全 文 ：第 4 期
收稿日期：2010－01－13
基金项目：国家“863”计划项目（2006AA10A113；2006AA10Z110）；国家自然科学基金项目（30771237）；重庆市科技攻关项目（CSTC 2009AB1030）
作者简介：孟繁敏（1983－），女，太原人，硕士研究生，（电话）023－68250744（电子信箱）fanmin＿meng＠163．com；通讯作者，柴友荣，研究员，
博士生导师，主要从事油菜品质改良研究工作，（电子信箱）chaiyourong1＠163．com。
第 49 卷第 4期
2010 年 4月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 49 No.4
Apr．，2010
芸薹属（Brassica）植物甘蓝型油菜（B． napus L．）
是世界上重要的油料作物之一， 与拟南芥（Arabidopsis
thaliana）亲缘关系较近。在相同遗传背景下，黄子油
菜比黑子油菜具有种皮薄，出油量高，油和饼粕中
色素、木质素含量低等优点 ［1－3］，因此黄子性状是油
菜遗传改良的一个重要目标。 甘蓝型油菜中不存在
天然的黄子基因型，但通过远缘杂交培育的黄子甘
蓝型油菜存在黄子表型欠稳定、一致性差的问题。
对拟南芥等植物的研究表明，主要种皮色素是
原花青素（Proanthocyanidin，PA），也叫缩合单宁。PA
经公共苯丙烷－核心类黄酮－原花青素复合途径而
合成，先后涉及 12 个关键酶（PAL、C4H、4CL、CHS、
CHI、F3H、F3＇H、DFR、LDOX ／ ANS、LAR、ANR、LAC）
的催化反应和 3 种转运蛋白（GST、MATE、ATPase）
的胞内转运， 并有 6 种转录因子 （WIP－ZF、MYB、
bHLH、WD40、WRKY、MADS） 参与调控 PA 的合成
芸薹属 ANR（BAN）基因家族 RNA干扰载体的构建
孟繁敏，陈 艳，冯 瑜，柴友荣
（西南大学农学与生物科技学院 ／农业部生物技术与作物品质改良重点实验室 ／重庆市作物品质改良重点实验室，
重庆市油菜工程技术研究中心，重庆 400716）
摘要：花青素还原酶（ANR）是原花青素生物合成的关键酶，对种皮色素的积累起重要作用。 黄子是油菜
的重要优质性状， 但甘蓝型油菜中其基因型缺乏， 表型不稳定， 分子机理不清。 该实验克隆了芸薹属
ANR 基因家族的 RNA 干扰片段 BANRI，将其反义片段、正义片段采用 NcoI＋AatII、BamHI＋XbaI 分别插
入到改进型植物 RNA 干扰基础载体 pFGC5941M 的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间，形成重组
载体 pFGC5941M－BANRI（简称为 pBANRI），复合 PCR 鉴定表明载体构建成功，并转化根癌农杆菌菌株
LBA4404，获得工程菌株。pBANRI的构建有助于揭示芸薹属物种种皮色素合成的机理，探索对油菜等植
物种皮色素进行分子育种的可能性。
关键词：芸薹属；甘蓝型油菜；原花青素；ANR（BAN）；RNAi；载体
中图分类号：Q782 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2010）04－0769-04
Construction of RNAi Vector of Brassica ANR （BAN） Gene Family
MENG Fan－min，CHEN Yan，FENG Yu，CHAI You－rong
（Chongqing Rapeseed Technology Research Center， Chongqing Key Laboratory of Crop Quality Improvement/ Key Lab of Biotechnology ＆
Crop Quality Improvement of Ministry of Agriculture ／ College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400716，China）
Abstract： Anthocyanidin reductase （ANR ／ BAN） was a key enzyme in proanthocyanidin biosynthesis， playing an important
role in the deposition of seed coat pigments． Yellow seed was an important good－quality trait， but in Brassica napus its
genotypes were rare， the phenotypes were unstable， the molecular mechanisms were unclear， and no molecular breeding was
reported． In this study， an RNAi fragment targeted to Brassica ANR gene family was cloned． Its antisense and sense frag-
ments were inserted to the promoter －spacer and spacer－terminator cloning sites of an improved plant RNAi basic vector
pFGC5941M using NcoI ＋AatII and BamHI ＋XbaI double digestions respectively． The resultshowed recombinant vector was
pFGC5941M－BANRI （simplified as pBANRI）， which was verified by multiple PCR checking and successfully transformed
into Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 to form engineering strain． Construction of pBANRI will promote the clarify-
ing of the mechanism and molecular breeding of seed coat pigment biosynthesis in Brassica．
Key words： Brassica； Brassica napus； proanthocyanidin； ANR（BAN）； RNAi； vector
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2010.04.037
湖 北 农 业 科 学 2010 年
与积累。 花青素还原酶 （Anthocyanidin reductase，
ANR）位于花青素合成酶（ANS）的下游，将花青素转
化成表儿茶素（2，3－顺式黄烷－3－醇），它是一类 PA
单体，随即向液泡转运并聚合成为缩合单宁，在拟
南芥中 ANR 基因又被称为 BANYULS（BAN）基因，
因为该基因突变后种皮积累花青素而显红色。 拟南
芥中缺乏 LAR，ANR ／ BAN 是 PA 特异途径的第一
个关键酶， 而在其他多数植物中 PA 特异途径的第
一个关键酶是 LAR，它在 LDOX 之前可直接将 DFR
的产物无色花青素转变成 2，3－反式黄烷－3－醇，然
后形成缩合单宁［4－6］。
RNA 干扰（RNA interference， RNAi）是一种转
录后水平的基因沉默技术，相对于反义及共抑制技
术，RNAi 可获得更高的基因沉默效率；构建可转录
为 dsRNA的植物表达载体转化植物，可实现植物中
目标基因的可遗传的基因沉默，用于基因功能鉴定
和创造分子育种新材料［7，8］。
此前本课题组采用 RACE 技术已经克隆了甘
蓝型油菜 ANR 基因家族（BnANR1 至 BnANR4）、白
菜 ANR 基因家族（BrANR1、BrANR2）和甘蓝 ANR
基因家族（BoANR1、BoANR2）的全长 cDNA 和基因
组序列。 在此基础上，本研究构建了芸薹属 ANR基
因家族的 RNAi 载体， 将有助于揭示芸薹属物种种
皮色素合成的机理，探索对油菜等植物种皮色素进
行分子育种修饰的可能性。
1 材料和方法
1．1 材料
1）植物材料：甘蓝型油菜的一个黑子保持系 5B
的基因组总 DNA 和其生殖器官（蕾，花，开花后 10、
20、30 d的种子）混合总 cDNA，由本实验室制备。
2）菌株和质粒：大肠杆菌（Escherichia coli）菌
株 DH5α、根癌农杆菌菌株 LBA4404 由本实验室保
存 ，RNA 干 扰 载 体 pFGC5941 （AY310901．1）的
DH5α菌株购自俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中
心。 pFGC5941M 是由本课题组在 pFGC5941的基础
上改进而成， 改进之处是采用来自甘蓝型油菜的
BnPAP2 基因第 2 内含子 （BnPAP2I2） 替换了
pFGC5941 上过长的 PhChsA 间隔区，并在间隔区与
启动子间增加了一个 AatⅡ切点， 使载体构建和鉴
定更方便，更有把握高效地介导目标基因的沉默。
3）试剂：pMD19－T载体、DNA Ligation Kit Ver．
2．0、λ －Hind Ⅲ DNA marker 为 大 连 宝 生 物
（TaKaRa） 产品。 Easy－Taq DNA 聚合酶及 Buffer、
dNTPs、DL2000 plus DNA marker、琼脂糖等为北京
全式金 （Transgen） 产品。 Biospin 胶回收试剂盒、
Biospin 质粒小量提取试剂盒为杭州博日（BioFlux）
产品。 限制性内切酶及 Buffer 为 MBI Fermentas 产
品。 引物（表 1）合成和测序由上海英骏（Invitrogen）
商业完成。 氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利
福平（Rif）、链霉素（Str）等试剂购自上海生工。
1．2 芸薹属 ANR基因家族干扰片段的扩增
以 5B 总 cDNA 为模板，采用引物组合 FBAN-
RI＋RBANRI 扩增芸薹属 ANR 基因家族干扰片段
BANRI，50 μL标准 PCR体系含 0．5 μL 模板和 1．5U
Easy－Taq DNA聚合酶， 反应条件为：94℃预变性 2
min；94℃变性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1
min，30个循环；最后 72℃延伸 10 min。电泳照相后，
切胶回收目的条带 ， 与 pMD19－T 连接重组为
pMD19－T－BANRI，转化 DH5α ［10］，PCR 阳性的克隆
子菌液送样采用 M13F测序。
1．3 芸薹属 ANR 基因家族 RNA 干扰载体的构建
与鉴定
取 pMD19－T－BANRI 和 pFGC5941M 质粒 ，均
表 1 本研究所用引物
引物名
FBnPAP2I2
RBnPAP2I2
FBANRI
RBANRI
F35S3N
ROCST5N
Tm 值
56.71~63.50
59.20~63.15
60.61~71.06
57.73~65.84
59.20
62.86
位置
BnPAP2 第 2 内含子
左边界处
BnPAP2 第 2 内含子
右边界处
BnANR2mRNA的
340~360bp
BnANR2mRNA的
1 014~991bp
CaMV 35S 的 3′
OCS 终止子的 5′
序列（5′－3′）
ATTTAAATGACGTCAGG
TTTACATTCAAGACACA
GGATCCACCTAAGCAT
GCATTTGAAAA
GGATCCGACGTCAAGA
TCCCGAGAAAGACATG
TCTAGACCATGGATATC
ATGTTCAAATTCAAAGCC
GGAAGTTCATTTCATT
TGGAGAG
GCTCAGGTTTTTTACA
ACGTGCAC
方向
正向
反向
正向
反向
正向
反向
酶切位点
SwaⅠ， AatⅡ
BamHⅠ
BamHⅠ， AatⅡ
XbaⅠ， NcoⅠ
用途
扩增间隔区，载体鉴定
扩增间隔区，载体鉴定
扩增芸薹属 ANR RNAi 片段，
载体鉴定
扩增芸薹属 ANR RNAi 片段，
载体鉴定
载体鉴定
载体鉴定
770
第 4 期
进行 NcoⅠ＋AatⅡ双酶切至完全， 电泳后分别回收
反义片段 BANRIA 和开环的 pFGC5941M 骨架，采
用 T4 DNA连接酶将二者于 16℃连接 12 h， 得到重
组质粒 pFGC5941M－BANRIA， 转化 DH5α， 菌液
PCR阳性的单克隆提取质粒。
采用 BamHⅠ＋XbaⅠ分别对 pMD19－T－BANRI
和 pFGC5941M－BANRIA 进行完全双酶切， 电泳后
分别回收正义片段 BANRIS 和开环的 pFGC5941M－
BANRIA 骨架， 采用 T4 DNA 连接酶将二者于 16℃
连接 12 h，得到重组质粒 pFGC5941M－BANRI，转化
DH5α，对克隆子菌液进行复合 PCR 检测，阳性克隆
子即为芸薹属 ANR基因家族 RNA干扰载体。
1．4 工程菌株的获得
从鉴定无误的大肠杆菌单克隆菌液中抽提
pFGC5941M－BANRI 质粒， 用液氮冷激法转化根癌
农杆菌 LBA4404（感受态细胞制备同 DH5α），LB 平
板和单克隆菌液均采用 Kan （100 mg ／ L）、Rif （40
mg ／ L）和 Str （20 mg ／ L）三重筛选 ［9］，菌液 PCR 鉴定
同 1．3，阳性单克隆培养后作为植物转化的工程菌株。
2 结果与分析
2．1 芸薹属 ANR基因家族干扰片段的克隆
引物组合 FBANRI＋RBANRI 扩增 5B 总 cDNA
模板后，PCR 产物电泳后得到一条与预期大小一致
的特异条带（图 1）。将其回收，与 pMD19－T连接，转
化 DH5α，PCR 阳性的 2 个单克隆菌液测序后实际
长度均为 697bp， 序列一致， 它对应于 BnANR2 基
因，与其 mRNA 对应区段只相差 4 个碱基，估计是
等位基因间的 SNP差异所致（图 1）。
2．2 芸薹属 ANR 基因家族 RNA 干扰载体的构建
与检测
pMD19－T－BANRI 经 NcoⅠ＋AatⅡ完全双酶切
1
81
161
241
321
401
481
561
641
g g a t c c g a c g t CAAGATCCCGAGAAAGACATGATCAATCCAGCGATACAAGGAGTGATCAACGTGTTGAAATCTTGCTTA
AATTCGAACTCAGTCAAGCGCGTGATCTACACTTCTTCAGCTGCCGCGGTTTCTATCAACAATCTTTCAGGACCTGGACT
TGTGATGACCGAAGAAAACTGGTCTGATATTGATTTTCTCAGAAAGGAGAAGCCGTTTAACTGGGCCTACCCAATCTCAA
AGGTGTTAGCAGAAAAGGCAGCTTATCAATTTGCGCAAGAGAATAATATCGATCTCGTTACCGTGGTTCCAGCACTCATA
GCTGGAAACACTCTCATCGATGATCCTCCTCCGAGCAGTTTATCTCTCTCGATGTCTTTGATTACCCGGAAAGAAATGCA
TCTGAACGCTCTCAAGGAAATGCAGAAGCTATCTGGCTCCATCTCGTTCATCCACGTGGATGACCTAGCTTGTGCCCATC
TGTTTCTTGCGGAAAAAGAAACAGCTTCTGGTCGCTACATTTGTTGTTCTTACAACACAAGTATTCCAGAGCTAGCGGAT
TTTCTCAGAAAAAGATATCCTCGGTACAATGTTTTGTCAGAATTTGAAGAGTGCTTAGCAACTGCGAAACTGACGCTTTC
CTCAGAAAAACTCATCAATGAAGGCTTTGAATTTGAACATGATATC c a t g g t c t a g a
NcoⅠ XbaⅠ
BamHⅠ AatⅡ
图 1 BANRI 的扩增（左）和序列（右）
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1
后，除 T 载体条带外，产生了与预期 683 bp 一致的
条带， 另有一条 500 bp 左右的杂带， 特异回收该
683 bp 的反义片段 ， 记为 BANRIA （图 2A）。
pFGC5941M 经 NcoⅠ＋AatⅡ完全双酶切，得到了开
环 的 载 体 骨 架 （图 2B）， 回 收 。 BANRIA 与
pFGC5941M骨架连接，得到 pFGC5941M－BANRIA，
转化 DH5α，抗 Kan 单克隆菌液采用引物组合 RB-
nPAP2I2＋RBANRI 和 F35S3N＋FBANRI 进行 PCR
鉴定， 分别扩增出了与预期 864 bp 和 801 bp 一致
的条带（图 2C），说明反义片段已按正确方向插入到
启 动 子 与 间 隔 区 之 间 ， 形 成 了 中 间 载 体
pFGC5941M－BANRIA。
采用 BamHⅠ＋XbaⅠ对 pMD19－T－BANRI 和
pFGC5941M－BANRIA 质粒进行双酶切， 前者产生
了与预期 695 bp一致的正义片段 BANRIS（图 2D），
后者产生了与预期一致的 pFGC5941M－BANRIA 开
环骨架（图 2E），回收二者，连接重组，得到干扰载体
pFGC5941M－BANRI，转化 DH5α。 抗 Kan单克隆菌
液采用引物组合 FBnPAP2I2 ＋RBANRI 和 ROC-
ST5N＋FBANRI 进行检测， 扩增出了与预期 878bp
和 816bp一致的条带（图 2F），说明正义片段已按正
确方向插入到间隔区与终止子间。 同时，对单克隆
菌液还采用 F35S3N＋RBnPAP2I2 和 FBnPAP2I2＋
ROCST5N 进行 PCR， 再次验证反义片段和正义片
段插入的位置和大小， 结果分别扩增得到与预期
968 bp和 997 bp一致的片段（图 2G）。 综合 PCR鉴
定表明，BnANRIA片段在 35S启动子与间隔区之间
反义插入，BnANRIS 片段在间隔区与终止子之间正
义插入，两个片段的插入大小和方向均正确，表明
RNA干扰载体 pFGC5941M－BANRI（简称为 pBAN-
RI）构建成功（图 3）。
2．3 重组载体转化根癌农杆菌及鉴定
提取 2．2 中鉴定正确的 DH5α 单克隆的质粒，
采用冻融法导入根癌农杆菌菌株 LBA4404，获得抗
Kan、Rif 和 Str 的菌落， 抗性单克隆的菌液采用与
2．2一样的复合 PCR鉴定，取得完全一样的结果，表
孟繁敏等：芸薹属 ANR（BAN）基因家族 RNA 干扰载体的构建 771
湖 北 农 业 科 学 2010 年
图 3 RNAi 载体 pFGC5941M－BANRI 质粒图
明干扰载体 pBANRI 已成功转入到 LBA4404 中，载
体结构保持完整，形成了工程菌株，可直接用于植
物转化。
3 讨论
植物中普遍存在基因家族现象，RNAi 既可用
于对不同成员进行分别沉默，也可用于对整个家族
进行有效沉默，因此基因沉默也可以作为功能基因
研究和分子育种的重要工具； 保守区构建的 RNA
干扰片段与靶基因的一致性即使低至 72％左右，也
仍然会介导一定程度的基因沉默［10，11］。 本课题组经
过克隆和 Southern 杂交表明，甘蓝型油菜只有 4 条
ANR 基因（BnANR1－BnANR4），亲本物种白菜有 2
条 ANR 基因 （BrANR1 和 BrANR2）， 甘蓝有 2 条
ANR基因（BoANR1和 BoANR2），BnANR1、BnANR2
起源于 BoANR1、BoANR2；BnANR3、BnANR4 起源
于 BrANR1、BrANR2；来自 3 个物种的 8 条 ANR 基
因之间在全长 mRNA 水平的一致性介于 83．5％～
99．8％，RNA干扰片段 BANRI与 BnANR1、BnANR2、
BnANR3、BnANR4、BrANR1、BrANR2、BoANR1、
BoANR2 在 mRNA 水平的一致性分别达到 88．7％、
99．4％、90．4％、98．2％、90．1％、98．2％、88．6％、100．0％，
因此理论上推测干扰载体 pFGC5941M－BANRI 可
用于甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等多个芸薹属物种的
转基因，介导 ANR基因家族的高效沉默。 而且该载
体不会引起对 DFR等基因的非靶向沉默。
本课题组在将 pFGC5941 改进成 pFGC5941M
时引入的 AatⅡ切点有助于在启动子与间隔区之间
插入干扰片段 ， 但 pMD19－T 的 TA 克隆位点的
M13F 一侧的 500bp 上游存在一个 AatⅡ切点，所以
本研究在用 NcoⅠ＋AatⅡ从重组 pMD19－T 载体上
切下反义片段时，伴随产生了一个 500bp 左右的载
体片段， 对目标片段的判断和切胶产生了一些干
扰。如果用 pGEM-T系列载体代替 pMD19－T系列，
则不存在该现象， 因为它们的 AatⅡ位于多克隆位
点中， 酶切虽然会产生一个 44bp 以下的极短杂片
段，但它不会妨碍对目标基因片段的判断和切胶。
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M CK 2 M CK 3 4 M 5 M CK 6 M CK 7 8 M 9 10 M 11
5 000
3 000
2 000
1 000
750
500
250
100
23 130
9 416
4 361
3 000
2 000
1 000
750
500
250
100
5 000
3 000
2 000
1 000
750
500
250
100
5 000
3 000
2 000
1 000
750
500
250
100
图 2 RNAi 载体 pFGC5941M－BANRI 构建中的酶切和 PCR 鉴定
A B C D E F G
A．NcoⅠ＋AatⅡ双酶切 pMD19－T－BANRI；B．NcoⅠ＋AatⅡ双酶切 pFGC5941M；C．pFGC5941M－BANRIA 的克隆子菌液 PCR 检测；D．BamH
Ⅰ＋XbaⅠ双酶切 pMD19－T－BANRI；E．BamHⅠ＋XbaⅠ双酶切 pFGC5941M－BANRIA；F、G．pFGC5941M－BANRI 的克隆子菌液 PCR检测
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