全 文 ：第 28卷　第 2期 西北农业大学学报 Vol. 28 No. 2
2000年 4月 Ac ta Univ . Ag ric. Bo reali-occidentalis Apr. 2000
[文章编号 ]1000-2782( 2000) 02-0080-05
农杆菌介导的芸薹属作物遗传转化研究进展⒇
张桂华 ,巩振辉 ,张广辉
(西北农林科技大学园艺系 ,陕西杨陵 712100)
　　 [摘　要 ]　从高频再生体系的建立、农杆菌的侵染方法、导入外源基因等方面综述了芸
薹属作物的遗传转化研究进展 ,并对研究中存在的再生成苗、转化率低和筛选方法等问题进
行了讨论。
[关键词 ]　芸薹属 ;农杆菌 ;遗传转化
[中图分类号 ]　 S634. 035　　　 [文献标识码 ]　 A
芸薹属 (B rassica)包括多种重要的蔬菜和油料作物 ,在农业生产中占有重要地位。近
年来 ,应用遗传转化方法已获得了多种芸薹属作物的转基因植株 [1 ] ,其中应用最广泛的是
农杆菌 ( Agrobacterium )介导法 [ 2]。农杆菌介导法具有易操作、转基因植株容易获得等优
点 ,对芸薹属作物更是如此 [3 ]。目前 ,在大多数种或变种上已建立了转化体系 ,获得了较高
的转化率。但现有转化体系对一些难以再生的种则无能为力 ,而且常规的筛选方法在芸薹
属作物上效果欠佳 [4, 5 ] ,对这些问题尚需进行深入研究。
1　高频再生体系的建立
建立高频的芽再生体系是农杆菌介导遗传转化成功的前提之一。尽管芸薹属作物具
有较好的组织培养基础 ,但不同种、变种、品种之间存在较大差异 ,而且受到外植体种类、
年龄、培养基组成等多种因素的影响。因此 ,建立高效、重演性强的再生体系一直是芸薹属
作物遗传转化研究的焦点之一。
1. 1　基因型的影响
许多研究 [6～ 9 ]表明 ,甘蓝型油菜 (B . napus )较白菜型油菜 (B . Chinensis Var. Oleif era
Makino et Nemo to )和芥菜型油菜 (B . juncea )容易再生与转化 ,而甘蓝及其变种 (同属于
B. oleracea )较白菜种 (B . campestris )容易再生得多。 白菜种的菜心 ( B. parachinensis
Bai l. )芽再生频率低 ,易在愈伤组织上先形成根 ,而抑制芽的形成 [10 ]。 Murata等 [7 ]的研究
表明 ,调控芽形成的基因可能位于 C基因组。因此 ,具有 C基因组的甘蓝和花椰菜等容易
再生 ,而缺少 C基因组的大白菜等 (具 AA基因组 )则困难得多。
1. 2　外植体的影响
1. 2. 1　外植体类型　外植体必须同时具备芽再生频率高、易为农杆菌侵染等特点 ,才能
成为良好的转化受体。 目前应用最多的外植体有无菌苗的子叶、下胚轴、根段以及大田植
⒇ [收稿日期 ]　 1999-01-10
　 [基金项目 ]　国家自然科学基金资助项目 ( 39770522) ;国家教育部优秀青年教师基金资助项目
　 [作者简介 ]　张桂华 ( 1972- ) ,女 ,在读硕士
株的花茎切段等。同种作物的不同外植体具有不同的芽分化频率和优缺点 ,需要通过试验
才能确定一种最佳的转化受体。 Damgaard等 [ 11]在甘蓝型油菜上发现 ,以子叶为外植体 ,
供试的 6个品种均获得转基因植株 ,而以下胚轴为外植体仅有 1个品种获得成功。
子叶等外植体具有简便、快速等优点 ,但其再生植株易为嵌合体 ,基因型也可能是杂
合的。 近年来以萌动种子或植株为农杆菌转化受体的研究也取得一些进展 [12, 13 ] ,其具有
不需组织培养等优点 ,具有深入研究的价值。
1. 2. 2　外植体的年龄　无菌苗的子叶和下胚轴等为外植体时 ,苗龄显著影响芽再生频
率。最常应用的苗龄为 4～ 7 d。菜心等发芽迅速 ,大约在播后第 3天子叶已平展 ,多用 4～
5 d龄苗 ;甘蓝和花椰菜等发芽则慢得多 ,在第 5天子叶才能充分展开 ,多采用 6～ 7 d龄
苗。卫志明等 [14 ]以甘蓝为材料发现 ,尽管苗龄相差非常小 ,但对下胚轴芽分化频率影响非
常大 ,苗龄为 5 d时 ,再生频率仅 18. 07% , 6 d时则为 64. 52%。
1. 2. 3　外植体极性　有研究 [ 15, 16]表明 ,以下胚轴和花茎为外植体时 ,极性是影响芽再生
的重要因素。一般认为 ,近根端容易产生根 ,远根端容易产生芽。在花椰菜上也发现 ,下胚
轴远根端易直接产生芽 ,且芽数量多 ;近根端再生芽较困难 ,且多产生在愈伤组织上。但也
有不同的结论。李树贤等 [17 ]在结球甘蓝上发现 ,下胚轴不定芽的发生没有明显极性。
1. 2. 4　外植体的部位　来自无菌苗的同种外植体 ,其不同部位的芽再生率也存在较大差
异。一般下胚轴的上部芽再生能力强 ,而下部再生能力弱。 Yang等 [18 ]的研究表明 ,埃塞俄
比亚芥菜下胚轴上部切段较下部切段早分化芽 ,芽再生率为 40. 4% ,而下部切段仅为
11. 3% 。在大白菜上则有相反的结论 [16 ]。
1. 2. 5　外植体的生理状态　黄菊辉等 [19 ]以发根农杆菌 ( A . rhizogenes )侵染茎用芥菜时
发现 ,带芽下胚轴比不带芽下胚轴生根率要高得多。 这可能与生长素的极性运输有关。
1. 2. 6　接种方法　许多研究 [ 8, 16, 20 ]表明 ,插植较平放芽再生率要高得多。菜心子叶柄插
入培养基 2 mm ,芽再生率可达 89% ,而平放仅为 46% [8 ]。插植的方向对芽再生也有显著
影响。 花椰菜下胚轴倒插较正插易再生芽 [9 ]。
1. 3　培养基组成
1. 3. 1　激素配比　寻求适当的激素配比是提高芽再生频率的重要途径。不同作物类型、
品种、外植体对激素组成的要求有较大差异。 BA是芸薹属作物转化中最常用的一种激
素 ,花椰菜、甘蓝等以子叶为外植体单独使用的质量浓度以 4～ 5 mg· L- 1为宜 ,与其他激
素相结合时质量浓度则应适当减小 [ 21]。
脱落酸 ( ABA)是组织培养中很少使用的一种激素 ,张鹏等 [ 8]的研究表明 ,低浓度的
脱落酸或与 AgNO3配合有促进菜心芽分化的作用。小白菜 ( B. chinensis )上有类似报
道 [22 ]。 ABA的作用需进一步深入研究。
1. 3. 2　 AgNO3的应用　由于基因型的影响 ,白菜种 (B . campeseris )芽再生频率极低 ,严
重影响了遗传转化的进行。 Jun等 [23 ]以根癌农杆菌侵染大白菜子叶仅获得 30%转化率 ,
在白菜型油菜上转化率仅为 7%～ 13% [24 ]。 Chi等 [25, 26 ]首先发现培养基中添加 AgNO3能
显著促进大白菜、小白菜和菜薹的子叶再生成芽 ,类似的报道也比较多 [8, 9, 22, 27 ]。应用这种
方法已在白菜型油菜 [24 ]、青菜 [28 ]上获得较高的转化频率。
AgNO3的作用机制尚未完全清楚。目前一般认为 Ag+ 是较好的乙烯活性抑制剂 ,能
81第 2期 张桂华等:农杆菌介导的芸薹属作物遗传转化研究进展
竞争性地作用于乙烯作用部位 ,防止外植体产生的过多乙烯对植株再生的抑制作用 [2 9]。
2　农杆菌侵染方法的研究
农杆菌介导的遗传转化是转化受体 (外植体 )与农杆菌相互作用的结果。 在转化中首
先要保证高侵染活力的农杆菌对受体的充分侵染 ,其次要求侵染后的外植体保持较高的
芽分化能力 ,以便获得转化芽。研究表明 [14, 21 ] ,侵染时间、菌液浓度、预培养和共培养时间
等都显著影响着农杆菌的侵染及转化芽的再生。
农杆菌的活化　农杆菌在侵染过程中 ,其 vi r基因受植物细胞释放的酚类物质的刺
激而活化 ,从而提高侵染能力。现多在农杆菌培养过程中加入酚类物质 ,提高农杆菌活力 ,
保证充分侵染。
预培养　外植体离体后立即侵染易引起褐化、腐烂 ,因此多在侵染前进行 2～ 3 d的
预培养。石淑稳等 [30 ]发现 ,甘蓝型油菜的下胚轴在含 2, 4-D的培养基上进行 2 d预培养
后 ,可显著提高芽再生率 ,认为 2, 4-D对芽的发生具有很强的启动作用 ,但预培养时间不
宜过长。甘蓝下胚轴经 4 d预培养后再侵染也易腐烂、褐化、死亡 [14 ]。
侵染时间和菌液浓度　侵染时间过长或浓度过大 ,易导致外植体褐化、死亡 ;反之 ,则
可能未被侵染。目前侵染时间多采用 3～ 5 min,菌液浓度差别非常大 ,一般多采用处于对
数生长期 ( OD600约为 0. 3～ 0. 5)的农杆菌或者适当稀释一定倍数。
共培养时间　农杆菌侵染后的外植体要在不含抗生素的培养基上共培养一段时间 ,
以利于农杆菌的充分侵染。共培养时间因作物种类、外植体类型而异。时间过长易引起外
植体褐化 ,过短则转化率降低。 以甘蓝型油菜的子叶柄为外植体时共培养时间以 60～ 72
h为宜 [21 ]。
抑菌剂的选择　共培养后 ,外植体表面和内部残留的农杆菌非常容易引起污染 ,从而
影响不定芽再生。 一般采用抑菌剂来抑制农杆菌的繁殖 ,常用的抑菌剂有羧苄青霉素
( Ca rbenicil lin, Cb)和头孢霉素 ( Cefotaxime, Cef )等。 良好的抑菌剂应具有仅抑制农杆菌
的生长而不影响芽再生的特点。佘建明等 [31 ]发现 , Cef抑制甘蓝下胚轴芽的再生 ,而 Cb对
芽再生无影响 ;卫志明等 [ 14]则发现 Cef优于 Cb。 程振东等 [4 ]以甘蓝型油菜子叶柄为外植
体得到类似结论。 因此 ,必须确定合适的抑菌剂及浓度。
3　导入的外源基因
目前导入芸薹属作物的外源基因主要有: 苏云金芽孢杆菌的 B. t基因 [14, 16, 32～ 35 ]和蛋
白酶抑制剂基因 [31 ]、病毒外壳蛋白基因 [ 21, 36]、雄性不育基因 [37 ]、雄性不育抑制基因 [38 ]等。
这些目的基因的导入为芸薹属作物的品质改良提供了有效手段。
4　存在问题
再生成苗问题是芸薹属转化的首要难题。 芸薹属作物中组培基础较好的报道主要集
中在甘蓝型油菜等几个材料上 ,对于大白菜、菜薹等作物 ,由于基因型的影响 ,再生不定芽
的频率很低 ,需要不断研究适合该材料不定芽再生的各种因素 ,以建立一个重复性高的高
效再生体系。
转化率低是芸薹属转化面临的又一问题。目前 ,一些芸薹属作物转化率可高达 50% ,
82 西北农业大学学报 第 28卷
但由于转化受体不同 ,即使是同一作物转化率也存在很大差异。如甘蓝型油菜 ,以子叶为
外植体进行转化 ,转化率为 55% ,而以花粉胚和小孢子为外植体 ,转化率仅为 0. 29%和
0. 09% 。因此 ,如何提高转化率 ,建立高效重复性高的转化系统仍是今后研究的重要课题。
筛选方法问题也是芸薹属作物遗传转化过程中不容忽视的问题。应用于芸薹属作物
转化的筛选剂种类很多 ,最常用的是卡那霉素 ,应用卡那霉素筛选不乏成功的报
道 [4, 14, 21, 31 ] ,但有的学者认为 [5 ] ,卡那霉素影响芸薹属作物转基因植株的获得。还有的试验
表明 [ 16] ,共培养后 ,分化培养基中直接加入卡那霉素 ,阻止了外植体的分化 ,恢复一段时
间再加入可以形成转化组织。总之 ,选择合适的筛选方法在芸薹属转化中十分重要。
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Agrobacterium -mediated genetic transfo r-
ma tion of Brassica crops
ZHANG Gui-hua,GONG Zhen-hui, ZHANG Guang-hui
(Depar tment of Hort icul ture, Northwest Scien ce and Technology Un iversity of
Agr icul ture and Forest ry ,Yangl in g ,Shaanxi 712100,China)
Abstract: In this review , advances and problems on the study of Agrobacterium -
media ted genetic t ransfo rmation o f Brassica , such as establishment of ef ficient plant
reg eneration system and infection method a re represented.
Key words: B rassica; Agrobacterium ; g enetic t ransformation
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