全 文 ：收稿日期:2009-06-14;　修订日期:2009-11-16
基金项目:江西省卫生厅科技计划项目资助(No.20062017);
江西省教育厅科学技术研究项目资助(No.GJJ09013)
作者简介:刘玉琳(1973-),女(汉族),江西上饶人 ,现任南昌大学医学院
讲师 ,学士学位 ,主要从事变态反应学研究工作.
PLGA-蒿属花粉纳米疫苗对小鼠过敏性哮喘
治疗作用及机制的实验研究
刘玉琳1 ,杨　慧 2 ,余克花1 ,刘志刚 3 ,崔晓民 1
(1.南昌大学 ,江西 南昌　330006;　2.广东省深圳市慢性病研究所 ,广东 深圳　518060;
3.深圳大学过敏反应与免疫学研究所 ,广东 深圳　518060)
摘要:目的 研究以聚乳酸 -羟基乙酸共聚物 [ poly(D, L-lactic-co-glycolic)acid, PLGA]为佐剂制备的蒿属花粉纳米
疫苗对小鼠过敏性哮喘模型气道炎症治疗的疗效 , 并探讨其免疫治疗机制。方法 40只小鼠随机分为 5组:对照组 、模
型组 、空白粒子治疗组(治疗 A组)、蒿属花粉粗浸液治疗组(治疗 B组)、PLGA-蒿属花粉治疗组(治疗 C组)。用蒿属
花粉建立哮喘模型。对照组用生理盐水代替致敏。 ELISA法检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和脾细胞培养上清
液(SCCS)中 IL-4, IFN-γ的含量;收集 BALF进行总细胞计数和嗜酸性粒细胞计数;HE染色观察各组小鼠肺组织病理
变化。结果 肺部组织学和 BALF中细胞计数结果显示 ,与模型组相比 , B、C组的肺部嗜酸性粒细胞浸润显著减轻 , BALF
中总细胞和嗜酸性细胞显著减少;细胞因子的测定结果显示 , 在 BALF中 , 模型组的 IL-4和 IFN-γ分别为(88.71 ±
6.82)pg/ml和(24.14±2.91)pg/ml, 与之相比 ,蒿属花粉粗浸液治疗组(40.07±2.42)pg/ml和 PLGA-蒿属花粉治疗
组(38.31±6.28)pg/ml的 IL-4显著降低(P<0.01);PLGA-蒿属花粉治疗组(63.69±8.0)pg/ml的 IFN-γ显著升
高(P<0.01);在 SCCS中 , 模型组的 IL-4和 IFN-γ分别为(81.02±12.5)pg/ml和(34.12±4.64)pg/ml, 与之相比 ,
蒿属花粉粗浸液治疗组(58.91±9.10)pg/ml和 PLGA-蒿属花粉治疗组(41.30±4.75)pg/ml的 IL-4分泌显著减少
(P<0.01);PLGA-蒿属花粉治疗组(82.50±5.63)pg/ml的 IFN-γ显著增高(P<0.01)。结论 PLGA-蒿属花粉纳
米疫苗免疫治疗小鼠哮喘有良好疗效。其机制可能与调节 Th1/Th2平衡有关。
关键词:聚乳酸 -羟基乙酸共聚物;　哮喘;　蒿属花粉;　纳米粒子;　免疫治疗
中图分类号:R392.8　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)03-0600-02
　　过敏性疾病是目前世界性重大卫生问题之一 ,常见的有过敏
性哮喘和过敏性鼻炎等。 哮喘是一种以肺部嗜酸粒细胞浸润和
对各种激发因子产生气道高反应为特征的慢性气道炎性疾病 ,是
一种常见病和多发病 ,且发病率有逐年上升的趋势 [ 1 , 2] 。目前认
为 , 哮喘的发生与机体的 Th1/Th2免疫功能失衡有关 ,哮喘患者
体内 T细胞趋向于产生高水平的 Th2细胞因子(IL-4、IL-5
等),而 Th1细胞因子(IFN-γ)水平相对较低 [ 3] 。
聚乳酸 -羟基乙酸共聚物(PLGA)是一种生物相容性良好
的可降解材料 [ 4] , 可促进变应原直接被抗原呈递细胞吸收 , 在生
物体内缓慢释放变应原。 Scholl等 [ 5]的实验证实 , 用 PLGA包裹
变应原可有效地诱导抗体 IgG的产生 ,但 PLGA-蒿属花粉纳米
疫苗在治疗小鼠哮喘的作用目前未见相关报道。本实验通过物
理方法制备包裹蒿属花粉变应原的 PLGA纳米疫苗 , 研究该疫
苗对蒿属花粉变应原诱导的小鼠哮喘的免疫保护作用 , 并探讨
其作用机制。
1　材料
动物选用健康 Balb/C小鼠 40只 , 4 ～ 6周龄 , 雌雄不限 ,体质
量(18±2)g。
2　方法
2.1　蒿属花粉变应原的制备 按杨慧等 [ 6]的方法进行。
2.2　PLGA-蒿属花粉纳米粒子的制备 采用超声乳化法 , 以
PLGA为包裹材料 , 制备 PLGA-蒿属花粉纳米粒子。 将 50 mg
的 PLGA溶于 1 ml的二氯甲烷中 , 再加入蒿属花粉变应原 100
μl,混旋 1 min, 超声乳化 30 s, 再加入 2%的聚乙烯醇(PVA)2
ml, 混旋 1 min, 超声乳化 30 s, 最后将上述溶液滴入正在搅拌状
态的 50ml的双蒸水中 , 使之迅速分散 , 低速搅拌 4 h,以挥发有
机溶剂。扫描电镜观察粒子形态和大小 , BCA蛋白质定量法测
定纳米粒子载药量。
2.3　小鼠哮喘模型的建立和免疫治疗 40只小鼠随机分为 5
组:对照组 、模型组 、治疗 A组(空白粒子组)、治疗 B组(蒿属花
粉粗浸液组)、治疗 C组(PLGA-蒿属花粉治疗组)。第 1天 , 模
型组和治疗组小鼠腹腔注射(i.p.)致敏液 [ 1 mgAl(OH)3 +10
μg蒿属花粉变应原 ]后 , 治疗组分别用空白粒子 、蒿属花粉粗浸
液 、纳米粒子 -蒿属花粉 s.c.进行免疫治疗。第 8, 15, 22天再次
用相同的致敏液致敏 ,处死小鼠的前 3 d给予 0.2%变应原浸液
滴鼻(i.n.), 连续 3 d, 1次 /d, 诱发哮喘发作。 对照组用生理盐
水代替致敏。
2.4　实验动物的处死及标本采集 颈椎脱臼法处死小鼠 ,气管插
管 , 用预冷的 PBS进行肺泡灌洗 , 每次注入 PBS液 0.8 ml,重复 3
次 , 要求回收率大于 75%且无血液混入。收集支气管肺泡灌洗
液(BALF)。无菌操作完整分离动物脾脏 , 制备脾细胞悬液 , 于
CO
2
恒温培养箱培养 72 h, 收集脾细胞培养上清液(SCCS), 于
-70℃保存。分离动物肺脏 , 置于 10%甲醛组织固定液 , 4℃保
存。
2.5　支气管肺泡灌洗液细胞计数 将所收集的 BALF离心 ,取细
胞沉淀 ,用 0.4 mlPBS液重新混悬 , 计数细胞总数 , 并涂片行瑞
氏染色 ,油镜下记数 300个细胞 ,进行白细胞分类。
2.6　BALF及 SCCS中细胞因子水平检测 按照 IFN-γ、IL-4
相应 ELISA试剂盒说明书上的实验步骤规范操作 , 酶标仪检测
A450值。
2.7　肺组织病理切片制备及观察 将保存于 10%甲醛组织固定
液中过夜的肺组织进行常规取材 , HE染色。光学显微镜 40 ×物
镜随机视野观察肺组织形态 、气道上皮损伤 、气管及血管周围嗜
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酸性粒细胞(Eos)炎性浸润情况;选择视野进行显微摄影。
2.8　统计学分析 运用统计软件SPSSforWindowsVer12.0进行
实验数据的统计分析处理 ,实验数据以 x±s表示 ,组间差异性进
行两样本 t检验 ,以 P<0.05为差异具有统计学意义。
3　结果
3.1　PLGA-蒿属花粉纳米疫苗的特征 PLGA-蒿属花粉纳米
疫苗在扫描电镜下呈椭圆形 、光滑的颗粒(图 1), 其平均粒径为
550 ～ 750 nm。蒿属花粉的载药量为 400μg/10 mg(即为 4%)。
图 1　蒿属花粉 -纳米粒子的扫描电镜图谱
3.2　支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数和嗜酸粒细胞计数
对照组 BALF中的细胞总数较少 , 细胞分类以单核细胞和淋巴细
胞为主 , 占 85%以上;与对照组相比 ,模型组 BALF中的细胞总数
和嗜酸粒细胞明显增加(P<0.01);与模型组相比 , 蒿属花粉粗
浸液治疗组和 PLGA-蒿属花粉治疗组的细胞总数和嗜酸性粒
细胞显著减少(P<0.01), 空白粒子组与模型组相比无明显改
变。见表 1。
表 1　BALF中总细胞数和嗜酸粒细胞数( x±s)
组别 细胞总数 嗜酸性粒细胞
对照 23.06±4.71＊ 0
模型 72.10±19.57 17.31±3.61
空白粒子 65.61±10.38 15.04±5.00
蒿属花粉 37.49±10.27＊ 10.55±2.42＊
PLGA-蒿属花粉 39.47±14.52＊ 9.51±1.56＊
　　与模型组比较 , ＊P<0.01
3.3　BALF及 SCCS中细胞因子水平检测 在 BALF中 , 模型组的
IL-4和 IFN-γ分别为(88.71±6.82)pg/ml和(24.14±2.91)
pg/ml, 与之相比 ,蒿属花粉粗浸液治疗组(40.07±2.42)pg/ml
和 PLGA-蒿属花粉治疗组(38.31±6.28)pg/ml的 IL-4显著
降低(P<0.01);PLGA-蒿属花粉治疗组(63.69±8.0)pg/ml
的 IFN-γ显著升高(P<0.01),蒿属花粉粗浸液治疗组(30.87
±4.63)pg/ml的 IFN-γ无明显改变(P>0.05);在 SCCS中 , 模
型组的IL-4和 IFN-γ分别为(81.02±12.5)pg/ml和(34.12
±4.64)pg/ml, 与之相比 , 蒿属花粉粗浸液治疗组(58.91 ±
9.1)pg/ml和 PLGA-蒿属花粉治疗组(41.3±4.75)pg/ml的
IL-4分泌显著减少(P<0.01);PLGA-蒿属花粉治疗组(82.5
±5.63)pg/ml的 IFN-γ显著增高(P<0.01), 蒿属花粉粗浸
液治疗组(40.45 ±5.67)pg/ml的 IFN-γ无明显改变(P>
0.05)。见图 2和图 3。
3.4　肺组织病理学检察 与对照组相比 , 模型组小鼠的支气管 、
细支气管上皮下和小血管周围有明显的炎性细胞浸润 ,以嗜酸性
粒细胞为主 , 气道上皮结构紊乱 , 有部分脱落 , 肺泡间质增厚 ,也
可见到炎性细胞浸润。 治疗 B、C组小鼠肺组织切片观察可见 ,
炎症反应明显减轻 , 炎性细胞浸润较模型组显著减少 ,气道上皮
结构基本恢复正常。
4　讨论
过敏性支气管哮喘是 I型速发型变态反应性疾病 , 是以气道
高反应性 、肺部嗜酸细胞性炎症为特征。哮喘在发病的过程中 ,
起主要作用的是T淋巴细胞 ,是以 Th2型反应为主要特征的免疫
反应。其 Th2反应增强而 Thl反应减弱 , 导致机体 Thl/Th2失衡。
因此调节 Th1/Th2 的反应失衡对哮喘有预防及免疫治疗作
用 [ 7] 。
　　 1.对照组　 2.哮喘组　　　　　　　　　 1.对照组　 2.哮喘组
　　 3.空白粒子组 　　　　　　　　　　　　 3.空白粒子组
　 4.蒿属花粉粗浸液治疗组　　　　　　 4.蒿属花粉粗浸液治疗组
　 5.PLGA-蒿属花粉治疗组　　　　　　　 5.PLGA-蒿属花粉治疗组
　(IL-4:4、 5vs2, P< 0.01　　　　　　(IL-4:4、5vs2, P< 0.01
　IFN-γ:5vs2 , P< 0.01)　　　　　　　IFN-γ:5vs2 , P< 0.01)
　　图 2　BALF中 IL-4, 　　　　　　　　　　图 3　SCCS中 IL-4,
　　IFN-γ水平(pg/ml)　　　　　　　　　IFN-γ水平(pg/ml)
本实验通过腹腔注射致敏 ,并用多次滴鼻的方法成功使用蒿
属花粉提取液制作出 BALB/c小鼠的肺部炎症模型。与对照组
相比 , 模型组 BALF和 SCCS中 IL-4的浓度显著增多 , 而 IFN-γ
中的浓度显著减少 ,结果显示 Th2型的细胞因子占优势;模型组
BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞数量显著增加;在肺组织切
片中可观察到模型组小鼠气道粘膜明显水肿 , 粘膜基底层增厚 ,
气道粘膜层 、粘膜下层 、血管周围组织 、肺泡壁及肺泡腔内有大量
炎性细胞浸润 ,以嗜酸性粒细胞为主 , 肺泡腔巨噬细胞也增多 , 肺
泡膈增厚。这些都证实我们成功构建了蒿属花粉致敏的 BALB/
c小鼠哮喘动物模型。
A-模型组　B-蒿属花粉粗浸液组　C-PLGA纳米粒子组
图 4　肺组织病理变化(HE染色 , 200×)
乳酸 -羟基乙酸共聚物(PLGA)是研究中常用的疫苗控释
载体材料。PLGA纳米粒包裹或吸附的蛋白质一般在 24 h内经
历首次突发释放 ,可占其负载量的 50%,其后进入缓慢释放的阶
段长达一月之久 ,可减低大剂量变应原诱导的副作用。 PLGA最
终在体内降解为二氧化碳和水 , 已经被美国 FDA批准可以作为
临床药用的辅助材料 ,在临床上已证实其大剂量安全性 [ 8] ,具有
良好的临床应用前景。喻海琼等 [ 9]研究表明 , 以 PLGA为佐剂包
裹 OVA纳米疫苗 , 制成生物可降解型聚合物纳米粒子 , 可预防
哮喘嗜酸性气道炎症 ,其可能的机制之一是调节了过敏性哮喘的
Thl/Th2失平衡反应。
本实验证实 ,在蒿属花粉粗浸液和 PLGA治疗组中 , BALF中
细胞总数和嗜酸性粒细胞计数比模型组显著降低;BALF和 SCCS
中 , IL-4的浓度比模型组浓度显著降低;同时 , PLGA治疗组 IFN
-γ浓度比模型组显著增高 ,而蒿属花粉粗浸液组与模型组无统
计学差异;分析其原因可能是 PLGA-蒿属花粉纳米粒子可选择
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性激发 Th1CD+4 T细胞的免疫应答 , 分泌 IFN-γ, 该结果与 Ba-
tanero等 [ 10]的研究结果相吻合。由肺组织病理变化的实验结果
可见 , 蒿属花粉粗浸液和 PLGA治疗组可明显抑制气道炎症现
象 , 即气道上皮结构较正常 , 无明显嗜酸性粒细胞浸润。这说明
PLGA-蒿属花粉纳米疫苗不仅具有与蒿属花粉粗浸液相同的下
调 Th2细胞因子表达和抑制嗜酸性粒细胞的作用 ,而且还具有蒿
属花粉粗浸液所没有的诱导 Thl细胞因子表达的作用 , 说明其可
能通过调节 Thl/Th2平衡而达到对哮喘的有效预防和治疗。因
此 , 新型 、安全的 PLGA-蒿属花粉变应原纳米疫苗有望成为治
疗变态反应性疾病的一种新途径。
参考文献:
[ 1] 　RosenstreichDL, ModayHJ, HudesG.Asthmaandtheenvironment
[ J] .JAsthma, 2003, 40(Suppl):23.
[ 2] 　VargasMH, Diaz-MejiaGS, FuruyaME, etal.Trendsofasthmain
Mexico:an11-yearanalysisinanationwideinstitution[ J].Chest,
2004, 125:1993.
[ 3] 　MazarelaG, BiancoA, CatenaE, etal.Thl/Th2lymphocytepolari-
zationinasthma[ J] .Alergy, 2000, 55(suppl61):6.
[ 4] 　汪自然 ,徐启勇 ,叶燕青.复乳法制备聚乳酸及其共聚物微球参数
的研究进展 [ J] .国际生物医学工程杂志 , 2006, 29(4):238.
[ 5 ] 　ScholI, WeissenbockA, Forster-WaldlE, etal.Alergen-loaded
biodegradablepoly(D, L-lactic-co-glycolic)acidnanoparticles
down-regulateanongoingTh2responseintheBALB/cmousemodel
[ J] .ClinExpAlergy, 2004, 34:315.
[ 6 ] 　杨　慧 ,刘志刚 ,韩庆国.艾蒿花粉主要变应原的分离 、纯化与鉴定
[ J] .中华微生物学与免疫学杂志 , 2005, 25(1):73.
[ 7 ] 　WildJS, SigounasA, SurN, eta1.IFN-γinducingfractor(IL-18)in-
creaseallgergicsensitization.SerumIgE, Th2 cytokines, andairway
eosinophihainamousemodelofalergicasthma[ J].JImmunol, 2000,
164(5):2701.
[ 8 ] 　GuefinC, 0liviA, WeingartJD, etal.Recentadvancesinbraintulnorth-
erapy:localintracerebraldrugdeliverybypolymers[ J].InvestNew
Drugs, 2004, 22(1):27.
[ 9 ] 　喻海琼 ,刘志刚 ,曾　琼.PLGA为佐剂的 OVA纳米疫苗皮下注射
可预防小鼠过敏反应性气道炎症和调节Thl/Th2反应 [ J].免疫学
杂志 , 2007, 23(4):366.
[ 10]　BatanemE, BaralP, VilalbaM, etal.EncapsulationofOlee1inbio-
degradablemicmparticlesinducesTh1responseinmice:apotentialvac-
cineforalergy[ J] .JControlRe1ease, 2008, 92(3):395.
收稿日期:2009-06-08;　修订日期:2009-09-27
基金项目:泰山医学院重点资助项目(No.2007ZR001);
泰山医学院青年基金项目(No.2009ZRQN033)
作者简介:姚树桐(1977-),男(汉族),山东济宁人 ,现任泰山医学院讲师 ,
硕士学位 ,主要从事缺血再灌注损伤发生机制及防治研究工作.
＊通讯作者简介:王家富(1949-), 男(汉族),山东滕州人 , 现任泰山医学
院教授 , 硕士研究生导师 , 学士学位 ,主要从事心血管病发生机制及防治
研究工作.
蜂胶水提液对肠缺血再灌注大鼠肺损伤的保护作用
姚树桐 ,桑　慧 ,商战平 ,王家富＊ ,于凤秀 ,司艳红 ,金正贤
(泰山医学院 ,山东 泰安　271000)
摘要:目的 研究蜂胶水提液(WEP)对肠缺血 /再灌注(I/R)大鼠肺损伤的保护作用 , 并探讨其机制。方法 40只健康雄
性 Wistar大鼠随机分为假手术(Sham)组 、I/R组和 WEP(50, 100, 200 mg· kg-1)组 , 以无创动脉夹夹闭肠系膜上动脉 45
min,再灌注 2 h建立肠 I/R模型 ,采集动脉血进行血气分析 , 测定肺系数判定组织水肿情况 , 光镜下观察肺组织病理学改
变 , 试剂盒测定血浆和肺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果 与 I/R组比较 , WEP组 PaO2升
高而 PaCO2降低(P<0.05), 肺系数减小(P<0.05)且肺组织病理变化减轻;WEP剂量依赖性地抑制肠 I/R所致的血浆
和肺组织 SOD活性降低和 MDA含量升高 (P<0.05)。结论 蜂胶水提液可减轻肠 I/R大鼠肺损伤 , 其机制与增强抗氧
化能力 、抑制脂质过氧化反应有关。
关键词:蜂胶水提液;　肠缺血再灌注损伤;　肺损伤;　脂质过氧化
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)03-0602-02
　　肠缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤是严重创伤 、
休克 、心肺功能不全等救治过程中共有的病理过程 , 不仅导致肠
组织本身损伤 , 且对远隔器官尤其是肺的结构和功能产生广泛影
响 , 甚至导致多器官功能障碍综合症(multipleorgandyfunction
syndrome, MODS)[ 1] 。目前认为 , 氧自由基大量生成导致组织脂
质过氧化是器官组织损伤尤其是肠 I/R损伤的主要机制之
一 [ 2] , 因此拮抗自由基损伤对防治肠 I/R致多器官损伤具有重
要意义。蜂胶是蜜蜂采集植物幼芽分泌物和树脂等并混入其上
鄂腺分泌物混合加工而成的一种胶状物 ,黄酮类化合物为其基本
成分。药理研究表明 [ 3]蜂胶具有明显抗氧化 、抗炎 、抗肿瘤及保
护血管内皮细胞等作用。 本课题组既往已经证实蜂胶水提液
(waterextractofpropolis, WEP)可减轻大鼠小肠 I/R损伤(待发
表),但蜂胶对肠 I/R所致肺损伤是否具有保护作用? 其机制是
否通过抑制脂质过氧化实现? 上述问题的解决将为深入认识蜂
胶的药理作用提供新的思路。本实验在大鼠肠 I/R损伤模型上 ,
研究蜂胶对肺组织损伤的影响 ,并探讨其保护机制。
1　材料与方法
1.1 　蜂胶提取与试剂 蜂胶水提液(WEP)按照本室既往报
道 [ 4]的方法提取 , 即采集新鲜泰山松柏蜂胶 , 置 -20℃过夜后粉
碎 , 与三蒸水按固液比 1∶4的比例浸泡 1 h,于超声波清洗器中
超声 20min,静置 2 h, 重复超声 20 min,静置 2 h, 过滤至上清液
澄清。按芦丁标准品法测水提液中总黄酮质量浓度为 33.8 g·
L-1 , 将提取液置棕色瓶中 4℃保存备用 , 用前以蒸馏水配成所需
浓度。 超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)和丙二醛
(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究
所产品 ,其余化学试剂为国产分析纯产品。
1.2 　动物 清洁级健康雄性 Wistar大鼠 , 体质量(250±25)g,
由山东中医药大学实验动物中心提供 , 许可证号为 SCXK(鲁)
2007-0017。
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