全 文 ：张瑞熙，柴友荣，殷家明． 芸薹属 TT8 基因家族 RNA干扰载体的构建［J］． 江苏农业科学，2011，39(6) :43 － 46．
芸薹属 TT8 基因家族 RNA干扰载体的构建
张瑞熙，柴友荣，殷家明
(西南大学农学与生物科技学院 /农业部生物技术和作物品质改良重点实验室 /
重庆市油菜工程中心 /重庆市作物品质改良重点实验室，重庆 400716)
摘要:类黄酮是植物的重要次生代谢物质，拟南芥透明种皮 8(TT8)是调控花青素苷、原花青素、种皮黏液生物合
成的 1 个转录因子，参与决定植株彩色、种皮色泽、种皮黏液分泌等性状。本研究采用 PCR法从甘蓝型油菜中克隆了
592 bp(不计人工酶切位点)的芸薹属 TT8 基因家族的 RNA 干扰片段，将其反义片段、正义片段采用 NcoⅠ + SwaⅠ、
BamHⅠ + XbaⅠ双酶切方式分别插入到改进型植物 RNA干扰平台载体 pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终
止子之间，形成了 11 380 bp的重组载体 pFGC5941M － BTT8Ⅰ(简称为 pBTT8Ⅰ) ，多种 PCR鉴定结果表明构建成功;
然后转化根癌农杆菌，获得工程菌株，可用于芸薹属植物相关性状的分子机理研究和遗传修饰。
关键词:芸薹属;甘蓝型油菜;RNAi;透明种皮 8(TT8) ;载体构建
中图分类号:Q782 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2011)06 － 0043 － 03
收稿日期:2011 － 01 － 28
基金项目:国家自然科学基金(编号:30771237) ;国家“863”计划(编
号:2006AA10Z110、2006AA10A113、2008AA10Z152) ;重庆市科技
攻关项目(编号:CSTC2009AB1030)。
作者简介:张瑞熙(1986—) ，男，陕西西安人，硕士研究生，主要从事
植物分子遗传与遗传工程研究。E － mail:loaferrui@ 126． com。
通信作者:柴友荣，研究员，博士生导师，主要从事植物基因工程与作
物分子育种、植物分子生物学、植物分子遗传学研究。Tel: (023)
68250744;E － mail:chaiyourong1@ 163． com。
甘蓝型油菜(Brassica napus L．)是中国及世界的重要油
菜栽培种［1］。芸薹属(Brassica)植物与同科的模式植物拟南
芥(Arabidopsis thaliana)亲缘关系较近。对拟南芥研究表明，
原花青素(PA，也叫缩合单宁) ，是经由公共苯丙烷途径、核心
类黄酮 －花青素途径、PA特异途径这 3 个连续代谢途径构成
的一个复合途径合成的，任意一步的功能失活性突变均会导
致种皮色素合成或沉积的阻断或弱化，从而由野生型的深褐
色种皮变为透明种皮(transparent testa，tt) ，使种子呈现黄色
或浅褐色［2］。PA是油菜等植物种皮中黑褐色色素的主要成
分，种皮色素越少，油菜籽初榨油和菜籽饼中的色素及多酚类
抗营养剂就越少，从而提高菜籽油和饼粕的经济价值［3 － 4］。
在亲本物种甘蓝(B． oleracea)和白菜(B． rapa)中均存在稳
定的天然黄籽基因型，但甘蓝型油菜中却没有。已有的黄籽
甘蓝型油菜系通过种间杂交而选育，材料稀缺，表现型欠稳
定，选育难度大［5 － 6］。
拟南芥透明种皮 8(AtTT8)基因编码 1 个 bHLH 型正调
控转录因子，调控类黄酮物质的积累，TT8 基因对于原花青素
在内种皮中的积累是必要的，在积累有花青素苷和原花青素
的细胞中被诱导表达，tt8 突变体为典型黄籽。TT2、TT8 和
TTG1 形成一个三元转录因子复合物，调控类黄酮合成途径的
“晚期”结构基因如 DFR、BAN 等的表达，TT8 能在 TT2 和
TTG1 之间形成一个桥梁，同时与 TT2 和 TTG1 相互作用，从
而调控原花青素、花青素苷、种皮黏液的积累［2，7 － 9］。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中
高度保守的、由双链 RNA(dsRNA)诱发的、同源 mRNA 高效
特异性降解的现象，是一种转录后水平高效基因沉默技术。
构建可转录为 dsRNA的植物表达载体转化植物，可实现植物
中目标基因的可遗传的基因沉默，用于基因功能鉴定和创造
分子育种新材料［10 － 11］。
从禹氏三角关系得知，甘蓝型油菜(AACC)是由芸薹属
二倍体物种白菜(AA)和甘蓝(CC)通过天然远缘杂交、染色
体自然加倍而产生的异源四倍体物种［12］。笔者所在课题组
采用 RACE 技术已经克隆了甘蓝型油菜 TT8 基因家族
(BnTT8 － 1 和 BnTT8 － 2)、白菜 TT8 家族(BrTT8 － 1 和 BrTT8
－ 2)和甘蓝 TT8 基因家族(BoTT8 － 1 和 BoTT8 － 2)的全长
cDNA和基因组序列。在此基础上，本研究构建了芸薹属 TT8
基因家族的 RNAi载体，将有助于揭示芸薹属种皮色素、花青
素苷、种皮黏液合成的机理和分子育种的潜力。
1 材料与方法
1． 1 材料
植物材料:甘蓝型油菜的一个黑籽保持系 5B 的生殖器
官(蕾、花，开花后 10、20、30 d 的种子)混合总 cDNA，由笔者
所在课题组此前的研究制备并保存于 － 20 ℃。
菌株和质粒:大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5α、根癌
农杆菌菌株 LBA4404，由笔者所在课题组保存。植物 RNA 干
扰平台载体 pFGC5941M，由笔者所在课题组在 pFGC5941
(AY310901． 1，购自国际拟南芥生物资源中心)的基础上改进
而成［13］。
试剂:pMD19 － T 载体、DNA Ligation Kit Ver． 2． 0、λ －
HindⅢ DNA marker，为大连宝生物(TaKaRa)产品。Easy －
Taq DNA聚合酶及 buffer、dNTPs、DL2000 plus DNA marker、琼
脂糖等，为北京全式金(Transgen)产品。Biospin 胶回收试剂
盒、Biospin质粒小量提取试剂盒，为杭州博日(BioFlux)产品。
限制性内切酶及 Buffer，为 MBI Fermentas 产品。氨苄青霉素
(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、链霉素(Str)等购自
—34—江苏农业科学 2011 年第 39 卷第 6 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2011.06.011
上海生工。引物合成和测序由上海英骏(Invitrogen)商业
完成。
1． 2 芸薹属 TT8 基因家族 RNA干扰片段的扩增
根据已克隆的 BnTT8、BoTT8、BrTT8 基因家族全长序列
及与拟南芥 TT8 基因的多重比对，针对该基因家族特异的保
守区，以 BnTT8 － 1 基因全长 cDNA 对应的区段作为干扰片
段，设计了引物 FBTT8Ⅰ(GGATCCATTTAAATTCCCGTGCTT
GATGGCG)和 RBTT8Ⅰ(TCTAGACCATGGTTAAGCTCTTCTC
GCGG)。为便于定向克隆，在上游引物的 5端添加 BamHⅠ
和 SwaⅠ切点，在下游引物的 5端添加 XbaⅠ和 NcoⅠ切点。
以 5B生殖器官总 cDNA为模板，采用引物组合 FBTT8Ⅰ
+ RBTT8Ⅰ扩增芸薹属 TT8 基因家族干扰片段 BTT8Ⅰ，
50 μL标准 PCR体系含 0． 5 μL 模板和 1． 5 U Taq DNA 聚合
酶，其他成分为常规含量。PCR 循环条件为:94 ℃预变性
2 min;94 ℃变性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，35
个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。电泳照相后切胶回收目的条
带，与 pMD19 － T 连接重组为 pMD19 － T － BTT8Ⅰ，转化
DH5α［14］，PCR阳性的克隆子菌液送样采用 M13F引物测序。
1． 3 芸薹属 TT8 基因家族 RNA干扰载体的构建与鉴定
引物 FBnPAP2I2、RBnPAP2I2、F35S3N、ROCST5N 的序列
参见文献［13］。
提取 pMD19 － T － BTT8Ⅰ和 pFGC5941M 质粒，均进行
NcoⅠ + SwaⅠ双酶切至完全，电泳后分别回收反义片段 BTT8
ⅠA和开环的 pFGC5941M 骨架，采用 T4 DNA 连接酶将二者
于 16 ℃连接 12 h，得到重组质粒 pFGC5941M － BTT8ⅠA，转
化 DH5α，挑取抗 Kan(100 mg /L)的单克隆菌落培养，用引物
组合 F35S3N + FTT8ⅠA 和 BTT8ⅠA + RBnPAP2I2 对克隆子
进行菌液 PCR检测，体系和程序同前，选取全阳性克隆子提
取质粒。
采用 BamHⅠ + XbaⅠ分别对 pMD19 － T － BTT8Ⅰ质粒
和 pFGC5941M － BTT8ⅠA质粒进行完全双酶切，电泳后分别
回收正义片段 BTT8ⅠS 和开环的 pFGC5941M － BTT8ⅠA 骨
架，采用 T4 DNA连接酶将二者于 16 ℃连接 12 h，得到重组质
粒 pFGC5941M － BTT8Ⅰ，转化 DH5α，对抗 Kan 的克隆子菌
液进行多种 PCR检测，全阳性克隆子即为芸薹属 TT8 基因家
族 RNA干扰载体。
1． 4 工程菌株的获得
抽提 pFGC5941M － BTT8Ⅰ质粒，用液氮冷激法转化根癌
农杆菌 LBA4404(感受态细胞制备同 DH5α) ，LB 平板和单克
隆菌液均用 Kan(100 mg /L)、Rif(40 mg /L)和 Str(20 mg /L)
三重筛选［14］，菌液 PCR 鉴定同“1． 3”，全阳性单克隆培养后
作为植物转化的工程菌株。
2 结果
2． 1 芸薹属 TT8 基因家族 RNA干扰片段的克隆
以 5B生殖器官总 cDNA为模板，用引物组合 FBTT8Ⅰ +
RBTT8Ⅰ进行扩增，得到约 600 bp 的特异条带，胶回收、T －
载体克隆后送 2 个 PCR 阳性的克隆子测序，得到的序列一
致，均为 611 bp(含人工酶切位点) ，为 BTT8Ⅰ片段(图 1)。
将其与本课题组所克隆的芸薹属 TT8 基因家族各成员进行
多重比对，发现它与 BnTT8 － 1 全长 cDNA 的 661 ～ 1 252 bp
区间(592)完全一致，与各基因成员的一致性为 98． 1% ～
100%。经 NCBI BLASTn比对，其 1 ～ 590 bp与同科的拟南芥
的 TT8 mRNA的一致性为 83%。
2． 2 芸薹属 TT8 基因家族 RNA干扰载体的构建
pMD19 － T － BTT8Ⅰ经 NcoⅠ + SwaⅠ完全双酶切后，除
T －载体条带外，产生了与预期 599 bp一致的条带，特异回收
反义片段 BTT8Ⅰ A(图 2 － A)。pFGC5941M 经 NcoⅠ +
SwaⅠ完全双酶切后，得到了约 10． 2 kb 开环的载体骨架
(图 2 － B) ，回收。BTT8ⅠA 与 pFGC5941M 线状骨架连接，
得到 pFGC5941M － BTT8ⅠA，转化 DH5α，抗 Kan 单克隆菌液
采用引物组合 F35S3N + FBTT8I 和 RBnPAP2I2 + RBTT8I 进
行 PCR鉴定，分别扩增出了与预期 715 bp 和 784 bp 一致的
条带(图 2 － C)。说明反义片段已按正确方向插入到启动子
与间隔区之间，形成了中间载体 pFGC5941M － BTT8ⅠA。
采用 BamHⅠ + XbaⅠ对 pMD19 － T － BTT8 Ⅰ和 pF-
GC5941M － BTT8ⅠA质粒分别进行双酶切，前者产生了与预
期 611 bp一致的正义片段 BTT8ⅠS(图 2 － D) ，后者产生了
与预期一致的约 10． 8 kb的 pFGC5941M － BTT8ⅠA开环骨架
(图 2 － E) ，回收二者，连接重组，得到干扰载体 pFGC5941M
－ BTT8Ⅰ，转化 DH5α。抗 Kan 单克隆菌液采用引物组合
FBnPAP2I2 + RBTT8Ⅰ和 ROCST5N + FBTT8Ⅰ进行检测，扩
增出了与预期 792 bp和 730 bp 一致的条带(图 2 － F) ，说明
正义片段已按正确方向插入到间隔区与终止子间。同时，对
单克隆菌液还采用 F35S3N + RBnPAP2I2 和 FBnPAP2I2 +
ROCST5N进行 PCR，再次验证反义片段和正义片段插入的位
置和大小，结果分别扩增得到与预期 888 bp和 911 bp一致的
片段(图 2 － G)。综合 PCR 鉴定表明，BnTT8ⅠA 片段在 35S
启动子与间隔区之间反义插入，BnTT8ⅠS片段在间隔区与终
止子之间正义插入，2个片段的插入大小和方向均正确，表明
—44— 江苏农业科学 2011 年第 39 卷第 6 期
RNA干扰载体 pFGC5941M － BTT8Ⅰ(简称为 pBTT8Ⅰ)构建
成功(图 3)。
2． 3 重组载体转化根癌农杆菌及鉴定
提取“2． 2”中鉴定正确的 DH5α 单克隆的质粒，采用冻
融法导入根癌农杆菌菌株 LBA4404，获得抗 Kan、Rif 和 Str 的
菌落，抗性单克隆的菌液采用与“2． 2”一样的复合 PCR鉴定，
获得完全一样的结果。表明干扰载体 pBTT8Ⅰ已成功转入到
LBA4404 中，载体结构保持完整，形成了工程菌株，可直接用
于植物转化。
3 讨论
RNAi是一种转录后水平的基因沉默技术，相对很少量的
dsRNA分子(数量远远少于内源 mRNA 的数量)就能完全抑
制相应基因的表达，沉默效率高，既可用于对不同成员进行分
别沉默，也可用于对整个家族进行有效沉默。植物中普遍存
在基因家族现象，因此基因沉默也可以作为多倍体植物如小
麦、油菜、棉花等的功能基因研究和分子育种的重要工具［15］。
克隆和 Southern杂交表明，甘蓝型油菜只有 2 条 TT8 基
因(BnTT8 － 1 和 BnTT8 － 2) ，亲本物种白菜有 2 条极其相似
的 TT8 基因(BrTT8 － 1 和 BrTT8 － 2，也许来自 1 对杂合等位
基因) ，甘蓝有 2 条极其相似的 TT8 基因(BoTT8 － 1 和 BoTT8
－ 2，也许来自 1 对杂合等位基因) ，BnTT8 － 1 起源于 BoTT8
－ 1，BnTT8 － 2 起源于 BrTT8 － 1。来自 3 个物种的 6 条 TT8
基因之间在全长 mRNA 水平的一致性介于 86． 0% ～ 99． 8%
之间，RNA 干扰片段与各成员 mRNA 间的一致性分别达到
98． 1% ～ 100%。本研究针对芸薹属 TT8 基因家族与其他
bHLH蛋白不同的特异保守区段构建 RNA 干扰载体，既不会
导致对非 TT8 基因的非靶向沉默，同时又可用于甘蓝型油
菜、白菜、甘蓝等多种芸薹属物种的转基因，介导 TT8 基因家
族的高效沉默。
类黄酮物质的合成由复杂的调控基因网络协同激活结构
基因的表达，TT8 与其他调控基因共同调节类黄酮结构基因
的表达和色素在细胞中的沉积。本研究构建了芸薹属 TT8
基因家族的 RNAi载体，有助于研究 TT8 在芸薹属植物种皮
发育、色素积累、花青素苷、种皮黏液中的作用，探索这些性状
的分子育种。
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(下转第 46 页)
—54—张瑞熙等:芸薹属 TT8 基因家族 RNA干扰载体的构建
徐伟丽，马 莺，汪家琦，等． 大米基因组 DNA不同提取方法的比较［J］． 江苏农业科学，2011，39(6) :46 － 49．
大米基因组 DNA不同提取方法的比较
徐伟丽1，马 莺1，汪家琦2，李启明2，杨 林1
(1．哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150090;2．四川省成都市新希望乳业控股有限公司技术中心，四川成都 610023)
摘要:以市售大米为材料，分别采用热解法、异丙醇沉淀法、CTAB法、SDS法、高盐低 pH值法等以及它们的改良
方法提取基因组 DNA，并对提取的 DNA进行光密度、琼脂糖凝胶电泳和 PCR检测，比较这些方法的提取效果，优化对
大米材料进行分子标记检测的 DNA提取方法。结果表明:除异丙醇沉淀法、SDS法和异硫氰酸胍法外，其他所有方法
提取的基因组 DNA均可满足 PCR 检测要求。同时，综合考虑基因组 DNA 的纯度和浓度，本研究认为大米基因组
DNA提取方法的优劣顺序依次为改进 CTAB法 ＞高盐低 pH值法 ＞ CTAB法 ＞改进 SDS法和改进热解法。这几种大
米基因组 DNA提取方法都具有操作简单、耗时短、利于快速检测的优点。
关键词:大米;基因组 DNA;提取;聚合酶链式反应
中图分类号:Q781 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2011)
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
06 － 0046 － 04
(上接第 45 页)
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近年来，分子生物学技术已被成功用于物种鉴别，其中
PCR技术更是广泛应用于食品原料物种鉴别、饲料中动物源
性成分鉴别和掺伪检验。核酸分子是 PCR 技术应用所涉及
的主要对象，所以 DNA 的分离与提取是该项技术的重要前
提。目前，对于植物全基因组 DNA的提取已有不少研究和报
道［1 － 10］，但由于不同的植物或同一种植物的不同组织材料的
组分不同，所以其适宜提取方法也有所不同。选取何种方法
能够更有效地提取更高质量的基因组 DNA，是一个值得探讨
的问题。
植物基因组 DNA的提取方法有很多，最常见的提取方法
是 SDS(十二烷基硫酸钠)法和 CTAB(十六烷基三乙基溴化
铵)法［5 － 10］。关于水稻基因组 DNA 的提取已有不少报道，但
大都是采用某种方法从水稻的不同组织中或采用不同方法从
收稿日期:2010 － 12 － 23
基金项目:国家自然科学基金(编号:31071526) ;哈尔滨工业大学校
级计划(编号:HITQNJS． 2005． 055) ;四川省应用基础研究(编号:
2009JY0101)。
作者简介:徐伟丽(1977—) ，女，黑龙江人，博士，讲师，从事食品生物
技术和食品安全领域的研究。Tel: (0451)86282910;E － mail:
weilixu698@ 163． com。
通信作者:马 莺，博士，教授，主要从事食品科学的基础理论研究和
食品安全与检测研究工作。E － mail:maying@ hit． edu． cn。
水稻同一组织中提取，常用的组织材料有水稻叶片和幼苗，也
有使用水稻干种子(糙米)、茎段为材料的［11 － 16］;而采用不同
方法从粳米中提取基因组 DNA的效果比较研究，目前尚无报
道。本试验选择热解法、异丙醇沉淀法、CTAB 法、SDS 法和
高盐低 pH值法等 12 种方法，以市售粳米为材料，进行基因
组 DNA提取，并对提取的 DNA 分别进行纯度、浓度检测和
PCR分析，从而对提取效果进行比较，探讨最适宜的大米
DNA提取方法，为食品安全中利用 PCR 技术进行食物掺假、
转基因和物种鉴别检测找到一个更快速、稳定、优质的 DNA
提取方法。
1 材料与方法
1． 1 材料、试剂及仪器
本试验所用的大米购于超市，将其粉碎，过 50 目筛，于室
温下储藏，备用。参照文献［17］的方法，将其合成扩增植物
叶绿体 DNA rbcL基因的保守区域片段引物(rbcL － F:AATCTT
CTACTGGTACATGGAC;rbcL － R:TCATCATCTTTGGTAAAA
TCAAG) ，引物由江苏省南京市金斯瑞生物科技有限公司
合成。
Tris Base、EDTANa2、Triton X － 100、SDS、CTAB、异硫氰酸
胍、Tris平衡酚、琼脂糖 G －10、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙
醇及 PCR 试剂均购于哈尔滨宝泰克生物科技有限公司;
—64— 江苏农业科学 2011 年第 39 卷第 6 期