全 文 ：华北农学报·2010，25(增刊) :38 -40
收稿日期:2010 － 04 － 08
基金项目:国家环境保护部全国生物物种资源联合执法检查和调查项目(物种 09 －二 － 3 － 1)
作者简介:朱蕊蕊(1985 －) ，女，山东人，在读博士，主要从事园林植物遗传育种研究。
通讯作者:张启翔(1956 －) ，男，湖北人，教授，博士生导师，主要从事园林植物种质资源和遗传育种研究。
耧斗菜属 AFLP体系的建立和优化
朱蕊蕊1，高亦珂1，张启翔1，2
(1．北京林业大学 园林学院，观赏园艺系，北京 100083;
2．国家花卉工程技术研究中心，北京 100083)
摘要:通过对 AFLP反应体系的主要的四个影响因素:Mg2 +、dNTPs、Taq酶、引物进行四水平筛选试验，利用三种
耧斗菜 Aquilegia parviflora、A． viridiflora、A． vulgaris优化了耧斗菜属的 AFLP反应体系，采用 64 对引物组合对三种耧斗
菜进行了 PCR扩增和聚丙烯酰胺电泳检测。其中 9 对引物组合表现出较高的稳定性、清晰度和多态性。初步建立了
耧斗菜的 AFLP反应体系，得到质量比较好的 AFLP胶图。从而为 AFLP分子标记技术应用于耧斗菜属的研究奠定坚
实基础。
关键词:AFLP反应体系;耧斗菜;PCR;聚丙烯酰胺凝胶电泳
中图分类号:S68． 03 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2010)增刊 － 0038 － 03
Optimization of AFLP of Aquilegia
ZHU Rui-rui1，GAO Yi-ke1，ZHANG Qi-xiang1，2
(1． Department of Ornamental Horticulture，College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，
Beijing 100083，China;2． China National Engineering Research Center for Floriculture，Beijing 100083，China)
Abstract:In this study，the design was used to optimize AFLP-PCR amplification system on Aquilegia on four
levels of four factors(Mg2 +，dNTPs，Taq polymerse and primer)． The amplification was performed using 64 pairs of
primer combination and the products were separated on 6% polyacrylamide gels． 9 pairs of primer combination can
produce scorable，clear，suitable and polymorphic bands． According to these experiments，the AFLP-PCR amplifica-
tion system of Aquilegia was constucted and AFLP fingerprint was obtained． This optimized system for AFLP would
become one of the protocols for further research on Aquilegia．
Key words:AFLP;Aquilegia;PCR;PAGE
耧斗菜(Aquilegia)为毛茛科(Ranunculaceae)野
生宿根花卉，因其表型的多样性、生境分布的广泛性
被应用于生态与进化育种学研究 50 年之久。该种
世界有 70 余种，广泛分布于北美、欧洲、亚洲等温带
地区，我国分布 13 种。耧斗菜染色体组小(n = 7，
1C = 302 ～ 400 Mb) ，可自花受精结实率高。另外，
Aquilegia 系统发生学地位介于双子叶模式植物(如
拟南芥)和稻草类模式植物(如水稻)之间［1 － 3］。开
展大量的生理学、形态学、遗传学等方面的功能研
究，对被子植物的进化比较研究具有非常重要的意
义。我国耧斗菜植物资源丰富，广泛分布在华北、东
北、西南等地，但目前研究甚少［4］。
扩增片段长度多态性(AFLP)是一种检测 DNA
多态性的分子标记技术［5］，是 RFLP 和 RAPD 相结
合的产物，其多态性丰富，DNA 用量少，灵敏度高，
重复性高，不受环境的影响，被认为是一种十分理想
的、高效的分子标记技术，已被广泛应用于遗传图谱
构建、基因定位、亲缘关系、遗传多样性分析、品种分
类与鉴定、数量性状基因定位等多方面的研
究［6 － 12］。
本试验将 AFLP 技术应用于耧斗菜属植物，期
望建立和优化 AFLP 的反应体系，为以后该属植物
的杂种鉴定、亲缘关系和遗传多样性分析和数量性
状定位研究奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 植物材料
供试材料为小花耧斗菜(Aquilegia parviflora)、
增刊 朱蕊蕊等:耧斗菜属 AFLP体系的建立和优化 39
耧斗菜(A． viridiflora)、欧耧斗菜(A． vulgaris)一年生
幼苗，栽培在北京林业大学北林科技股份有限公司
的胖龙温室内。
1． 2 试剂与仪器
试验所用试剂(Taq 酶、dNTPs、Mg2 + 及 PCR
Buffer)为北京拜尔迪生物技术有限公司的 Promega
产品，Primer由北京奥科生物技术有限责任公司合
成，其中 AFLP引物参考 Hodges［13］采用的 8 个 Mse
Ⅰ和 8 个 EcoR Ⅰ引物，组合成 64 对引物组合，引物
序列详见表 1。
表 1 AFLP引物序列
Tab． 1 The sequence of AFLP primers
编号 No． 序列 Sequence 编号 No． 序列 Sequence
MesI-47 5-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3 EcoR I-32 5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3
MesI-48 5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 EcoR I-33 5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3
MesI-49 5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3 EcoR I-35 5-GACTGCGTACCAATTCACA-3
MesI-50 5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3 EcoR I-36 5-GACTGCGTACCAATTCACC-3
MesI-59 5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3 EcoR I-37 5-GACTGCGTACCAATTCACG-3
MesI-60 5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3 EcoR I-38 5-GACTGCGTACCAATTCACT-3
MesI-61 5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3 EcoR I-40 5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3
MesI-62 5-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3 EcoR I-41 5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3
试验所用仪器为:英国 TECHNE TC-512 PCR
仪，北京六一仪器厂的 DYY-12C 水平电泳仪和 DY-
CZ-6C垂直电泳仪，美国 BIO-RAD Gel Doc XR凝胶
成像仪。
1． 3 基因组 DNA的提取
采用 TIANGEN植物基因组 DNA 提取试剂盒，
从三种植物材料幼嫩叶片中提取 DNA，使用 Quanti-
ty One软件粗略测定 DNA浓度。
1． 4 PCR扩增及电泳分析
预扩程序为:94℃ 4 min;94℃ 30 s，65℃ 30 s，
72℃ 1 min，30 个循环;72℃ 10 min，4℃保存。预扩
产物采用 1% (V /V)琼脂糖凝胶电泳分析，含
0. 01%的 GelRed，电泳缓冲液为 1 × TAE，60 V恒压
电泳，待指示色带移至胶板前端约 2 /3 处时，进行凝
胶成像分析，检测预扩增结果。
选扩程序为:94℃ 4 min;94℃ 30 s，65℃ 30 s，
每个循环降低 0． 7℃，56． 6℃ 30 s，12 个循环;72℃
延伸 1 min;94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个
循环;72℃延伸 10 min，4℃保存。选扩产物经 94℃
变性 10 min后，通过 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，
采用银染法显带，待胶自然晾干后统计条带。
表 2 AFLP反应体系的因素 －水平
Tab． 2 Factors-levels of AFLP-PCR
水平
Level
因素 Factors
Mg2 +
/(25 mmol /L)
dNTPs
/(10 mmol /L)
Taq酶
/(5 U /μL)
Taq polymerase
引物
/(50 ng/μL)
Primer
1 1． 0 0． 1 0． 5 0． 4
2 1． 2 0． 2 1． 0 0． 6
3 1． 5 0． 3 1． 5 0． 8
4 2． 0 0． 4 2． 0 1． 0
1． 5 AFLP反应体系的优化
对 AFLP 反应体系的四个影响因子 Mg2 +、
dNTPs、Taq酶、引物进行四水平正交试验(表 2)。
除上述因素外，每管加入 4 μL的 5 × PCR Buffer，用
无菌双蒸水补足至 20 μL的反应体系。
2 结果与分析
2． 1 AFLP体系的建立
2． 1． 1 DNA质量和酶切连接 酶切连接是后续预
扩和选扩的基础，若酶切不充分，则不能充分反映
DNA中酶切位点和酶切片段的长度多态性。模板
DNA的纯度和浓度是酶切连接是否成功的关键因
素，若得到的 DNA不纯，其中含有的多糖、多酚类物
质和其他杂质会影响限制性内切酶的活性导致酶切
不完全，导致测序胶上的高分子量区域见到较多的
扩增带，甚至形成一片弥散，不能进行分析;DNA 量
过多也会导致酶切不完全，过少则模板浓度低。
本研究所得 DNA纯度高，结构完整，带型一致，
无降解现象，符合 AFLP 对 DNA 模板的要求，比较
了 DNA 不同用量和酶切时间的酶切效果，结果表
明:利用 5 U限制性内切酶酶切 3 h 可以在20 μL的
反应体系中完全切割 300 ng 的纯度较高的 DNA，得
到的条带均匀弥散，浓度大小均满足预扩增的要求。
2． 1． 2 预扩增 AFLP反应中预扩增的主要目的是
选择性的纯化得到的酶切片段并为选择性扩增提供
足够的模板。预扩的成败直接关系到后续的选扩和
电泳分析。预扩产物的分子量大小范围是扩增的关
键因素，分子量大小应该在 1 500 bp以下，产物主要
集中在 400 ～ 500 bp左右最佳。
本研究取 5 μL 酶切产物，在含有 1． 2 mmol /L
Mg2 +、0． 3 mmol /L dNTPs、1 U Taq、预扩增引物 E-00
和 M-00 分别为 50 ng 的 20 μL 反应体系中进行预
扩增，产物符合 AFLP分析的要求(图 1)。
40 华 北 农 学 报 25 卷
M． 100 bp DNA ladder;1 ～ 9．耧斗菜预扩产物。
M． 100 bp DNA ladder;1 － 9． Products of pre-amplification．
图 1 AFLP反应体系中预扩增结果
Fig． 1 Products of pre-amplification
2． 1． 3 选择性扩增 预扩产物稀释 30 倍后在含有
1． 2 mmol /L Mg2 +、0． 3 mmol /L dNTPs、1 U Taq、预扩
增引物 E-＊＊＊和 M-＊＊＊分别为 50 ng 的 20 μL 反
应体系中进行选择性扩增，可以达到理想的试验结
果。首次做 AFLP时，为了避免人力物力的浪费，可
在凝胶电泳之前预先取少量选择性扩增产物在 1%
琼脂糖胶上进行检测，良好的选扩产物在琼脂糖上
呈现深浅不一的条带，由于引物组合范围不同因此
其弥散条带不同于预扩产物(图 2)。
M． 100 bp DNA ladder;1 ～ 9．耧斗菜选扩产物。
M． 100 bp DNA ladder;1 － 9． Products of amplification．
图 2 琼脂糖电泳检测选择性扩增结果
Fig． 2 Products of amplification on agrose
2． 2 引物筛选
采用上述体系，从 64 对引物中筛选出 9 对条带
较多，分布均匀，谱带清晰的适用于耧斗菜的引物组
合，均表现出较高的稳定性、清晰度和多态性，分别
为:E-ACA /M-CTA、E-ACC /M-CAT、E-AAG /M-CTT、
E-AGG /M-CAA、E-AGG /M-CAT、E-AGG /M-CTG、E-
AAG /M-CTA、E-AAG /M-CTG、E-AAG /M-CAC。
2． 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
本试验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法显
带，在电泳与银染过程中，样品要充分变性，如果变
性不充分会使泳道颜色加深，条带出现弥散影响检
测结果，所以最好在电泳前变性。灌胶前玻璃板一
定要清洗干净，否则灌胶时较易产生气泡，硅化完后
用 75%酒精擦拭可减轻胶板的背景，固定胶板的夹
子在保证梳子可以插入的前提下尽量夹紧，胶板厚
度越薄，板的背景越浅。预电泳时间一定要大于 30
min，保证胶板温度达到 50 ～ 55℃，否则条带模糊，
温度过高则会出现弥散带。预电泳后梳子插入尽量
浅，对胶的破坏越小，带型越直。染色时间掌握在
30 min左右，显影液温度提前预冷，温度控制在 4℃
左右。显色完成后，胶板放 10%醋酸溶液中过夜保
存，可使条带更清楚。之后用蒸馏水漂洗 10 min 以
上，晾干待用。
3 结论
综合以上试验结果，初步建立了耧斗菜属植物
的 AFLP体系:利用 5 U限制性内切酶酶切 3 h 能在
20 μL的反应体系中完全切割 300 ng的纯度较高的
DNA，酶切产物 5 μL在含有 1. 2 mmol /L Mg2 +、0. 3
mmol /L dNTPs、1 U Taq、预扩增引物 E-00 和 M-00
分别为 50 ng 的 20 μL 反应体系中进行预扩增，预
扩产物稀释 30 倍后在含有 1. 2 mmol /L Mg2 +、0. 3
mmol /L dNTPs、1 U Taq、预扩增引物 E －＊＊＊和 M
－＊＊＊分别为 50 ng的 20 μL反应体系中进行选择
性扩增，能够得到很好的扩增效果和质量比较好的
AFLP胶图。
总之，AFLP 步骤繁琐，影响分析结果的因素很
多，不同植物之间差异明显，要求试验的每个环节都
要进行摸索，认真仔细的完成，确保高质量的结果。
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