ls i n B . ]’u n e e a , th e A a n d B g e n o m e e h r o m o s o m e s w e r e a l s o
o b
v i o u s l y d is t i n g u i s h e d
.
T h e r e s u lt s i n d i e a te t h a t
,
i n th e e o u r s e o f lo n g 一 te r m e v o l u t io n , B
.
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r a e e a h a d v e叮
e lo s e d r e l a t i o n s h i p w i t h B
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n即 u s , d iv is i o n o f g e n o m e d e g r e e w a s r e l a t i v e l y l i t t l e ; a n d * h e r e l a t i o n s h i p
b e t w e e n B
、
o le ar e e a a n d B
.
n ig ar w a s r e l at i
v e l y fa r
,
th e d iv i s io n d e g r e e of th e g e n o m e w a s h i g h e
r th a n th e fo mr
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.
T h e r e l a t i o n s h i p b e wt e e n B
.
o lo ar e e a a n d B
.
j o n e e a
,
B
.
e a r in a , a w a s li e d b e t w e e n a b o
v e 一 m e n t i o n e d t w o .
K e y w o r d s : G
e n o m i e i n s i t u h y b r i di z at i o n ( G IS H ) ; B
r a s s i e a ; B
.
o le ar
e e a ; G e n o m i c d i v e r g e n e e