全 文 ：基金项目： 中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费资助项目（No. XJSYWFZX2009-03）。
程 汉， 男， 1978 年 11 月生， 硕士， 助理研究员。 研究方向: 植物遗传育种。 电话:0898-23301182。
* 通讯作者， 黄华孙。 E-mail: Huasunhuang@gmail.com； 联系电话： 0898-23300573。
收稿日期： 2009-06-18 修回日期： 2009-08-26
第 30 卷 第 9 期 热 带 作 物 学 报 Vol．30 No．9
2009 年 9 月 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS Sep.2009
几种橡胶树属植物的 rDNA ITS序列分析
程 汉， 张 玥， 安泽伟， 黄华孙 *
中国热带农业科学院橡胶研究所
农业部橡胶生物学重点实验室， 海南儋州 571737
摘要 大戟科橡胶树属植物外观差异小， 不仅种内栽培品种间难以从表型上判别， 就在橡胶树属种间也差别不
大。 为了弄清楚橡胶树属植物遗传距离的详细信息， 探明利用种间基因资源的可能性， 作者从 6 种橡胶树属植
物中克隆了 ITS 序列并进行测序。 序列分析结果表明橡胶树属植物的 ITS 序列具有高度的相似性， 仅存在几个碱
基差别。 这一结果表明了橡胶树属植物亲缘关系较近， 适合通过种间杂交培育新品种， 为常规杂交育种提供理
论支持。
关键词 橡胶树属； ITS； 进化树
中图法分类号 Q781
橡胶树属（Hevea）为大戟科植物， 全球有大约 20 余种， 主要分布在热带美洲地区。 其中的巴西橡胶
树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）是天然橡胶的主要来源， 目前广泛栽培于亚洲、 非洲等热带地区， 是这
些地区的重要经济作物 [1]。 中国自上个世纪初开始引入巴西橡胶树进行栽培， 到目前为止， 已经发展成为
世界第 5大天然橡胶生产国， 种植面积达到 80多万 hm2， 年产干胶 59余万 t [2]。 橡胶种植业已经成为中国
热带地区重要的经济来源。 然而， 由于目前中国橡胶树主要栽培品种遗传背景较窄， 使得育种工作所需
材料有限。 因此， 从野生橡胶树种质甚至近缘种中引入新的遗传基因可以克服遗传背景狭窄的困难。 中
国目前建有天然橡胶树野生种质资源圃， 收集有数千份从亚马逊河流域采集的巴西橡胶树野生种质， 同
时还保存有 5 份橡胶树属其他物种种质 [3]。 这些材料为橡胶树杂交育种提供了丰富的材料。 要充分利用这
些种质， 首先要确定这些近缘种之间的亲缘关系， 分析它们之间杂交的可能性， 进而对这些材料进行鉴
定评价分析， 找出合理的培育方向。
在真核生物中， 核糖体 RNA 基因在基因组上有多个拷贝， 每个拷贝序列有外转录间隔区（external
transcribed spacer, ETS）、 18S 基因、 内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）、 5.8S 基因、 28S 基
因和基因间隔区（intergenic spacer, IGS）等 6 个部分组成 [4]， 其中 ITS 区在长度上保守， 但在核苷酸序列上
具有高度变异性， 可以用来解决属间甚至种间的植物分类以及系统发育问题。 橡胶树属植物之间外观差
异小， 不仅巴西橡胶树的栽培品种间难以从表型上判别， 就在橡胶树属种间也差别不大。 这种高度相似
性一方面给育种工作带来困难， 但另一方面也为利用种间基因资源带来了可能。 为了弄清橡胶树属种质
间遗传距离的详细信息， 探明利用种间基因资源的可能性， 为橡胶树属中间基因资源利用打下基础， 笔
者对橡胶树属 6种植物的 ITS序列进行克隆和序列分析， 研究这些近缘种 ITS 序列的变异程度， 分析其亲
缘关系和遗传距离。
1 材料和方法
1.1 材料
大戟科（Euphorbiaceae）橡胶树属（Hevea）的 6 种植物叶片采于中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡
胶树种质资源圃， 它们分别是： 巴西橡胶树（H. brasiliensis）栽培品种 Tjir1、 边沁橡胶树（H.benthamiana）、
9期
光亮橡胶树（H. nitida）、 马拉若矮生小叶橡胶树（H. camargoana）、 色宝橡胶树（H.spruceana）和少花橡胶树
（H.pauciflora）。
Taq 酶等分子生物学试剂购自 Fermantas， pMD18-T 载体购自大连 TaKaRa 生物公司 ， 大肠杆菌
TOP10感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。 其他试剂为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1DNA提取和 ITS区序列扩增 种质资源圃采集新鲜叶片， 冰袋保存后带回实验室。 经液氮研磨
成粉末后， 使用 CTAB法提取基因组 DNA[5,6]。 电泳分析后， -20℃低温保存。
ITS区扩增引物采用通用引物 ITS1 (5TCCGTAGGTGAACCTGCGG3)和 ITS4 (5TCCTCCGCTTATTGATA
TGC3)， 扩增条件如下： 50 μL PCR 反应体系中 10 × buffer 5.0 μL; 10 mmol/L dNTP 1.0 μL; 10 μmol/L ITS1
和 ITS4 引物各 1.0 μL; 0.1 μg/μL DNA 模板 1.0 μL; 5 U/μL pfu Taq 酶 0.5 μL; 灭菌重蒸水 41.5 μL。 PCR 扩
增条件为： 94 ℃预变性 4 min； 94 ℃变性 30 s， 55 ℃退火 30 s , 72 ℃延伸 1 min， 循环 31 次； 72 ℃延伸
10 min。
PCR产物经 1.2％琼脂糖凝胶电泳、 溴化乙锭染色后紫外灯下拍照分析。
1.2.2ITS区序列克隆和测序 从琼脂糖凝胶中回收清晰扩增条带， 经回收试剂盒回收后， 连接至
pMD18-T 载体。 转化 TOP10 感受态细胞， 涂布于含有 50 mg/L 羧苄青霉素 LB 固体平板。 过夜培养后，
挑取白色菌落进行菌落 PCR鉴定， 将带有插入片段的克隆送至北京三博远志生物技术公司进行测序分析。
每个物种至少挑取 5 个独立克隆进行测序分析。
1.2.3序列分析 去除得到序列中的载体和引物序列， 以 FASTA 格式保存。 来自同一物种的 5 条测序
结果进行自己比较， 以排除测序过程中的错读和漏读， 得到的干净序列导入 MEGA 3.1 软件中进行分析。
采用邻接法 (neighbor joining, NJ) 构建分子系统发育树。 NJ 系统树分支的置信度采用自引导法(bootstrap
analysis ,BP)重复 1 000次检测。
2 结果
2.1 ITS区域扩增结果
使用 ITS1 和 ITS4 引物， 对 6 个橡胶树属不同物种的
DNA 模板进行 PCR 扩增， 分别得到 1 条 670 bp 左右长度
的清晰条带 （图1）。 将该片段回收、 克隆至 pMD18-T 载
体， 并送交测序。 结果表明， 该片段包括了完整的核糖体
ITS序列 （包括ITS1、ITS2和5.8S）。 参考其他植物的 ITS 序
列对这些序列进行分析， 结果表明橡胶树属植物 ITS 区域
序列长度为 672～676 bp， 其中 ITS1 序列长度 239~241 bp，
ITS2 序列长度 274~276 bp， 5.8S 长度为 159 bp， 序列全
部相同（表1）。
bp
1 500
1 000
500
从左至右依次为： MK， 核酸分子量标准； 1,巴西橡胶树；
2,边沁橡胶树； 3， 光亮橡胶树； 4， 马拉若矮生小叶橡
胶树； 5， 色宝橡胶树； 6， 少花橡胶树
图 1 6 种橡胶树属植物 ITS 序列扩增结果

    


 
 
 
       

            
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程 汉等： 几种橡胶树属植物的 rDNA ITS 序列分析 1321
热 带 作 物 学 报 30 卷
2.2 橡胶树属ITS序列分析和进化树构建
利用比对工具对橡胶树属植物 ITS 序列进行比对分析， 结果表明橡胶树属植物 ITS 序列无论是相似
度还是绝对复杂度都较高， 仅有几个位置的碱基发生了变异（图2）。 将获得的 6 条 ITS 序列经过 Clustal





10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
110 120 130 1 40 150 160 170 180 190 200
210 220 230 2 40 250 260 270 2 80 290 200
310 320 330 3 40 350 360 370 380 390 400
410 420 430 4 40 450 460 470 480 490 500
510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
610 620 630 640 650 660 670
图 2 6 种橡胶树属植物 ITS 序列的比对分析
H.brasiliensis
H.benthamiana
H.spruceana
H.pauciflora
H.nitida
H.camargoana
H.brasiliensis
H.benthamiana
H.spruceana
H.pauciflora
H.nitida
H.camargoana
H.brasiliensis
H.benthamiana
H.spruceana
H.pauciflora
H.nitida
H.camargoana
H.brasiliensis
H.benthamiana
H.spruceana
H.pauciflora
H.nitida
H.camargoana
H.brasiliensis
H.benthamiana
H.spruceana
H.pauciflora
H.nitida
H.camargoana
H.brasiliensis
H.benthamiana
H.spruceana
H.pauciflora
H.nitida
H.camargoana
H.brasiliensis
H.benthamiana
H.spruceana
H.pauciflora
H.nitida
H.camargoana
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9期
W 1.83 软件分析比对， 结果如图 2 所示。 从图中可以看出， 这 6 条序列绝大多数位置是相同的， 仅有 8
个位置的碱基发生了缺失或替换。 其中巴西橡胶树和边沁橡胶树、 以及色宝橡胶树和少花橡胶树在序列
上完全相同。
用 MEGA 3.1 系统发育分析软件处理， 构建进化树（图3）。 从图中可以看出， 虽然这些材料是属内种
间关系， 但其遗传距离非常接近。 其中， 巴西橡胶树和边沁橡胶树， 以及色宝橡胶树和少花橡胶树列为
一支， 光亮橡胶树和马拉若矮生小叶橡胶树列为另外一支。
3 讨论
ITS序列位于核糖体基因 18S和 28S之间， 包括了 ITS1， 5.8S基因和 ITS2序列。 由于 ITS1 和 ITS2 序
列变异速度比 18S 和 5.8S 快， 所以被用作分析被子植物属内以及亲缘关系较近的物种种群间的系统分
类关系 [4]。 橡胶树属原产地位于巴西亚马逊河流域， 在中国仅有巴西橡胶树大面积栽培。 1981年中国从亚
马逊河流域收集保存了大量巴西橡胶树野生种质和橡胶树属其他种的种质， 拓宽了中国橡胶树遗传资源。
为研究国内保存的橡胶树属种质间的遗传和分类关系， 本实验中克隆了橡胶树属 6个物种的 ITS 序列
并进行了序列分析。 结果表明， 这 6个物种的 ITS序列相似性非常高， 遗传距离非常近， 其中有 2 对在序
列上完全相同（巴西橡胶树和边沁橡胶树， 以及色宝橡胶树和少花橡胶树）。 虽然能将对这些物种进行进
化树分析， 但即使最远距离也仅仅为 0.000 774 0， 差异程度不高。 因此， 可以考虑利用这些物种进行种间
杂交， 并作为橡胶树新品种培育所需优良基因的来源。 中国热带农业科学院橡胶研究所育种组曾成功利
用光亮橡胶（H. nitida）同巴西橡胶树（H. brasiliensis）进行杂交授粉并收获了种子（未公布）。 巴西也曾用边
沁橡胶树（H.benthamiana）与巴西橡胶树（H. brasiliensis）进行杂交， 筛选培育速生、 高产橡胶树品种 [7]。 这
些实验从实践上证明了在橡胶树属内进行种间杂交是可行的。 本文通过分析橡胶树属 6 个物种的 ITS 序
列， 发现这些序列具有高度相似性， 在基因组水平上证明了这 6 种植物亲缘关系高度接近， 为开展橡胶
树种间杂交育种提供了理论支持。
参 考 文 献
[1] 何 康，黄宗道主编. 热带北缘橡胶树栽培[M]. 广东: 广东科技出版社, 1987： 8～9.
[2] 傅国华, 许海平, 安建梅. 中国天然橡胶产业比较优势分析[J]. 中国热带农业, 2008（1）: 8～9.
[3] 郑学勤， 胡东琼主编. 中国橡胶种质资源目录（第一集）[M]. 北京： 中国农业出版社, 1994： 2.








0.000 744 0
0.000 744 0
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32
70
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H.brasiliensis
H.benthamiana
H.spruceana
H.pauciflora
H.nitida
H.camargoana
0.001 4 0.001 2 0.001 0 0.000 8 0.000 6 0.000 4 0.000 2 0.000 0
图 3 橡胶树属 6 种植物进化树
程 汉等： 几种橡胶树属植物的 rDNA ITS 序列分析 1323
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责任编辑： 郑定华
[4] Baldwin BG, Sanderson MJ, Porter JM, et al. The ITS Region Of Nuclear Ribosomal DNA: A Valuable Source Of Evidence On
Angiosperm Phylogeny[J]. Ann. Missouri Bot. Gard.， 1995, 82(2): 247～277.
[5] 安泽伟， 黄华孙. 一种提取橡胶树叶中总DNA的方法[J]. 植物生理学通讯, 2005, 41(4): 513～515.
[6] 安泽伟, 赵彦宏, 程 汉, 等. 橡胶树EST-SSR标记的开发与应用[J]. 遗传, 2009, 31(3): 311～319.
[7] Paulo de Souza Goncalves, Joao Rodrigues de Paiva, M E da Costa Vasconcellos, et al. Progeny Test of Early Hevea Hybrids for
Producing Rapid Growing and High-Yielding Ortets[J]. Rev. Brasil. Genet.， 1985, Ⅷ(2): 319～327.
Sequence Analysis of rDNA ITS from Several Hevea plants
Cheng Han, Zhang Yue, An Zewei, Huang Huasun
Rubber Research Institute, CATAS; Ministry of Agriculture Key Laboratory
for Rubber Tree Biology, Danzhou, Hainan 571737, China
Abstract Hevea plants of the family Euphorbiaceae are very similar in appearance. It is very difficult to
distinguish the rubber tree cultivars in phenotype, and there is no obvious difference even between species
of the genus Hevea. For the purpose to find out the genetic background of Hevea plants and the
possibility to utilize the interspecific genetic resource, ITS fragments were cloned and sequenced from
plants of 6 species of the genus Hevea. Sequence analysis showed a high similarity in ITS sequence among
these Hevea species, which varied only in several bases. The results indicated that these species had a
close genetic relationship, and they can be used for interspecific crossing. This might provide a theoretical
support for rubber tree conventional cross breeding.
Key words Hevea; ITS; phylogenetic tree.
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