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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY　BULLETIN 2010年第 9期
芸薹属原花青素跨膜转运蛋白 TT12、AHA10基因
家族 RNA干扰载体的构建
冯瑜 马丽娟 闫楠 何芳莹 柴友荣
(西南大学农学与生物科技学院农业部生物技术与作物品质改良重点实验室
重庆市作物品质改良重点实验室重庆市油菜工程技术研究中心 ,重庆 400716)
　　摘　要:　拟南芥 TT12和 AHA10基因分别编码 MATE类型和 H+泵类型的跨膜转运蛋白 , 介导原花青素单体向液泡的
转运 , 对种皮色素的积累起重要作用。甘蓝型油菜是重要的油料作物 , 但缺乏黄籽基因型 , 现有黄籽材料表型不稳定 , 黄籽性
状的分子机理不清 , 缺乏相关的分子育种。 克隆了芸薹属 TT12和 AHA10基因家族的 RNA干扰载体片段 BTT12I和 BA-
HA10I,以基于 pFGC5941而改造的植物 RNA干扰基础载体 pFGC5941M为骨架 ,构建了相应的 RNAi载体 pFGC5941M-BTT12I
(简称 pBTT12I)和 pFGC5941M-BAHA10I(简称 pBAHA10I), 通过分子鉴定后转化农杆菌 , 获得工程菌株 , 有利于通过基因沉
默技术研究 TT12和 AHA10基因在芸薹属种皮色素跨膜转运中的作用和机理 , 探索黄籽性状的分子育种。
关键词:　芸薹属 油菜 黄籽 跨膜转运蛋白 TT12基因 AHA10基因 RNAi载体
ConstructionofRNAiVectorsofBrasicaTT12 andAHA10
GeneFamilieswhichEncodeTransmembrane
TransportersofProanthocyanidins
FengYu MaLijuan YanNan HeFangying ChaiYourong
(ChongqingRapeseedTechnologyResearchCenter, ChongqingKeyLaboratoryofCropQualityImprovement,
KeyLabofBiotechnology＆CropQualityImprovementofMinistryofAgriculture, Colegeof
AgronomyandBiotechnology, SouthwestUniversity, Chongqing400716)
　　Abstract:　ArabidopsisthalianaTT12andAHA10 geneencodeaMATEtypeandaH+-ATPasetypetransmembranetransporters
respectively, mediatingthetransportingofproanthocyanidinmonomersintothevacuolesandaffectingthedepositionofseedcoatpig-
ments.Brassicanapusisanimportantoilcrop, butitlacksyelow-seedgenotypes.Currentyelow-seededstockshaveunstablepheno-
types, themolecularmechanismofyelowseedtraitisunclear, andlitlemolecularbreedingonthistraithasbeenreported.Inthisstud-
y, fragmentsBTT12IandBAHA10ItargetedtoRNAiofBrassicaTT12andAHA10genefamilies, respectively, werecloned, andthecor-
respondingRNAivectorspFGC5941M-BTT12I(simplifiedaspBTT12I)andpFGC5941M-BAHA10I(simplifiedaspBAHA10I)were
constructedusingpFGC5941MastheplantRNAibasicvectorwhichisanimprovedversionofpFGC5941.Aftermolecularidentifica-
tions, theyweretransformedintoAgrobacteriumtogenerateengineeringstrains, whichcouldpromotetheinvestigationoftheactionsand
mechanismsofTT12 andAHA10 geneintransmembranetransportingofseedcoatpigmentsandthemolecularbreedingofBrassica
yelowseedtraitbygenesilencingtechnology.
Keywords:　Brassica　Oilseedrape Yelowseed Transmembranetransporter TT12 gene　AHA10 gene　RNAivector
收稿日期:2010-03-22
基金项目:国家 “ 863”计划项目(2006AA10Z110, 2006AA10A113),国家自然科学基金项目(30771237),重庆市科技攻关项目(CSTC2009AB1030)
作者简介:冯瑜 ,女 ,硕士研究生 ,研究方向:分子生物学;E-mail:xuxb 4156@sina.com
通讯作者:柴友荣 , E-mail:chaiyourong1@163.com
甘蓝型油菜(Brasicanapus, AACC)是由芸薹属 二倍体物种白菜(B.rapa, AA)和甘蓝(B.oleracea,
DOI :10.13560/j.cnki .bio tech.bul l.1985.2010.09.029
2010年第 9期　　　　冯瑜等:芸薹属原花青素跨膜转运蛋白 TT12、AHA10基因家族 RNA干扰载体的构建
CC)通过天然远缘杂交 、染色体自然加倍而产生的
异源四倍体物种 。黄籽性状是油菜的一个综合优
质性状 ,可同时提高饼粕和油的品质 ,虽然甘蓝和
白菜中均存在稳定的天然黄籽基因型 ,但是甘蓝
型油菜中却没有 ,已有的黄籽甘蓝型油菜系通过
种间杂交而选育 , 材料稀缺 , 表现型欠稳定 , 选育
难度大 [ 1-3] 。
种皮色素是由公共苯丙烷途径 、核心类黄酮途
径 、原花青素分支途径组成的一个复合途径合成的
多酚类次生物质 ,该途径在植物界较为保守 ,其主要
位点和分子机理已较为清晰 ,而原花色素分支途径
的一些分子机理尚欠明确 [ 4, 5] 。拟南芥种皮色素积
累的众多关键酶 、转动蛋白和调控因子中 ,任何一个
功能基因的突变均会导致种皮色素沉积的阻断或弱
化 ,种皮由传统的深褐色变为黄色甚至透明种
皮 [ 6] 。芸薹属与同为十字花科的模式植物拟南芥
(ArabidopsisthalianaL.)亲缘关系较近 ,功能基因上
具有相似性 。
原花青素单体经关键酶合成以后 ,需要转运蛋
白将其转运到液泡中沉积 ,最终形成种皮色泽 。拟
南芥 TT12和 AHA10基因均编码跨膜转运蛋白 ,与
类黄酮物质黄烷三醇的液泡跨膜转运有关 ,是原花
青素在液泡中沉积的重要决定因子 。TT12基因编
码多药和有毒化合物排出家族(multidrugandtoxic
compoundextrusion, MATE)次级转运蛋白 , t12基因
突变体种皮中原花青素的积累受到了影响[ 7] 。拟
南芥基因组中共有 11个基因编码质膜 H+泵(H+-
ATPase), 构成 autoinhibitedH+-ATPase(AHA)家
族 。代表性的 H+-ATPase按结构分为 P型 、F型和
V型 , AHA10属于 P型。 AHA10基因特异性地在发
育的种子中表达 , aha10基因突变体的液泡发育延
迟 ,种皮中花青素积累正常 , 但原花青素下降
99%[ 8] 。拟南芥 TT19基因编码谷胱苷肽-S-转移酶
(GST),参与原花青素和花青素苷的转运 [ 9] 。关于
原花青素的转运 , 仍然存在诸多疑问 。 TT12和
AHA10均为跨膜转运蛋白 ,但它们的蛋白属性和作
用机理不同 ,在原花青素的跨膜转运中它们是联合
作用还是单独作用? TT19本身不具有膜蛋白特征 ,
它究竟是在什么地方怎么参与转运的 ? TT19、TT12
和 AHA10在转运原花青素时有无先后顺序 ,顺序
怎样 ?
本课题组已完成了甘蓝型油菜 、白菜 、甘蓝的
TT12基因家族和 AHA10基因家族的克隆 ,生物信
息学预测和 RT-PCR检测表明它们与拟南芥 TT12
和 AHA10基因具有相似功能 ,且参与了芸薹属黄籽
性状的形成 ,但无论是属间和种间的垂直同源基因
间还是种内的水平同源基因间 , TT12和 AHA10基
因均表现出了一些差异性[ 10] 。本研究在此基础上 ,
设计和构建了芸薹属 TT12和 AHA10基因家族的
RNA干扰载体 ,为通过基因沉默技术研究 TT12和
AHA10基因在芸薹属种皮色素跨膜转运中的作用
和机理 、探索黄籽性状的分子育种奠定了基础。
1　材料与方法
1.1　菌株和质粒
大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株 DH5α、根癌农
杆菌菌株 LBA4404、含 BnTT12-1和 BnAHA10-1全
长 cDNA的重组 pMD19-T质粒(pMD19-T-BnTT12-
1和 pMD19-T-BnAHA10-1 ,作为扩增干扰片段的
模板),均由本实验室保存。 pMD19-T载体购自大
连宝生物(TaKaRa)。植物 RNA干扰基础载体 pF-
GC5941M是由本课题组在 pFGC5941(购自国际
拟南芥中心)的基础上改进而成 ,改进之处是采用
来自甘蓝型油菜的 BnPAP2基因第 2内含子(Bn-
PAP2I2)替换了 pFGC5941上过长的 PhChsA基因
间隔区 ,并在间隔区与启动子间增加了一个 AatII
切点 ,使载体构建和鉴定更方便 ,更有把握高效地
介导目标基因的沉默 。
1.2　酶 、试剂盒及生化试剂
各种限制性内切酶为 Roche公司产品 , DNA
连接试剂盒和 λ-HindIIDNAmarker购自大连宝
生物 , Easy-TaqDNA聚合酶及相关 PCR相关试
剂 、DL2000 plusDNAmarker为北京全式金(Trans-
gen)产品 ,胶回收试剂盒 ,小量质粒抽提试剂盒为
上海华舜产品 , 氨苄青霉素 (Amp)、卡那霉素
(Kan)、利福平 (Rif)、链霉素(Str)等试剂购自上
海生工 。引物合成(表 1)和测序由上海英骏(In-
vitrogen)公司完成 。
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生物技术通报 Biotechnology　Buletin 2010年第 9期
表 1 本研究所用引物
引物名 序列(5′-3′) Tm值(℃) 位置 方向 酶切位点 用途
FBnPAP2I2 ATTTAAATGACGTCAGGTTTACATTCAAGACACA 56.71/63.50
pFGC5941M间 隔 区的
5′端 正向
SwaI,
AatI
扩增间 隔区 , 载体
鉴定
RBnPAP2I2 GGATCCACCTAAGCATGCATTTGAAAA 59.20/63.15
pFGC5941M间 隔 区的
3′端 反向 BamHI
扩增间 隔区 , 载体
鉴定
FBTT12I GGATCCGACGTCGCAAGACAGTACTCATCAATG 60.81/70.87
BnTT12-1 mRNA
的 427-448 bp 正向
BamHI,
AatI
扩 增 芸 薹 属 TT12
RNAi片段 ,载体鉴定
RBTT12I TCTAGATTTAAATACAACTCGGGCTCATCACG 62.45/65.93
BnTT12-1 mRNA
的 836-817 bp 反向
XbaI,
SwaI
扩 增 芸 薹 属 TT12
RNAi片段 ,载体鉴定
FBAHA10I GGATCCGACGTCTTGGAATCTCGTATTGGACC 60.61/71.06
BnAHA10-1 mRNA
的 2767-2787 bp 正向
BamHI,
AatI
扩增芸薹属 AHA10
RNAi片段 ,载体鉴定
RBAHA10I TCTAGACCATGGACAGTATGAGCTGCACGGA 62.45/69.93
BnAHA10-1 mRNA
的 3029-3010 bp 反向
XbaI,
NcoI
扩增芸薹属 AHA10
RNAi片段 ,载体鉴定
F35S3N GGAAGTTCATTTCATTTGGAGAG 59.20
pFGC5941M的
CaMV35S的 3′端 正向 载体鉴定
ROCST5N GCTCAGGTTTTTTACAACGTGCAC 62.86
pFGC5941M的
OCS终止子的 5′端 反向 载体鉴定
1.3　芸薹属 TT12和 AHA10基因家族干扰片段的
克隆
对已克隆的甘蓝型油菜 TT12(BnTT12)基因家
族 、白菜 TT12(BrTT12)基因 、甘蓝 TT12(BoTT12)
基因和拟南芥 MATE基因超家族各基因成员的全
长 cDNA进行多重比对 ,选择在 TT12基因家族特异
保守 、与 MATE基因超家族其它功能基因有显著差
异性的区段 ,以 BnTT12-1基因全长 cDNA的对应区
段作为干扰载体构建的模板序列 ,设计了正向引物
FBTT12I和 RBTT12I。
对已克隆的甘蓝型油菜 AHA10(BnAHA10)、白
菜 AHA10(BrAHA10)、甘蓝 AHA10(BoAHA10)基
因家族和拟南芥 AHA基因大家族各成员的全长
cDNA进行多重比对 ,选择在 AHA10基因家族特异
保守 、与 AHA基因家族其它功能基因有显著差异性
的区段 ,以 BnAHA10-1基因全长 cDNA的对应区段
作为干扰载体构建的模板序列 , 设计了正向引物
FBAHA10I和 RBAHA10I。
提取 pMD19-T-BnTT12-1和 pMD19-T-BnAHA10-
1质粒为模板 , 分别采用引物组合 FBTT12I+
RBTT12I、FBAHA10I+RBAHA10I进行 PCR扩增 ,标
准 50 μL体系含 0.1 μL模板和 1.5 UTaqDNA聚合
酶 ,反应程序:94℃预变性 2 min;94℃变性 1 min,
60℃退火 1 min, 72℃延伸 1 min, 35个循环;最后
72℃延伸 10 min。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳 ,
GoldView染色和照相后 ,在紫外观测仪中切下目的条
带 ,进行胶回收。
将回收片段分别与 pMD19-T进行 10 μL标准
体系连接 , 构成重组载体 pMD19-T-BTT12I和
pMD19-T-BAHA10I,转化用 CaCl2二次重悬法制备
的 DH5α感受态细胞 ,通过 Amp(100 mg/L)抗性和
IPTG/X-gal蓝白斑筛选 [ 11] ,白色菌落克隆子的菌液
采用 PCR鉴定(程序同上 ,预变性增加到 5 min,循
环数增加到 35),各送 2个阳性克隆子测序 。
1.4　载体骨架的制备和反义片段的插入
测序正确的含有 pMD19-T-BTT12I和 pMD19-
T-BAHA10I的 DH5α单克隆培养到对数晚期 , 抽
取质粒 。用 SwaI+AatII双 酶 切 pMD19-T-
BTT12I, 用 NcoI+AatII双酶切 pMD19-T-BA-
HA10I,体系总体积均为 50 μL,其中含质粒 DNA
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2010年第 9期　　　　冯瑜等:芸薹属原花青素跨膜转运蛋白 TT12、AHA10基因家族 RNA干扰载体的构建
20 μg、两种酶各 10 U、1 ×Tangobufer。同样采用
这 2种方案对 pFGC5941M进行双酶切 ,体系同
前 。 37℃酶切过夜 ,酶切完全后进行电泳 ,分别纯
化回收反义片段 BTT12IA和 BAHA10IA基因以及
开环的 pFGC5941M骨架 。将回收的反义片段分
别与载体骨架进行 10 μL标准体系连接 ,重组载
体转化 DH5α,以抗 Kan(100 mg/L)的单克隆菌落
的培养菌液为模板进行 PCR鉴定 , BTT12I基因的
引物组合为 F35S3N+FBTT12I和 RBTT12I+RBn-
PAP2I2 , BAHA10I基因的引物组合为 F35S3N+
FBAHA10I和 RBAHA10I+RBnPAP2I2,体系及程序
同前 ,选取全阳性的克隆子提取重组质粒 ,分别命名
为中间载体 pFGC5941M-BTT12IA和 pFGC5941M-
BAHA10IA。
1.5　中间载体的酶切和正义片段的插入
用 BamHI+XbaI完全双酶切质粒 pMD19-T-
BTT12I和 pMD19-T-BAHA10I,体系同前 ,电泳后分别
回收正义片段 BTT12IS和 BAHA10IS基因。同样 ,采用
BamHI+XbaI完全双酶切中间载体 pFGC5941M-
BTT12IA和 pFGC5941M-BAHA10IA的质粒 ,回收开环
的中间载体。将回收的正义片段分别与对应的开环中
间载体进行 10 μL标准体系连接 ,重组载体转化
DH5α,以抗 Kan的单克隆菌落的培养菌液为模板进行
复合 PCR检测 ,全阳性克隆子含有干扰载体 ,分别命名
为 pFGC5941M-BTT12I和 pFGC5941M-BAHA10I(简称
为 pBTT12I和 pBAHA10I)。
1.6　RNAi载体转化根癌农杆菌
根癌农杆菌 LBA4404感受态细胞的制备同
DH5α,采用液氮冷激法转化 pFGC5941M-BTT12I和
pFGC5941M-BAHA10I[ 12] ,涂布于含 Kan(100 mg/
L)、Rif(40 mg/L)和 Str(20 mg/L)的 YEB平板 ,
28℃倒置培养 2 d至长出直径 2 mm的菌落 ,挑取抗
性菌落接种于含有与前面相同抗生素的 YEB液体
培养基中培养 ,菌液 PCR检测同上。
2　结果与分析
2.1　干扰片段的克隆
以 pMD19-T-BnTT12-1和 pMD19-T-BnAHA10-1
质粒为模板 ,分别用引物组合 FBTT12I+RBTT12I
和 FBAHA10I+RBAHA10I进行扩增 ,分别得到与
预期一致的特异条带(图 1-A)。胶回收 、TA克隆 、
转化 DH5α后 ,挑选菌液 PCR阳性(图略)的 2个单
克隆测序 , 它们的序列一致 , BnTT12I基因为 433
bp, BnAHA10I基因为 285 bp(图 1-B),与 BnTT12-1
和 BnAHA10-1基因在对应区段完全一致。
1.BTT12I基因的扩增;2.BAHA10I基因的扩增;M.DL2000 plusMarker
图 1　干扰片段扩增 PCR(A)和序列(B)
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生物技术通报 Biotechnology　Buletin 2010年第 9期
2.2　反义片段插入———中间载体的构建
电泳显示 , pMD19-T-BTT12I质粒用 SwaI+Aat
II双酶切产生了与预期的 417 bp一致的条带 ,
pMD19-T-BAHA10I质粒用 NcoI+AatI双酶切产
生了与预期的 271 bp一致的条带(图 2),回收这 2
个目标条带 ,得反义片段 BTT12IA和 BAHA10IA基
因 。pFGC5941M载体骨架分别用 SwaI+AatI和
NcoI+AatII进行双酶切 ,均产生了 10 kb左右的开
环线状质粒(图 2),回收该带。反义片段与匹配末
端的开环载体骨架进行对应连接 ,即将干扰片段反
向插入到 pFGC5941M的 CaMV35S启动子与间隔区
之间 , 得到中间载体 pFGC5941M-BTT12IA和 pF-
GC5941M-BAHA10IA,转化 DH5α的单克隆菌液进
行复合 PCR鉴定 。引物组合 F35S3N+FBTT12I和
RBTT12I+RBnPAP2I2分别从 pFGC5941M-BTT12IA
单克隆扩增出与预期 561 bp和 600 bp一致的条带 ,
引物组合 F35S3N+FBAHA10I和 RBAHA10I+RBn-
PAP2I2分别从 pFGC5941M-BAHA10IA单克隆扩增
出与预期 389 bp和 452 bp一致的条带 ,说明中间载
体构建成功(图 2)。
1.pMD19-T-BTT12I的 SwaI+AatII双酶切;2.pMD19-T-BAHA10I
的 NcoI+AatI双酶切;3.pFGC5941M的 SwaI+AatI双酶切;4.
pFGC5941M的 NcoI+AatII双酶切;5.pFGC5941M-BTT12IA单克隆
用引物组合 F35S3N+FBnTT12I检测;6.pFGC5941M-BTT12IA单克
隆用引物组合 RBnTT12I+RBnPAP2I检测;7.pFGC5941M-BA-
HA10IA单克隆用引物组合 F35S3N+FBnTT12I检测;8.pF-
GC5941M-BAHA10IA单克隆用引物组合 RBnAHA10I+RBnPAP2I2
检测;M.Marker(1, 2, 5, 6, 7, 8.DL2000 plus, 3.λ-HindII;4.λ-Hind
II与 DL2000 plus的混合物);CK.未酶切的质粒
图 2 涉及反义片段插入的酶切和中间
载体单克隆的 PCR检测
2.3　正义片段的插入 ——— RNA干扰载体的获得
用 BamHI+XbaI完全双酶切质粒 pMD19-T-
BTT12I和 pMD19-T-BAHA10I,电泳显示得到与预期
的 431 bp和 283 bp一致的目的条带(图 3),它们为正
义片段 BTT12IS和 BAHA10IS基因 ,回收这 2个条带。
采用 BamHI+XbaI完全双酶切中间载体 pF-
GC5941M-BTT12IA和 pFGC5941M-BAHA10IA的质粒 ,
电泳显示开环成功(图 3),回收约 10 kb的线状 pF-
GC5941M-BTT12IA和 p　FGC5941M-BAHA10IA。 将
BTT12IS基因与线状 pFGC5941M-BTT12IA连接 ,
BAHA10IS基因与线状 pFGC5941M-BAHA10IA连
接 ,即将正义片段插入到中间载体的间隔区与 OCS
终止子之间 ,得到重组质粒 pFGC5941M-BTT12I和
pFGC5941M-BAHA10I。转化 DH5α后 ,获得抗 Kan
的单克隆菌落和液体培养菌液。菌液复合 PCR鉴
定表明 ,引物组合 FBnPAP2I2 +RBTT12I、ROCST5N
+FBTT12I、 F35S3N+RBnPAP2I2、 FBnPAP2I2 +
ROCST5N分别从 pFGC5941M-BTT12I的单克隆菌
液扩增得到与预期 614 bp、552 bp、728 bp、733 bp一
致的条带 (图 3), 引物组合 FBnPAP2I2 +RBA-
HA10I、ROCST5N+FAHA10I、F35S3N+RBnPAP2I2、
FBnPAP2I2+ROCST5N分别从 pFGC5941M-BAHA10I
的单克隆菌液扩增得到与预期 466 bp、404 bp、556
bp、585 bp一致的条带(图 3),既说明正义片段已按
正确方向插入到间隔区与终止子间 ,还说明反义片段
和正义片段插入的位置和大小均正确 ,即载体构建
成功。
1.pMD19-T-BTT12I的 BamHI+XbaI双酶切;2.pMD19-T-BAHA10I
的 BamHI+XbaI双酶切;3.pFGC5941M-BTT12IA的BamHI+XbaI
双酶切;4.pFGC5941M-BAHA10IA的 BamHI+XbaI双酶切;5, 6, 7,
8.pFGC5941M-BTT12I单克隆用引物组合 FBnPAP2I2 +RBTT12I、
ROCST5N+FBTT12、F35S3N+RBnPAP2I2、FBnPAP2I2 +ROCST5N
检测;9, 10, 11, 12.pFGC5941M-BAHA10I单克隆用引物组合 FBn-
PAP2I2+RBAHA10I、ROCST5N+FBAHA10I、F35S3N+RBnPAP2I2、
FBnPAP2I2+ROCST5N检测;M.marker;CK.未酶切的质粒
图 3 涉及正义片段插入的酶切和
RNAi载体单克隆的 PCR检测
2.4　转化农杆菌及菌株的 PCR检测
提取 2.3中鉴定正确的阳性克隆子的质粒 ,通
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2010年第 9期　　　　冯瑜等:芸薹属原花青素跨膜转运蛋白 TT12、AHA10基因家族 RNA干扰载体的构建
过液氮冷激法转化农杆菌菌株 LBA4404,挑取抗
Kan+Str+Rif的单克隆子进行液体培养 ,采用与
2.3相同的引物组合进行菌液 PCR检测 ,得到与
2.3相同的结果(图略),说明 2个 RNA干扰载体
转化农杆菌成功 ,加甘油保存菌液即为工程菌株 。
本研究成功地将来自于甘蓝型油菜的干扰片段
BTT12I和 BAHA10I基因的反义片插入到改进型基
础载体 pFGC5941M的 CaMV35S启动子与间隔区
之间 ,将它们的正义片段插入到 pFGC5941M的间隔
区与 OCS终止子之间 ,形成了 RNA干扰载体 pF-
GC5941M-BTT12I(简称 pBTT12I, 11 042 bp)和 pF-
GC5941M-BAHA10I(简称 pBAHA10I, 10 722 bp)
(图 4)。
图 4　RNA干扰载体 pFGC5941M-BTT12I和
pFGC5941M-BAHA10I的质粒图
3　讨论
正义共抑制 、反义 、RNAi均是基因沉默技术 ,但
RNAi相对于反义及共抑制技术可获得更高的基因
沉默效率 ,已成为植物基因功能鉴定和创造分子育
种新材料的重要手段[ 13] ,相对很少量的 dsRNA分
子(数量远远少于内源 mRNA的数量)就能完全抑
制相应基因的表达 [ 14] 。本课题组此前已构建了一
个芸薹属 TT12基因家族的反义植物表达载体[ 15] ,
已将其转化了甘蓝型油菜黑籽品种中油 821,阳性
转基因植株与对照相比表现出了一定的种皮色素减
少的生物学效应 ,但总体上仍然具有相当量的种皮
色素沉积 ,说明反义抑制的程度还不够 。因此 ,我们
构建了芸薹属 TT12和 AHA10基因家族的 RNAi载
体 ,一方面希望通过强力抑制这些基因家族的表达 ,
探索芸薹属种皮色素跨膜转运的分子机理 ,并探索
创造转基因新型黄籽材料的可能性 ,另一方面对通
过 RNAi和反义转基因油菜的对比 ,可以评价象油
菜这种多倍体物种的基因家族沉默技术中 ,是否
RNAi也显著优于反义技术。
本课题组经过克隆和 Southern杂交表明 ,甘蓝
型油菜只有 2条 TT12基因 (BnTT12-1和 BnTT12-
2),其亲本物种白菜和甘蓝中均只有 1条 TT12基
因(分别为 BrTT12和 BoTT12),且 BnTT12-1来源于
BrTT12基因 , BnTT12-2来源于 BoTT12基因 ,来自 3
个物种的 4条 TT12基因之间在全长 mRNA水平的
一致性介于 95.4% -99.3%[ 10] 。 RNA干扰片段
BTT12I与 BnTT12-1、BnTT12-2、BrTT12、BoTT12基
因在 mRNA水平的一致性分别高达 100.0%、
97.6%、98.3%、97.6%,因此从理论上推导干扰载
体 pFGC5941M-BTT12I可用于甘蓝型油菜 、白菜 、甘
蓝等多个芸薹属物种的转基因 ,介导 TT12基因(家
族)的高效沉默 。设计时 , BTT12I基因位于编码区
TT12特异性保守区 ,与 MATE超家族的其它功能基
因无显著同源性 ,因此该载体不会引起对 TT12以
外的其它 MATE基因的非靶向沉默 。
本课题组经过克隆和 Southern杂交表明 ,甘蓝
型油菜只有 2条 AHA10基因(BnAHA10-1和 BnA-
HA10-2),亲本物种白菜有 2条 AHA10基因(BrA-
HA10-1和 BrAHA10-2),甘蓝中有 2条 AHA10基因
(BoAHA10-1和 BoAHA10-2),来自 3个物种的 6条
AHA10基因之间在全长 mRNA水平的一致性介于
94.6%-99.8%。 RNA干扰片段 BAHA10I与 BnA-
HA10-1、BnAHA10-2、BrAHA10-1、BrAHA10-2、BoA-
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生物技术通报 Biotechnology　Buletin 2010年第 9期
HA10-1、BoAHA10-2基因在 mRNA水平的一致性分
别为 99.2%、 95.1%、 93.5%、 93.9%、 99.2%、
95.4%,因此从理论上推导干扰载体 pFGC5941M-
BAHA10I也可用于甘蓝型油菜 、白菜 、甘蓝等多个
芸薹属物种的转基因 ,介导 AHA10基因家族的高效
沉默。 AHA基因大家族非常保守 ,拟南芥的 11个
成员在 mRNA水平的同源性很高 , BAHA10I基因位
于编码区的终止密码子之前即蛋白的 C端 ,此外干
扰片段与其它功能的 AHA基因的同源性低 , 为
AHA10基因的特异性保守区 ,因此该载体不会引起
对 AHA10基因以外的其它 AHA基因的非靶向
沉默。
参 考 文 献
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