全 文 ：第４４卷 第７期
２０１６年７月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４４ Ｎｏ．７
Ｊｕｌ．２０１６
网络出版时间：２０１６－０６－０８ １６：２１ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１６．０７．０１５
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１６０６０８．１６２１．０３０．ｈｔｍｌ
芸薹属栽培种ＡＬＳ１－３的克隆及序列分析
［收稿日期］ ２０１４－１２－０５
［基金项目］ 现代农业产业技术体系建设专项（ＣＡＲＳ－１３）；“十一五”国家科技支撑计划项目（２０１０ＢＡＤ０１Ｂ０２）
［作者简介］ 孙妍妍（１９８８－），女，吉林长春人，在读硕士，主要从事油菜遗传育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１５９２９８００８３３＠１６３．ｃｏｍ
［通信作者］ 胡胜武（１９６６－），男，陕西柞水人，教授，博士生导师，主要从事油菜遗传育种研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｗｈｕ８３２５１＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ
孙妍妍，曲高平，胡胜武
（西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌７１２１００）
［摘 要］ 【目的】揭示６种芸薹属植物乙酰乳酸合成酶（ＡＬＳ）基因的结构特征，为 ＡＬＳ酶的遗传操作和抗除
草剂种质创制奠定基础。【方法】利用特异ＰＣＲ方法，对甘蓝型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）、甘蓝（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、芥菜型
油菜（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、白菜型油菜（Ｂ．ｒａｐａ）、埃塞俄比亚芥（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、黑芥（Ｂ．ｎｉｇｒａ）等６个芸薹属１６份材料的ＡＬＳ
基因进行扩增、克隆测序及生物信息学分析。【结果】除１个Ｂ．ｎｉｇｒａ材料未扩增出任何产物外，其余参试材料中均
有ＰＣＲ扩增产物，共成功克隆了３０个ＡＬＳ基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＫＭ８１６８０７～ＫＭ８１６８３６），且克隆的基因ＡＬＳ１、
ＡＬＳ２、ＡＬＳ３均不含内含子，只有一个开放阅读框。ＡＬＳ１基因开放阅读框长为１ ９６８ｂｐ，编码６５５个氨基酸；ＡＬＳ２
基因开放阅读框长为１ ９１４ｂｐ，编码６３７个氨基酸；ＡＬＳ３基因开放阅读框长为１ ９５９ｂｐ，编码６５２个氨基酸。参试材
料中，在ＡＬＳ１基因中检测到７个ＳＮＰ，其中４个导致氨基酸突变；在ＡＬＳ２基因中检测到３个ＳＮＰ，其中２个导致氨
基酸突变；在ＡＬＳ３基因中检测到２５个ＳＮＰ，其中２个导致氨基酸突变。在３类ＡＬＳ蛋白中，ＡＬＳ１和ＡＬＳ３遗传距
离较近，与ＡＬＳ２的遗传距离相对较远。ＡＬＳ１基因定位于Ｃ０１染色体上，ＡＬＳ２和ＡＬＳ３基因定位于 Ａ０１染色体
上。【结论】参试的６个芸薹属不同材料间ＡＬＳ１、ＡＬＳ２、ＡＬＳ３基因序列及其编码的蛋白序列均存在差异。
［关键词］ 芸薹属植物；乙酰乳酸合成酶基因；基因克隆；生物信息学；基因序列分析
［中图分类号］ Ｓ５０３．５３ ［文献标志码］ Ａ ［文章编号］ １６７１－９３８７（２０１６）０７－０１０１－０８
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＬＳ１－３ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ
ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｅｃｉｅｓ
ＳＵＮ Ｙａｎｙａｎ，ＱＵ Ｇａｏｐｉｎｇ，ＨＵ Ｓｈｅｎｇｗｕ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈｅ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＡＬＳ）ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｘ Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｏ ｌａｙ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＬＳ ａｎｄ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ．
【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ＡＬＳｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ １６ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｓｉｘ Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐｅｃｉｅｓ，
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．，Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ，Ｂ．ｊｕｎｃｅａ，Ｂ．ｒａｐａ，Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ，ａｎｄ Ｂ．ｎｉｇｒａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ
ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ＡＬＳｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ａｎａｌｙｚｅｄ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｅｘｃｅｐｔ ｆｏｒ ｏｎｅ Ｂ．ｎｉｇｒａ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ，ＡＬＳｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ １５ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ．Ｉｎ ｔｏｔａｌ，３０ ＡＬＳｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ
ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｕｍｂｅｒｓ（ｆｒｏｍ ＫＭ８１６８０７ｔｏ ＫＭ８１６８３６）ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．ＡＬＳ１，ＡＬＳ２ａｎｄ
ＡＬＳ３ｈａｄ ｎｏ ｉｎｔｒｏｎｓ ａｎｄ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）．ＯＲＦ ｏｆ ＡＬＳ１ｗａｓ １ ９６８ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ，ｅｎｃｏ－
ｄｉｎｇ ａｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ６５５ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．ＯＲＦ ｏｆ ＡＬＳ２ｗａｓ １ ９１４ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ６３７ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ．ＯＲＦ ｏｆ ＡＬＳ３ｗａｓ １ ９５９ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ６５２ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｓｅｖｅｎ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＳＮＰ）ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｍｏｎｇ ＡＬＳ１，ａｎｄ ｆｏｕｒ ｏｆ ｔｈｅｍ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ．Ｔｈｒｅｅ
ＳＮＰｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｍｏｎｇ ＡＬＳ２，ａｎｄ ｔｗｏ ｏｆ ｔｈｅｍ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ．Ｔｗｅｎｔｙ－ｆｉｖｅ ＳＮＰｓ ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｍｏｎｇ ＡＬＳ３，ａｎｄ ｔｗｏ ｏｆ ｔｈｅｍ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＡＬＳ１ａｎｄ
ＡＬＳ３ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｃｌｏｓｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｗｉｔｈ ＡＬＳ２．ＡＬＳ１ｗａｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ｃ０１ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ｗｈｉｌｅ ＡＬＳ２ａｎｄ
ＡＬＳ３ｗｅｒｅ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ａ０１ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＡＬＳ１，ＡＬＳ２，ａｎｄ ＡＬＳ３
ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｍｏｎｇ ｓｉｘ Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐｅｃｉｅｓ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏ－
ｔｅｉｎｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｅｃｉｅｓ；ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＡＬＳ）ｇｅｎｅ；ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
油菜是我国乃至全世界的主要油料作物，随着
我国国民经济的快速发展，农村青壮年劳动力向城
市大量转移，轻简化、机械化已成为油菜产业发展的
主要方向。杂草的综合有效治理是实现油菜机械
化、轻简化的重要技术环节［１］，选育和推广抗除草剂
油菜品种是克服油菜田间草害最为经济有效的措
施。目前，抗除草剂油菜主要分为两大类：转基因抗
除草剂油菜（主要抗性基因有抗草胺膦的ｂａｒ和抗
草甘膦的ａｒｏＡ）和非转基因抗除草剂油菜。Ｓｗａｎ－
ｓｏｎ等［２］和 Ｈａｔｔｏｒｉ等［３］采用小孢子化学诱变的方
法获得２个抗咪唑啉酮类除草剂的油菜突变体
ＰＭ１和ＰＭ２。ＰＭ１和ＰＭ２均由ＡＬＳ基因点突变
所致，其中ＰＭ１是ＢｎＡＬＳ１基因上的第６５３位丝
氨酸（Ｓｅｒ）突变为天冬酰胺（Ａｓｎ），ＰＭ２是基因
ＢｎＡＬＳ３的第５７４位色氨酸（Ｔｒｐ）突变为亮氨酸
（Ｌｅｕ）（对应拟南芥序列）。２００４年江苏省农业科学
院在油菜和大豆轮作喷施咪唑啉酮类除草剂的试验
田中，发现了自然突变的除草剂抗性油菜新种质
Ｍ９，该突变体抗性稳定、抗性效应明显［４－５］。胡茂龙
等［６］研究表明，Ｍ９抗性由１个显性核基因控制，其
ＢｎＡＬＳ１的抗性突变位点是Ｓｅｒ－６５３－Ａｓｎ（对应拟南
芥序列）。目前，国外生产上大面积使用转基因抗除
草剂油菜品种，而非转基因油菜主要是由ＰＭ１和
ＰＭ２选育得到的抗咪唑啉酮类油菜。
乙酰乳酸合成酶（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＬＳ）
抑制剂类除草剂是发展最快、品种最多、市场最大的
一类选择性除草剂，该类除草剂由于生物活性高、杀
草谱广、对人和动物十分安全而应用于多种作
物［７－９］。乙酰乳酸合成酶（ＡＬＳ）是控制植物体内合
成支链氨基酸（包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）公共
途径的关键酶，该酶由催化亚基和调控亚基组
成［１０－１６］，它同时催化２个平行反应，催化２分子丙酮
酸缩合形成２－乙酰乳酸并释放出ＣＯ２，最终生成缬
氨酸和亮氨酸；催化１分子丙酮酸和１分子２－氧丁
酸缩合形成乙酰羟基丁酸，最终生成异亮氨酸［１７］。
细菌、真菌、藻类和植物中均含有 ＡＬＳ，植物 ＡＬＳ
由核基因编码，定位于叶绿体［１８］。ＡＬＳ是磺酰脲
类、咪唑啉酮类等５类高选择性、低毒化学除草剂的
作用靶标［１９－２１］，因此ＡＬＳ基因是抗除草剂遗传操作
的一个重要候选基因，具有重要的研究价值。
甘蓝型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）基因组内存在
５个ＡＬＳ基因拷贝（ＡＬＳ１－ＡＬＳ５），芸薹属植物中
ＡＬＳ基因以多基因家族的形式存在，其多样性超过
烟草和拟南芥中的ＡＬＳ基因［２２］。ＡＬＳ１和ＡＬＳ３
享有广泛的同源性，它们可能是编码植物生长和发
育所必需的 ＡＬＳ酶。ＡＬＳ２与ＡＬＳ１和ＡＬＳ３在
ＤＮＡ序列上差异较大，在成熟蛋白编码区、Ｎ端叶
绿体转运肽的编码区及基因上游非编码区具有独特
的特征，并且只在成熟的胚珠和不成熟的种子胚胎
中表达，表明ＡＬＳ２酶可能在种子的发育中起特殊
作用。ＡＬＳ４和ＡＬＳ５的编码区被打断，可能是缺
失功能ＡＬＳ 基因。分析Ｂ．ｎａｐｕｓ的二倍体祖先
Ｂ．ｒａｐａ和Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ表明，ＡＬＳ２、ＡＬＳ３和ＡＬＳ４
起源于Ｂ．ｒａｐａ，而ＡＬＳ１和ＡＬＳ５起源于Ｂ．ｏｌｅｒａ－
ｃｅａ［２２］。
本研究拟对６个不同芸薹属植物的ＡＬＳ基因
进行克隆测序及生物信息学分析，以明确这６个主
要芸薹属植物ＡＬＳ基因的特征特性，为 ＡＬＳ酶的
遗传操作和抗除草剂种质创制奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材 料
供试材料包括４个Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ材料：中双
９号、ＳＨ１１、秦油３号、新型甘蓝型油菜；２个Ｂ．ｏｌ－
ｅｒａｃｅａ材料：特选中甘１１、晚丰；３个Ｂ．ｊｕｎｃｅａ材
料：渭源大黄芥、关中芥菜、黔西牛尾油菜；４个
Ｂ．ｒａｐａ材料：金秋６６、彬县义门油菜、Ｏｐａｖａ、Ｒａｐｉ－
ｄｏ；２个Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ 材料：Ｄｏｄａｌａ、０９Ｈ２９０１００３；１
个Ｂ．ｎｉｇｒａ材料：Ｓｉｚａｊａ。上述材料均由西北农林
科技大学油菜研究中心提供，２０１３年９月播种于陕
２０１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
西杨凌西北农林科技大学农学院标本区，１０月２８
日取嫩叶，用于基因组ＤＮＡ的提取。
Ｅｘ Ｔａｐ酶、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１０×Ｅｘ ＴａｐＢｕｆｆ－
ｅｒ及ｐＭＤ １９－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ由大连宝生物 ＴａＫａＲａ公
司生产；６×ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ和琼脂糖凝胶
ＤＮＡ回收试剂盒及ＤＨ５α大肠杆菌感受态细胞均
由天根生化科技（北京）有限公司生产；引物合成和
测序均由上海立菲生物技术有限公司完成。
１．２ ＡＬＳ基因的克隆
叶片全基因组ＤＮＡ采用ＣＴＡＢ法提取。利用
胡 茂 龙 等［６］ 设 计 的 ３ 对 引 物：ＢｎＡＬＳ１－Ｆ１／
ＢｎＡＬＳ１－Ｒ１、ＢｎＡＬＳ２－Ｆ１／ＢｎＡＬＳ２－Ｒ１、ＢｎＡＬＳ３－
Ｆ１／ＢｎＡＬＳ３－Ｒ１分别扩增ＡＬＳ１、ＡＬＳ２和ＡＬＳ３基
因序列。ＰＣＲ反应体系：模板ＤＮＡ ２μＬ，Ｅｘ Ｔａｑ
酶（５Ｕ／μＬ）０．１５μＬ，１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ，上
下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各０．７５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足２０
μＬ。ＰＣＲ循环参数：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性
４０ｓ，５５℃退火４０ｓ，７２℃延伸２．５ｍｉｎ，３４个循环；
７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物经１．０％琼脂糖
凝胶电泳分离，然后切下目的条带，用离心柱型琼脂
糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒回收纯化（具体步骤参照
试剂盒说明书）。回收产物经ｐＭＤ １９－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ连
接、ＤＨ５α大肠杆菌感受态转化、蓝白斑筛选、菌落
ＰＣＲ鉴定后，每个材料每个基因分别随机选取３～５
个阳性克隆送至上海立菲生物技术有限公司测序。
将克隆成功的３０条核酸序列提交至ＧｅｎＢａｎｋ数据
库中，并获得登录号。
１．３ 生物信息学分析
利用ＮＣＢＩ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／）进行核酸和蛋白质的Ｂｌａｓｔ分析，利用Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｘ ２．０．１２软件进行核酸和蛋白质的序列比对，利用
ＭＥＧＡ ５．１软件，采用极大似然法（Ｍａｘｉｍｕｍ－ｌｉｋｅ－
ｌｉｈｏｏｄ，ＭＬ）构建ＡＬＳ蛋白系统发育进化树。利用
在线软件ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ．ｏｒｇ／ｂｒａｄ／对 ＡＬＳ 基
因进行定位。
２ 结果与分析
２．１ ＡＬＳ基因的克隆
试验结果显示，除在１个Ｂ．ｎｉｇｒａ材料中未扩
增出任何产物外，其他参试材料中均有ＰＣＲ扩增产
物（图１～３）。
图１ ＡＬＳ１基因扩增结果
Ｍ．ＭａｒｋｅｒⅢ；１．中双９号；２．ＳＨ１１；３．秦油３号；４．新型甘蓝型油菜；５．特选中甘１１；６．晚丰；７．Ｄｏｄａｌａ；８．０９Ｈ２９０１００３
Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＬＳ１
Ｍ．ＭａｒｋｅｒⅢ；１．Ｚｈｏｎｇｓｈｕａｎｇ Ｎｏ．９；２．ＳＨ１１；３．Ｑｉｎｙｏｕ Ｎｏ．３；４．Ｎｅｗ ｔｙｐｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ；
５．Ｔｅｘｕａｎｚｈｏｎｇｇａｎ Ｎｏ．１１；６．Ｗａｎｆｅｎｇ；７．Ｄｏｄａｌａ；８．０９Ｈ２９０１００３
图２ ＡＬＳ２基因扩增结果
Ｍ．ＭａｒｋｅｒⅢ；１．中双９号；２．ＳＨ１１；３．秦油３号；４．新型甘蓝型油菜；５．渭源大黄芥；
６．关中芥菜；７．黔西牛尾油菜；８．金秋６６；９．彬县义门油菜；１０．Ｏｐａｖａ；１１．Ｒａｐｉｄｏ
Ｆｉｇ．２ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＬＳ２
Ｍ．ＭａｒｋｅｒⅢ；１．Ｚｈｏｎｇｓｈｕａｎｇ Ｎｏ．９；２．ＳＨ１１；３．Ｑｉｎｙｏｕ Ｎｏ．３；４．Ｎｅｗ ｔｙｐｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ；５．Ｗｅｉｙｕａｎｄａｈｕａｎｇｊｉｅ；
６．Ｇｕａｎｚｈｏｎｇｊｉｅｃａｉ；７．Ｑｉａｎｘｉｎｉｕｗｅｉｙｏｕｃａｉ；８．Ｊｉｎｑｉｕ ６６；９．Ｂｉｎｘｉａｎｙｉｍｅｎｙｏｕｃａｉ；１０．Ｏｐａｖａ；１１．Ｒａｐｉｄｏ
３０１第７期 孙妍妍，等：芸薹属栽培种ＡＬＳ１－３的克隆及序列分析
图３ ＡＬＳ３基因扩增结果
Ｍ．ＭａｒｋｅｒⅢ；１．中双９号；２．ＳＨ１１；３．秦油３号；４．新型甘蓝型油菜；５．渭源大黄芥；６．关中芥菜；
７．黔西牛尾油菜；８．金秋６６；９．彬县义门油菜；１０．Ｏｐａｖａ；１１．Ｒａｐｉｄｏ
Ｆｉｇ．３ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＬＳ３
Ｍ．ＭａｒｋｅｒⅢ；１．Ｚｈｏｎｇｓｈｕａｎｇ Ｎｏ．９；２．ＳＨ１１；３．Ｑｉｎｙｏｕ Ｎｏ．３；４．Ｎｅｗ ｔｙｐｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ；５．Ｗｅｉｙｕａｎｄａｈｕａｎｇｊｉｅ；
６．Ｇｕａｎｚｈｏｎｇｊｉｅｃａｉ；７．Ｑｉａｎｘｉｎｉｕｗｅｉｙｏｕｃａｉ；８．Ｊｉｎｑｉｕ ６６；９．Ｂｉｎｘｉａｎｙｉｍｅｎｙｏｕｃａｉ；１０．Ｏｐａｖａ；１１．Ｒａｐｉｄｏ
在参试的Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ中扩
增得到ＡＬＳ１基因（图１），在Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．
ｊｕｎｃｅａ中扩增得到ＡＬＳ２（图２）和ＡＬＳ３基因（图３）。
对扩增目的片段进行回收、克隆、测序，共成功克隆了
３０个ＡＬＳ基因，并在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中登录，获得
登录号ＫＭ８１６８０７－ＫＭ８１６８３６（表１）。经过ＮＣＢＩ的
Ｂｌａｓｔ分析，结果显示所克隆基因分别与ＮＣＢＩ上已公
开的Ｂ．ｎａｐｕｓ ＡＬＳ１（Ｚ１１５２４）、ＡＬＳ２（Ｚ１１５２５）、ＡＬＳ３
（Ｚ１１５２６）基因的一致率达到９９％，证明克隆所得基因
与预期结果相符。
表１ 参试材料及成功克隆的ＡＬＳ基因
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ＡＬＳｇｅｎｅｓ
材料名称
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｎａｍｅ
芸薹属名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
克隆基因
Ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅ
ＧｅｎＢａｎｋ登录号
ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．
中双９号
Ｚｈｏｎｇｓｈｕａｎｇ Ｎｏ．９
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
ＡＬＳ１ ＫＭ８１６８１０
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８１１
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８１２
ＳＨ１１ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
ＡＬＳ１ ＫＭ８１６８０７
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８０８
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８０９
秦油３号Ｑｉｎｙｏｕ Ｎｏ．３ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
ＡＬＳ１ ＫＭ８１６８１３
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８１４
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８１５
新型甘蓝型油菜
Ｎｅｗ ｔｙｐｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
ＡＬＳ１ ＫＭ８１６８１６
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８１７
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８１８
特选中甘１１
Ｔｅｘｕａｎｚｈｏｎｇｇａｎ Ｎｏ．１１ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ＡＬＳ１ ＫＭ８１６８１９
晚丰 Ｗａｎｆｅｎｇ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ＡＬＳ１ ＫＭ８１６８２０
渭源大黄芥
Ｗｅｉｙｕａｎｄａｈｕａｎｇｊｉｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８２１
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８２２
关中芥菜
Ｇｕａｎｚｈｏｎｇｊｉｅｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８２３
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８２４
黔西牛尾油菜
Ｑｉａｎｘｉｎｉｕｗｅｉｙｏｕｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８２５
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８２６
金秋６６Ｊｉｎｑｉｕ ６６ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８２７
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８２８
彬县义门油菜
Ｂｉｎｘｉａｎｙｉｍｅｎｙｏｕｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８２９
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８３０
Ｏｐａｖａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８３１
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８３２
Ｒａｐｉｄｏ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ
ＡＬＳ２ ＫＭ８１６８３３
ＡＬＳ３ ＫＭ８１６８３４
Ｄｏｄａｌａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ ＡＬＳ１ ＫＭ８１６８３５
０９Ｈ２９０１００３ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ ＡＬＳ１ ＫＭ８１６８３６
４０１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
２．２ ＡＬＳ基因的序列分析
利用ＮＣＢＩ网站的 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ软件对２．１节
克隆得到的基因序列进行分析，结果表明：５种芸薹
属植物中所克隆的ＡＬＳ基因均不含内含子，只有１
个开放阅读框。ＡＬＳ１基因开放阅读框长为１ ９６８
ｂｐ，编码６５５个氨基酸；ＡＬＳ２基因开放阅读框长为
１ ９１４ｂｐ，编码６３７个氨基酸；ＡＬＳ３基因开放阅读
框长为１ ９５９ｂｐ，编码６５２个氨基酸。利用Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｘ ２．０．１２软件分析表明，５个芸薹属不同种材料的
ＡＬＳ基因核酸序列存在差异（表２～４），导致由其编
码的氨基酸也存在差异。对８个材料ＡＬＳ１基因的
比对分析发现了７个ＳＮＰ，其中４个ＳＮＰ可导致氨
基酸突变，Ｂ．ｎａｐｕｓ材料ＳＨ１１的ＡＬＳ１基因与其
他Ｂ．ｎａｐｕｓ材料间存在３个ＳＮＰ，但只有１个ＳＮＰ
导致氨基酸突变。对１１个材料ＡＬＳ２基因的比对
分析发现了３个ＳＮＰ，其中２个ＳＮＰ导致氨基酸突
变。对１１个材料ＡＬＳ３基因的比对分析发现了２５
个ＳＮＰ，但仅有２个 ＳＮＰ导致氨基酸突变。从
ＳＮＰ数量来看，在自然条件下ＡＬＳ３发生同义突变
的概率最大，而发生错义突变的概率最小；ＡＬＳ２序
列相对保守，发生同义突变的概率最小，但最易发生
错义突变。
表２ ＡＬＳ１核酸和蛋白质序列变异
Ｔａｂｌｅ ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＡＬＳ１ＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
材料名称
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｎａｍｅ
芸薹属名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
目标基因位置Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
２３２＊ ２４１ ３８７ １ ２８７＊ １ ３４７＊ １ ８７３＊ １ ９２０
Ｚ１１５２４ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ（Ｅ） Ｃ Ｃ Ｇ（Ｔ） Ｇ（Ｅ） Ａ（Ｉ） Ａ
中双９号Ｚｈｏｎｇｓｈｕａｎｇ Ｎｏ．９ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ（Ｅ） Ｃ Ｃ Ｇ（Ｔ） Ｇ（Ｅ） Ａ（Ｉ） Ａ
ＳＨ１１ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ（Ｅ） Ｔ Ｃ Ａ（Ｉ） Ｇ（Ｅ） Ａ（Ｉ） Ｃ
秦油３号 Ｑｉｎｙｏｕ Ｎｏ．３ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ（Ｅ） Ｃ Ｃ Ｇ（Ｔ） Ｇ（Ｅ） Ａ（Ｉ） Ａ
新型甘蓝型油菜
Ｎｅｗ ｔｙｐｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ
（Ｅ） Ｃ Ｃ Ｇ（Ｔ） Ｇ（Ｅ） Ａ（Ｉ） Ａ
特选中甘１１ＴｅｘｕａｎｚｈｏｎｇｇａｎＮｏ．１１ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｇ（Ｅ） Ｔ Ｃ Ｇ（Ｔ） Ａ（Ｇ） Ａ（Ｉ） Ａ
晚丰 Ｗａｎｆｅｎｇ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｇ（Ｅ） Ｔ Ｃ Ａ（Ｉ） Ｇ（Ｅ） Ａ（Ｉ） Ｃ
Ｄｏｄａｌａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ Ａ（Ｋ） Ｔ Ｔ Ａ（Ｉ） Ｇ（Ｅ） Ｇ（Ｖ） Ｃ
０９Ｈ２９０１００３ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ Ａ（Ｋ） Ｔ Ｔ Ａ（Ｉ） Ｇ（Ｅ） Ｇ（Ｖ） Ｃ
注：Ｚ１１５２４是ＮＣＢＩ上已公开的ＡＬＳ１序列；黑体表示突变位点；目标基因位置中括弧外为编码核苷酸，括弧内为引起突变的氨基酸；＊表
示此位点发生错义突变。下表同。
Ｎｏｔｅ：Ｚ１１５２４ｉｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＡＬＳ１ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ＮＣＢＩ；Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎ ｂｏｌｄ；ｏｕｔｓｉｄｅ ｂｒａｃｋｅｔｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ
ｂｒａｃｋｅｔｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．＊ｍｅａｎｓ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｉｓ ｓｉｔｅ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ ｔａｂｌｅｓ．
表３ ＡＬＳ２核酸和蛋白质序列变异
Ｔａｂｌｅ ３ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＡＬＳ２ＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
材料名称
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｎａｍｅ
芸薹属名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
目标基因位置Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
２６３＊ １ １７９ １ ３６７＊
Ｚ１１５２５ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ（Ｓ） Ｃ Ａ（Ｙ）
中双９号Ｚｈｏｎｇｓｈｕａｎｇ Ｎｏ．９ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ（Ｓ） Ｇ Ａ（Ｙ）
ＳＨ１１ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ（Ｓ） Ｇ Ａ（Ｙ）
秦油３号 Ｑｉｎｙｏｕ Ｎｏ．３ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ（Ｓ） Ｇ Ａ（Ｙ）
新型甘蓝型油菜 Ｎｅｗ ｔｙｐｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｇ（Ｓ） Ｇ Ａ（Ｙ）
渭源大黄芥 Ｗｅｉｙｕａｎｄａｈｕａｎｇｊｉｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｇ（Ｓ） Ｇ Ａ（Ｙ）
关中芥菜 Ｇｕａｎｚｈｏｎｇｊｉｅｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｇ（Ｓ） Ｇ Ａ（Ｙ）
黔西牛尾油菜 Ｑｉａｎｘｉｎｉｕｗｅｉｙｏｕｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｇ（Ｓ） Ｇ Ａ（Ｙ）
金秋６６Ｊｉｎｑｉｕ ６６ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｇ（Ｓ） Ｇ Ａ（Ｙ）
彬县义门油菜Ｂｉｎｘｉａｎｙｉｍｅｎｙｏｕｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｇ（Ｓ） Ｇ Ａ（Ｙ）
Ｏｐａｖａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ａ（Ｎ） Ｇ Ｔ（Ｆ）
Ｒａｐｉｄｏ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｇ（Ｓ） Ｃ Ａ（Ｙ）
注：Ｚ１１５２５是ＮＣＢＩ上已公开的ＡＬＳ２序列。
Ｎｏｔｅ：Ｚ１１５２５ｉｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＡＬＳ２ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ＮＣＢＩ．
５０１第７期 孙妍妍，等：芸薹属栽培种ＡＬＳ１－３的克隆及序列分析
表４ ＡＬＳ３核酸和蛋白质序列变异
Ｔａｂｌｅ ４ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＡＬＳ３ＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
材料名称
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
ｎａｍｅ
芸薹属名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
目标基因位置 Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
４６＊ １７７ ３６６ ４９５ ５７６ ６１５ ７１４ ７５９ ８７０ ９９３ １ ０２９＊ １ １１７ １ ２８７
Ｚ１１５２６ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｔ（Ｌ） Ａ Ｃ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ Ｇ（Ｅ） Ａ Ｇ
中双９号
Ｚｈｏｎｇｓｈｕａｎｇ Ｎｏ．９
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｔ（Ｌ） Ｔ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ｃ（Ｄ） Ａ Ｇ
ＳＨ１１ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｔ（Ｌ） Ｔ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ｃ（Ｄ） Ａ Ｇ
秦油３号 Ｑｉｎｙｏｕ Ｎｏ．３ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｔ（Ｌ） Ｔ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ｃ（Ｄ） Ａ Ｇ
新型甘蓝型油菜
Ｎｅｗ ｔｙｐｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｔ
（Ｌ） Ｔ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ｃ（Ｄ） Ａ Ｇ
渭源大黄芥
Ｗｅｉｙｕａｎｄａｈｕａｎｇｊｉｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｔ
（Ｌ） Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｇ（Ｅ） Ａ Ｇ
关中芥菜 Ｇｕａｎｚｈｏｎｇｊｉｅｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｔ（Ｌ） Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｇ（Ｅ） Ａ Ｇ
黔西牛尾油菜
Ｑｉａｎｘｉｎｉｕｗｅｉｙｏｕｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｇ
（Ｖ） Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ（Ｄ） Ａ Ａ
金秋６６Ｊｉｎｑｉｕ ６６ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｔ（Ｌ） Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｇ（Ｅ） Ａ Ｇ
彬县义门油菜
Ｂｉｎｘｉａｎｙｉｍｅｎｙｏｕｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｔ
（Ｌ） Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ（Ｄ） Ａ Ｇ
Ｏｐａｖａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｔ（Ｌ） Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ（Ｄ） Ａ Ａ
Ｒａｐｉｄｏ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｔ（Ｌ） Ｔ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ（Ｄ） Ｃ Ａ
材料名称
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
ｎａｍｅ
芸薹属名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
目标基因位置 Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
１ ４１３ １ ５００ １ ５０６ １ ５２１ １ ５２７ １ ５４５ １ ５９３ １ ６０２ １ ８９６ １ ９０２ １ ９１７ １ ９８６
Ｚ１１５２６ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ
中双９号
Ｚｈｏｎｇｓｈｕａｎｇ Ｎｏ．９
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ
ＳＨ１１ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｔ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ａ
秦油３号Ｑｉｎｙｏｕ Ｎｏ．３ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ
新型甘蓝型油菜
Ｎｅｗ ｔｙｐｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ
渭源大黄芥
Ｗｅｉｙｕａｎｄａｈｕａｎｇｊｉｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ
关中芥菜 Ｇｕａｎｚｈｏｎｇｊｉｅｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ
黔西牛尾油菜
Ｑｉａｎｘｉｎｉｕｗｅｉｙｏｕｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ａ
金秋６６Ｊｉｎｑｉｕ ６６ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ
彬县义门油菜
Ｂｉｎｘｉａｎｙｉｍｅｎｙｏｕｃａｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ
Ｏｐａｖａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ａ
Ｒａｐｉｄｏ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ａ
注：Ｚ１１５２６是ＮＣＢＩ上已公开的ＡＬＳ３序列。
Ｎｏｔｅ：Ｚ１１５２６ｉｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＡＬＳ３ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ＮＣＢＩ．
２．３ ＡＬＳ蛋白系统发育进化树的构建
利用 ＭＥＧＡ ５．１软件，采用极大似然法（Ｍａｘｉ－
ｍｕｍ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，ＭＬ）对２．１节成功克隆的３０个
ＡＬＳ基因编码的蛋白质序列构建系统发育进化树，
结果见图４。图４表明，ＡＬＳ１、ＡＬＳ２、ＡＬＳ３独自聚
为一类，然后 ＡＬＳ１和 ＡＬＳ３聚在一起，最后与
ＡＬＳ２聚在一起，说明 ＡＬＳ１和 ＡＬＳ３遗传距离较
近，与ＡＬＳ２的遗传距离相对较远。８个材料共编
码了４种不同 ＡＬＳ１蛋白（ＳＨ１１、晚丰、Ｄｏｄａｌａ和
０９Ｈ２９０１００３、其他４个材料）。１１个材料编码了２
种ＡＬＳ３蛋白，其中渭源大黄芥、关中芥菜、金秋６６
编码的ＡＬＳ３与基因库中Ｚ１１５２６编码的相同；其他
８个材料编码的ＡＬＳ３相同。１１个材料共编码了２
种ＡＬＳ２蛋白，Ｏｐａｖａ编码了１种ＡＬＳ２，其他１０个
材料编码的ＡＬＳ２相同。
２．４ ＡＬＳ基因的定位预测
利 用 网 站 ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ．ｏｒｇ／ｂｒａｄ／对
Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ和Ｂ．ｒａｐａ材料的ＡＬＳ 基因进行染色
体定位，结果表明（１）Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ材料ＡＬＳ１基因编
码区序列（第１－１ ９６８碱基）定位于Ｃ０１染色体上
（第１７ １２４ ６８０－１７ １２２ ７１３碱基）；（２）Ｂ．ｒａｐａ材
料ＡＬＳ２基因编码区（第１９９－１ ２１７碱基）定位于
Ａ０１染色体上（第１４ ７３２ ４３７－１４ ７３１ ４２２碱基）；
（３）Ｂ．ｒａｐａ材料ＡＬＳ３基因编码区（第１－１ ９５９碱
６０１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
基）也定位于 Ａ０１ 染色体上 （第 １４ １８３ ７５１－
１４ １８１ ７９３碱基）。ＡＬＳ基因编码区序列与定位在
该染色体区间内的碱基序列一致率高达９９％，说明
定位结果真实可靠。
图４ ５种芸薹属植物ＡＬＳ１、ＡＬＳ２、ＡＬＳ３蛋白的系统发育进化树
每个分支上的数值为自展检验值（１ ０００次重复）
Ｆｉｇ．４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＬＳ１，ＡＬＳ２，ａｎｄ ＡＬＳ３ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｆｉｖｅ Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐｅｃｉｅｓ
Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｂｒａｎｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｂｏｏｔｓｔｒａｐｓ ｖａｌｕｅ（１ ０００ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）
３ 结论与讨论
在以轻简化、机械化为油菜产业发展主要方向
的大环境下，抗除草剂油菜品种的选育和推广工作
势在必行，而乙酰乳酸合成酶（ＡＬＳ）基因作为抗除
草剂遗传操作的一个重要候选基因得到了人们的日
益重视。本研究对６个不同芸薹属１６个植物材料
ＡＬＳ基因进行ＰＣＲ扩增，其中１５个材料的ＡＬＳ
基因克隆成功，仅１个Ｂ．ｎｉｇｒａ材料未扩增成功，其
原因可能是ＡＬＳ１基因定位于Ｃ基因组中，ＡＬＳ２
和ＡＬＳ３基因定位于Ａ基因组中，而Ｂ．ｎｉｇｒａ材料
只包含 Ｂ基因组。本研究所用的 ＡＬＳ１、ＡＬＳ２、
ＡＬＳ３基因特异引物在Ｂ．ｎｉｇｒａ中均无ＰＣＲ扩增
产物，因此Ｂ．ｎｉｇｒａ的ＡＬＳ基因有待进一步研究。
对１５个不同材料ＡＬＳ１、ＡＬＳ２、ＡＬＳ３基因的
分析发现，ＡＬＳ１和ＡＬＳ３同源性较高（达到９５％以
上），这２个基因中的突变位点较多，其中一部分形
成错义突变；而ＡＬＳ２与ＡＬＳ１和ＡＬＳ３同源性较
低，在ＤＮＡ序列上差异较大，相对保守，极少出现
核苷 酸 的 突 变。Ｒｕｔｌｅｄｇｅ 等［２２］认 为，ＡＬＳ１ 和
ＡＬＳ３可能是编码植物生长和发育所必需的 ＡＬＳ
酶，而ＡＬＳ２在成熟蛋白编码区、Ｎ端叶绿体转运肽
的编码区及基因上游非编码区具有独特的特征，可
能具有不同于ＡＬＳ１和ＡＬＳ３的功能。本研究结果
与Ｒｕｔｌｅｄｇｅ等［２２］的上述观点相符合。经过对１５种
材料ＡＬＳ蛋白的比对分析，未发现以往报道的对抗
除草剂有贡献的ＳＮＰ位点。以往报道的对除草剂
抗性有贡献的位点主要为Ａｌａ１２２、Ｐｒｏ１９７、Ａｌａ２０５、
Ａｓｐ３７６、Ｔｒｐ５７４和Ｓｅｒ６５３［２３－２４］（以拟南芥序列为参
照）。本研究所发现的ＡＬＳ突变位点是否对除草剂
有贡献，尚有待于进一步研究。
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［２０１４－１０－１８］．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｅｄｓｃｉｅｎｃｅ．ｏｒｇ．
８０１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷