全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2007年第3期
收稿日期:2007-01-19
基金项目:国家自然科学基金(30170772)
作者简介:张丽杰(1972-),女,硕士,讲师,研究方向:组织培养与植物育种,Tel:13840013718
通讯作者:沈海龙(1962-),教授,博导,研究方向:种苗学,树木组织培养,森林定向培育;Tel/Fax:0451-82191044,E-mail:shenhl-cf@nefu.edu.cn
全世界白蜡树属植物(FraxinusL.)约有 70多
种,广泛分布于北半球各地。我国白蜡树属植物约
20余种[1]。该属拥有水曲柳(F.mandshuricaRupr.)、
欧洲白蜡 (F.excelsiorL.)、美国白蜡(F.americana
L.)、细叶白蜡(F.angustifolia)等多种重要的阔叶用
材树种,具有很高的经济价值。长期以来,白蜡树属
树种以种子繁殖为主。但由于该树种种子具有深休
眠特性,给育苗生产带来了一定的困难。近几年来,
人们进行了萌芽更新[2]、扦插[3]、嫁接[4,5]及组织培养
[6~9]等无性繁殖方法的尝试,并取得一定的进展。虽
然这些无性繁殖方法在良种繁育方面具有很大的
应用潜力,但由于各种原因迄今还与生产应用存在
一定距离。而体细胞胚胎发生作为离体培养条件下
形态发生和植株再生的一条途径,因其高效转化成
完整植株的能力、高度的遗传稳定性和用于基础研
究的巨大潜力而受到广泛重视,它在良种繁育方面
具有更高的应用潜力。因此,深入细致地研究白蜡
树属树种的体细胞胚胎发生,形成一套完整的再生
系统,使其优良、稳定的基因型大规模应用于生产
无疑是有重要意义的。
在继美国白蜡[10]和细叶白蜡[11]成功实现体胚
诱导并获得再生植株后,有关白蜡树属树种体细胞
胚胎发生的研究日益深入。综述了白蜡树属树种体
胚发生的影响因素、体胚发生的过程及其机理的研
究进展作以介绍。
1 白蜡树属树种体细胞胚胎发生的影响因素
1.1 外植体
在白蜡树属植物体胚发生的研究中大多是以
合子胚或下胚轴为研究对象的。但在研究中发现,
选取的外植体不同,所获得的体胚发生率也不相
同。Tonon[11]在研究细叶白蜡的体胚发生是以合子
胚的子叶为外植体进行诱导的,其体胚发生率可达
40%;Preece[12]研究美国白蜡时以成熟合子胚为外
植体;孔冬梅[13]在水曲柳体胚诱导过程中则以未成
熟合子胚的子叶和胚轴为外植体,在诱导过程中发
现,二者虽然均可诱导体胚发生,但发生率大不相
白蜡树属植物体细胞胚胎发生进展
张丽杰 1 沈海龙 2 崔建国 1 周强 3
(1沈阳农业大学林学院,沈阳 110161;2东北林业大学林学院,哈尔滨 150040;3辽宁省实验林场,清原 113311)
摘 要: 综述了近年来国内外对白蜡树属植物体细胞胚胎发生的研究概况,对影响体细胞胚胎发生的主要可控因素
以及体细胞胚胎发生过程、机理、组织学方面作了介绍,并提出了白蜡树属体细胞胚胎发生研究的应用前景。
关键词: 白蜡树属植物 体细胞胚胎发生
AdvancesinSomaticEmbryogenesisofFraxinusSpecies
ZhangLijie1 ShenHailong2 CuiJianguo1 ZhouQiang3
(1ColegeofForestry,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161;2SchoolofForestry,NortheastForestryUniversity,
Harbin150040;3ExperimentalForestFarmofLiaoningProvince,Qingyuan113311)
Abstract: WesummarizedthesurveyofsomaticembryogenesisinFraxinusindomesticandoverseas,introduced
themostlycontrolablefactorsandtheproces,mechanism andhistologyinfluencingsomaticembryogenesis,andput
forwardtheapplicationforegroundofsomaticembryogenesisinFraxinus.
Keywords: FraxinusspeciesSomaticembryogenesis
DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2007.03.006
生物技术通报Biotechnology Buletin 2007年第3期
同,以未成熟合子胚的子叶为外植体时体胚发生率
最高,而下胚轴更加适于愈伤组织的发生。在一些
木本植物体胚发生的研究中,一般来说,子叶、胚
珠、叶片、胚及幼胚和下胚轴、幼花序轴都是较合适
的外植体。另外,外植体的来源和发育时期对能否
诱导体胚发生及发生频率都是极其重要的因素,甚
至外植体形态学部位也是影响因素之一。因为它会
因生长季节而丧失胚胎发生能力,Vasil根据对取
材时期外植体的发育状态可能是引发特定的离体
再生诱导间相应关系的大量观察资料,认为取材时
期外植体发育状态可能是引发特定的离体再生系
统的决定因素。因此,我们在诱导体胚发生的过程
中,应根据不同植物选取最适外植体,以期达到最
佳的诱导率。
1.2 培养基
体胚发生所选取的培养基一直是众多学者研究
的主要内容。因为在外植体一定的情况下,基本培
养基选择的合适与否直接影响组织培养的效果[14]。
白蜡树属树种中美国白蜡在 DKW培养基上胚性
培养物的诱导效果最好[15,16];细叶白蜡则以 MS培
养基诱导效果最佳[11]。而水曲柳的种胚在 MS培养
基上不能形成体胚,而在 WPM培养基上种胚虽有
生长并保持较长时间的生活力,但也未形成体胚;
在 B5培养基上光培养体胚的发生率只有 2%;而
在 MS1/2(MS的大量元素减半)培养基上黑暗条件
下培养体胚的发生率可以达到 18%。因此,对于水
曲柳来说,MS1/2培养基是诱导体胚发生最佳培养
基[13]。
1.3 激素组合
激素的选取是诱导体胚发生的关键因素之一。
在白蜡树属树种体胚诱导的研究中表明:美国白蜡
和细叶白蜡只有在附加 2,4-D的培养基中才能诱
导体胚[17]。生长素一般用 2,4-D或 NAA、IBA。研究
表明,2,4-D是诱导白蜡胚性培养物的唯一生长素
种类;美国白蜡用含 5!mol/L、2,4-D和 5!mol/L6-
BA的 DKW培养基初始培养 4-6周,胚性培养物的
诱导效果最好[15,16]。细叶白蜡胚性培养物的诱导要
求 MS培养基中 2,4-D与 6-BA的浓度比为 2:1,
且要求暗培养[11]。由此可见,2,4-D是诱导体胚发
生的主要激素。这与许多学者的研究结果相一致。
但树种不同,结果也不尽然;在水曲柳的体胚诱导
中加入 2,4-D不仅不能诱导体细胞胚胎的发生,当
浓度高于 0.5mg/L时还会大大加速外植体的褐化
和死亡[13]。因此,在植物离体培养中不是某类激素
单独起作用,植物的各种生理效应是不同种类间相
互作用的综合表现[18]。生长素和细胞分裂素是植物
离体培养常用的激素,二者不同浓度比例配合不但
可以诱导细胞分裂和生长,而且能控制细胞诱导和
形态建成。
1.4 碳源和氮源
碳源 在植物组织培养中糖类不仅为培养物提
供能量,而且是培养物渗透环境的主要调节者[19~22]。
因此糖的种类和用量不仅影响培养物生长速度和
生长量,而且影响其代谢水平、次生代谢合成、以及
细胞的形态和发生[23],是影响植物组织培养成功与
否的关键之一,也是体细胞胚胎发生最有效的还原
性碳源。一般来说,在一定浓度范围内提高渗透压有
利于体细胞胚胎的发生发育。在白蜡树属的水曲柳
体胚诱导中必须添加蔗糖才能诱导体胚,而且蔗糖
浓度为 7%时以子叶为外植体时体胚诱导率最高[13]。
而酪蛋白水解物作为还原性氮已在多个树种的体
胚发生中使用,在添加水解酪蛋白的培养基上可以
成功的诱导水曲柳体细胞胚[13],但它对美国白蜡和
细叶白蜡的体胚发生却不表现促进作用[15,24]。
1.5 培养条件
光照是影响体胚发生的重要环境因素。白蜡树
属植物在光培养和暗培养条件下均能发生体胚。细
叶白蜡在暗培养的条件下才能发生体细胞胚;水曲
柳的成熟胚和未成熟胚在光培养和暗培养条件均
能诱导出体细胞胚,但以在暗培养条件下体胚发生
率高一些[13]。
2 白蜡树属树种的体细胞胚胎发生
2.1 体细胞胚胎发生的方式
在白蜡树属树种的体胚发生研究过程中有两
种方式,即间接体胚发生和直接体胚发生。美国白
蜡种子外植体的体细胞胚胎发生有直接和间接发
生两种方式[16],其体细胞胚和胚性愈伤组织一般发
生于与下胚轴相连的子叶近轴处;Preece等[16]推测
这是由于合子胚的子叶缺少体细胞胚胎发生所必
须的某种物质,如激素,而正在萌发的种胚可为它
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提供该物质。而在水曲柳的体胚诱导中我们发现无
论在成熟胚或是未成熟胚的诱导中体胚的发生同
样也有直接和间接体胚发生,但这两种外植体均以
直接体胚发生方式为主[13]。
2.2 白蜡树属树种的体胚发生
体胚发生因其细胞单起源、繁殖速度快,且可
干化贮藏,因而成为目前植物组培中备受青睐的微
繁方式。体胚发生植株再生一般包括胚性培养物的
诱导、胚性培养物的保持和增殖、体胚的成熟和体
胚的萌发及再生植株。目前,白蜡树属有美国白蜡
和细叶白蜡成功实现了体胚发生并获得了再生植
株。
2.2.1 胚性培养物的诱导 胚性培养物的诱导是
外植体细胞重排其发育方向,由分化状态转化为脱
分化状态的过程[25]。它与外植体的生理状况、培养
基组成、激素浓度和种类、培养条件等有关。白蜡体
胚发生多以合子胚或下胚轴为外植体。合子胚的发
育时期是胚性培养物诱导的一个重要影响因素,适
宜诱导的发育时期因种而不同。细叶白蜡幼胚胚乳
呈液体状,而子叶刚形成时是诱导体胚的最佳时
期,体胚发生率可达 40%[11];美国白蜡则以成熟胚
较合适[26]。水曲柳的体胚诱导则以 7月下旬到 8月
中旬采集水曲柳的种子有最强的体胚发生潜力,此
时种子尚未成熟,以幼胚的子叶为最佳外植体,体
胚的发生率可以达到 33%[13]。
2.2.2 胚性培养物的保持与增殖 胚性培养物的
保持增殖就是通过诱导次生胚的形成和阻止胚的
成熟来保持胚的发生潜力,通常在降低生长素浓度
的培养基上进行。研究表明,不含 2,4-D的固体培
养基利于细叶白蜡胚性培养物的进一步发育,但不
利于胚发生潜力的保持;高浓度的 2,4-D容易引起
组织的褐变;0.4μmol/L2,4-D与 4.4μmol/L6-BA
结合既可使胚性愈伤组织有效增殖,还可长期保持
胚的发生潜力[11]。美国白蜡胚性培养物的增殖可在
含 0.5μmol/LNAA和 0.5μmol/L6-BA的 MS或不
含激素的 DKW培养基上进行,固体、液体培养均
可。液体振荡培养增殖速度大大快于固体培养,但
往往形成畸形胚。Preece和 Bates[15]在培养基中加入
1μmol/L草甘膦可有效抑制畸形胚的发生。Preece
和 Bates试验的美国白蜡 3个种源中,107802种源
种子的体胚发生率最高,可达 10%左右;1070420
种子体胚发生率最低,只有 4.5%;108101的体胚
发生率居中。
2.2.3 体胚的成熟 在体胚发育过程中最大的难
题是体胚异常:合生体胚,多子叶体胚,根尖分生组
织发育不健全,体胚早萌等。成熟培养旨在促进体
胚进一步发育,减少异常体胚,增强体胚萌发能力。
在成熟阶段主要是营养物质的积累。甘露醇、水解
酪蛋白和活性炭在促进多种植物体胚的成熟过程中
有重要作用[27~29]。但是水解酪蛋白对美国白蜡和细
叶白蜡的体胚成熟均无效,甘露醇和活性炭可促进
细叶白蜡体胚向子叶胚的发育[15,11]。最近,Tonon等
[30]用细叶白蜡胚性愈伤组织建立了细胞悬浮培养
系,并初步实现了体胚发生的同步化。他们发现,不
含激素的培养适合球形胚的发生和保持,而用密度
梯度离心法筛选最重的细胞群,并添加 NAA和 6-
BA,可使胚的后期发育基本一致。
2.2.4 体胚的萌发与植株再生 白蜡树属植物体
胚的萌发与转株的研究至今尚未取得十分满意的
结果。体胚发育的不同步是影响萌发率的重要因素
之一。目前所报道的体胚发生系统都是不同步的,
在同一培养物中可以观察到不同发育阶段的胚状
体。美国白蜡体胚转株率及移栽成活率都很低[15]。
将体胚苗上胚轴切除下来,在试管外间歇喷雾或高湿
条件下诱导生根,可有效提高再生植株的成活率[9,12]。
研究还发现,美国白蜡试管内形成的体胚有从 1片
子叶到多片子叶的变异,但试管外生根的再生植株
绝大多数正常[20]。细叶白蜡体胚在无激素的 MS培
养基上,萌发率高达 65%,但最终成活率很低。我们
只有实现了由体胚到健康植株的转变,体胚发生才
具有实际意义。因而,如何有效提高体胚质量,获得
高的转株率是目前亟待解决的问题。
3 体胚发生机理
要在木本植物育种中应用体胚发生这一现代
生物技术,最根本的是要了解其发生机理及其控
制。目前人们对体胚发生的机理尚未取得共识,一
般认为直接发生方式中体胚是由原先就存在于外
植体的胚性细胞-预胚胎决定细胞(PEDCs)培养后
直接进入胚胎发生而形成体胚[31]在间接体胚发生
中,外植体已分化的细胞先脱分化,并对其发育命
张丽杰等:白蜡树属植物体细胞胚胎发生进展 33
生物技术通报Biotechnology Buletin 2007年第3期
运重决定而诱导出胚性细胞-诱导胚胎决定细胞
(IEDCs),由他们进行胚胎发生发育成体胚。目前已
建 立 了 胡 萝 卜 和 苜 蓿 体 胚 发 生 模 式 系 统 。
Zimmerman已从胡萝卜体胚克隆了 20个基因,并
推测了在体胚发生晚期高效表达的 LEA基因产物
在胚发育后期干燥过程中对胚起保护作用。陈一华
[32]利用分子标记在拟南芥的研究中发现,体胚发生
是以减数分裂为前提的。以体胚发生遗传学为基
础,进行分子标记遗传学研究,有利于揭示植物细
胞全能性和体胚发生的机理。
4 体胚发生的组织学
组织学方法是研究体胚发育的重要方法之一。
目前主要用于体胚的起源,体胚的发育状况的研究
和对体胚在组织学水平上进行鉴定。对体胚起源于
单细胞还是多细胞表层细胞或内层细胞均有大量
的报道,现在尚无定论,可能不同的植物不同的外
植体处于不同的生理状态下,体胚的起源方式不
同。在水曲柳体胚发生中,外起源和内起源两种方
式都有。组织学还发现,水曲柳体胚的异常发育主
要发生在原胚形成以后,子叶原基形成时。体胚从
心形胚阶段开始出现了维管束呈明显的“丫”字形,
与母体组织相对立,有分生组织与茎分生组织,表
现明显的两极性[13]。
5 白蜡树属树种体胚发生的应用前景
有关白蜡树属植物体细胞无性系大规模应用
于生产的报道还未见,从目前研究进展来看,白蜡
树属体细胞无性系技术仍处于开始时期,开展研究
的树种还不多,已有的也是初步的研究成果,还有
许多问题需要进一步探讨。在白蜡树属树种体胚发
生的研究上应用:1)逐步扩大外植体的选用范围;
2)扩大研究树种的范围;3)提高体胚的发生率和高
质量体细胞胚,并控制体胚发生同步化;4)体胚萌
发率低,已经成为这一繁殖系统进一步发展的主要
瓶颈。增强再生植株的适应性,提高移栽成活;5)迫
切要求加强胚胎发生发育的生理生化和分子生物
学研究;6)加强组织学研究,深入了解体胚的起源,
为白蜡树属植物优良基因型快繁和遗传转化提供
理论依据。7)以体胚发生遗传学为基础,进行分子
标记遗传学研究,有利于揭示植物细胞全能性和体
胚发生的机理。
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