全 文 ：收稿日期：2008-01-10
基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划项目（2008）
作者简介：吴菲菲(1982 -)，女，沈阳农业大学硕士研究生，从事分子遗传学研究。 * 通讯作者 Corresponding author：张志宏(1968 -)，男，沈阳农业大
学教授，博士，从事果树生物技术与遗传育种的研究。
利用 cp DNA PCR-RFLP分析中国山楂属植物
的亲缘关系
吴菲菲，张志宏*，代红艳，张 叶，常琳琳
（沈阳农业大学 园艺学院，果树生物技术与遗传改良创新团队， 沈阳 110161）
摘要：以 8 个山楂种的 39 份种质资源为试材，采用 10 对叶绿体 DNA (chloroplast DNA, cp DNA) 通用引物对总 DNA 进行扩增，
并用 7 种限制性内切酶对 PCR 扩增产物酶切。 结果表明：5 对引物(cp01、cp03、cp04、cp05、cp10)在山楂属植物上扩增出特异谱带，
2 种限制性内切酶(Hinf I 和TaqI)的酶切产物在供试材料间存在差异。山楂属种间存在较为丰富的 cp DNA PCR-RFLP 多态性，但
山楂(C. pinnatifida)不同基因型间未检测到变异位点。 麻核组(Sect. Sanguineae)的甘肃山楂、光叶山楂、毛山楂、辽宁山楂和羽裂组
(Sect. Pinnatifidae)的伏山楂的 cp DNA PCR-RFLP 标记完全相同，但麻核组的阿尔泰山楂与其他山楂种的亲缘关系较远，距离系
数达 0.91。 可见，山楂属植物起源和演化的复杂性，伏山楂并非山楂的变种而很可能是一个新种。
关键词：山楂属；cp DNA；PCR-RFLP；亲缘关系
中图分类号：S661.5 文献标识码： A 文章编号： 1000-1700（2008）06-0664-05
Genetic Relationships of Some Hawthorns (Crataegus spp.) Derived from cp
DNA PCR-RFLP
WU Fei-fei, ZHANG Zhi-hong*, DAI Hong-yan, ZHANG Ye, CHANG Lin-lin
（College of Horticulture, Team of Biotechnology and Genetic Improvement of Fruit Trees, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China）
Abstract： Ten universal primer pairs of chloroplast genome were used to amplify cp DNA non-coding regions in eight Crataegus
species including thirty-nine genotypes. The PCR products were digested by seven restriction enzymes. Five primer pairs (cp01,
cp03, cp04, cp05 and cp10) generated special bands from Crataegus and the fragments digested by two restriction enzymes (Hinf
I and TaqI) were different in Crataegus species. Interspecies of the genus Crataegus had higher cp DNA variations, but no visual
bands were detected in different genotypes of C. pinnatifida. Four species of Sect. Sanguineae (C. kansuensis, C. dahurica, C.
maximouiczii, C. sanguine) and C. brettschneideri of Sect. Pinnatifidae had the same cp DNA PCR-RFLP markers, but C. altaica
of Sect. Sanguineae was distinct with others and the distance coefficient was 0.91. It is shown that the origin and evolvement of
the genus Crataegus was complicated and C. brettschneideri could be considered a new species, not a variation of C. pinnatifida.
Key words： Crataegus spp.; cp DNA; PCR-RFLP; genetic relationship
山楂属（Crataegus spp.）植物的分类一直比较混乱[1]，多倍化、无融合生殖、基因渗入等现象在山楂属植物中普
遍存在，使得山楂属的分类更加困难[2]。 因此，山楂属的分类不仅要依据形态学特征,同样也要依据分子数据[3]。 高
等植物叶绿体基因组为母性遗传，相对于核基因组结构和序列非常保守，进化速率仅为核基因的 1/5[4]。 与核
DNA 相比，叶绿体 DNA (chloroplast DNA, cp DNA)具有分子量小、多拷贝和结构简单的特点，这些都有利于
对叶绿体基因组进行分析。 所以， 叶绿体基因组被认为是研究种间甚至种内材料系统进化和亲缘关系的理想
工具[5,6]。 目前，cp DNA 序列比较和酶切特异扩增片段已经广泛应用于植物种类鉴定、遗传多样性和系统进化
研究[7-11]。基于 cp DNA的 PCR-RFLP 分析是目前叶绿体 DNA系统学研究中使用最为广泛的技术，也是物种鉴
别、种间杂种鉴定、物种混杂分析等研究的有力工具[12]。EMAD等[3]通过 PCR-RFLP 和微卫星技术发现了叶绿体
标记的山楂属遗传多态性，首次用叶绿体核苷酸序列(trnL-trnF,psbA-trnH)阐明了叙利亚南部山楂属内的系统
发生关系。 然而国内尚未有通过叶绿体 DNA对山楂属植物进行研究的报道。 因此，本研究对中国部分山楂属
植物的叶绿体 DNA 区域进行 PCR-RFLP 分析，以期为山楂属植物的分类提供分子证据，并为山楂属植物的进
化和演化分析提供新的依据。
沈阳农业大学学报，2008－12，39(6)：664-668
Journal of Shenyang Agricultural University，2008－12，39(6)：664-668
第 6期
表 1 供试山楂材料
Table 1 Name of the accessions of Crataegus spp.
序号 No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
资源名称 Name of accession
准葛尔山楂 Zhungeershanzha
甘肃山楂 Gansushanzha
光叶山楂 Guangyeshanzha
阿尔泰山楂 Aertaishanzha
左伏 2 Zuofu2
吉伏 1 Jifu1
吉伏 2 Jifu2
辽宁山楂 Liaoningshanzha
毛山楂 Maoshanzha
开原软籽 Kaiyuanruanzi
新宾软籽 Xinbinruanzi
大山里红 Dashanlihong
垂枝山里红 Chuizhishanlihong
秋红 Qiuhong
秋丰 Qiufeng
雾灵红 Wulinghong
抚顺上砖白山楂 Fushunshangzhuanbaishanzha
秋金星 Qiujinxing
大金星 Dajinxing
山东大金星 Shandongdajinxing
银冶岭 1 号 Yinyeling1
聂家峪 2 号 Niejiayu2
溪红 Xihong
辽红 Liaohong
甜水山楂 Tianshuishanzha
西丰红 Xifenghong
益都大黄面 Yidudahuangmian
子母红 Zimuhong
益都敞口 Yiduchangkou
益都红口 Yiduhongkou
徐州大货 Xuzhoudahuo
黄宝峪 1 号 Huangbaoyu1
滦红 Luanhong
隆化粉肉 Longhuafenrou
紫珍珠 Zizhenzhu
吉林叶赫山楂 Jilinyeheshanzha
吉林大旺 Jilindawang
河南豫北红 Henanyubeihong
百泉 7807 Baiquan7807
学名 Scientific name
C. songorica K. Koch.
C. kansuensis Wils.
C. dahurica Koehne ex Schneid.
C. altaica (Loud.)Lange.
C. brettschneideri Schneid.
C. brettschneideri Schneid.
C. brettschneideri Schneid.
C. sanguinea Pall.
C. maximouiczii Schneid.
C. pinnatifida Bge.
C. pinnatifida Bge.
C. pinnatifida Bge.
C. pinnatifida Bge.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.
1 材料与方法
1.1 材料
以国家果树种质沈阳山楂圃种植保存的 39份山楂资源为试材， 包括准葛尔山楂 （C. songorica K. Koch.）
（1）、甘肃山楂（C. kansuensis Wils.）（2）、光叶山楂（C. dahurica Koehne ex Schneid.）（3）、阿尔泰山楂（C. altaica
(Loud.)Lange.）（4）、伏山楂（C. brettschneideri Schneid.）（5~7）、辽宁山楂（C. sanguinea Pall.）（8）、毛山楂（C. maxi-
mowiczii Schneid.）（9）和山楂（C. pinnatifida Bge.）（10~13）共 8个种及山楂（C. pinnatifida Bge.）的变种大果山楂
（C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.）（14~39）（表 1），其中大果山楂和伏山楂资源全部为栽培品种。
1.2 总 DNA提取
从田间刚萌发的 1年生新梢上取幼嫩的叶片，液氮速冻后于-70℃低温冰箱中保存。 取 1.5 g 冻存的叶片，
采用改进的 CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide, 溴化十六烷基三甲基铵)法提取总 DNA[13]，提取缓冲液中
CTAB 的浓度由 2%提高至 3%。
1.3 PCR扩增叶绿体 DNA
采用 10 对基于 cp DNA 的 PCR 通用引物， 扩增叶绿体基因组中部分基因间隔区和内含子非编码序列。
吴菲菲等:利用 cp DNA PCR-RFLP 分析中国山楂属植物的亲缘关系 665· ·
第 39卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
表 2 cp DNA通用引物序列
Table 2 Sequences of cp DNA universal primer pairs
序号
No.
cp01
cp02
cp03
cp04
cp05
cp06
cp07
cp08
cp09
cp10
扩增区域
Region
trnH-trnK
trnS-trnfM
rbcL
trnk1-trnk2
trnC-trnD
trnD-trnT
trnM-rbcL
trnF-trnVr
trnS-trnT
psbC- trnS
正向序列（5-3）
Sequence forward(5-3)
acgggaattgaacccgcgca
gagagagagggattcgaacc
tgtcaccaaaaacagagact
gggttgcccgggactcgaac
ccagttcaaatctgggtgtc
accaattgaactacaatccc
tgctttcatacggcgggact
ctcgtgtcaccagttcaaat
cgagggttcgaatccctctc
ggtcgtgaccaagaaaccac
反向序列（5-3）
Sequence reverse(5-3)
ccgactagttccgggttcga
cataaccttgaggtcacggg
ttccatacttcacaagcagc
caacggtagagtactcggctttta
gggattgtagttcaattggt
ctaccactgagttaaaaggg
gctttagtctctgtttgtgg
ccgagaaggtctacggttc
agagcatcgcatttgtaatg
ggttcgaatccctctctctc
参考文献
Reference
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Demesure et al 1995
Demesure et al 1995
cp DNA 的 PCR 通用引物序列 [9, 14-15]见表 2。 反应体系为 1×Long Taq Buffer I，1U Long Taq DNA polymerase
(天根公司)，0.2 mmol·L-1 dNTPs (Promega 公司)，0.2μmol·L-1引物 (赛百胜合成)，50ng 总 DNA， 反应体积为
50μL。 PCR 程序为 94℃ 4min；94℃ 45s，56或 57℃ 45s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 10min；4℃保温[14]。
1.4 限制性酶切
应用 Alu I、Hae III、Hinf I、HspA I、Rsa I、Mva I 和 Taq I 共 7 种限制性内切酶对扩增出的 cp DNA 片
段进行酶切。酶切反应加入 3 U限制性内切酶和 5μL扩增产物，反应总体积为 10 μL。除 Taq I 的反应温度为
65℃外，其余的内切酶均在 37℃条件下反应 1h。
1.5 数据分析
扩增和酶切产物在含溴化乙锭（EB）的 3％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外透射仪上观察电泳结果，用数码相机
拍照记录凝胶图像。 根据琼脂糖电泳图谱上扩增片段酶切产物的有或无分别记为 1或 0，生成原始矩阵。 应用
DPS v7.05 版软件，计算 Jaccard 相异系数，采用非加权类平均法(UPGMA)进行 0-1数据系统聚类分析。
2 结果与分析
2.1 cp DNA通用引物在山楂属植物上的扩增结果
采用 10对 cp DNA 通用引物对 8个种 39份山楂属植物进行 PCR 扩增，结果表明，5 对引物扩增出特异谱
带，其中引物对 cp01、cp03 和 cp10 扩增出的片段大小在 1~2 kb 之间，引物对 cp04 扩增出的片段大小在 2~3
kb 之间，引物对 cp05 扩增片段较小，仅为 300~400bp。 引物对 cp02、cp06、cp07、cp08、cp09 未能在山楂属植物
上扩增出谱带。
2.2 PCR扩增产物的酶切分析
应用 Alu I、Hae III、Hinf I、HspA I、Rsa I、Mva I 和 Taq I 共 7 种限制性内切酶对 5 对引物扩增出的 cp
DNA 片段进行酶切，酶切产物经电泳后的结果显示：7 种限制酶均不能切开 cp05 的扩增产物；引物对 cp03 和
cp10 的扩增产物经 7 种限制酶酶切后酶切位点无差异；而 cp01 (trnH-trnK)和 cp04(trnk1-trnk2)的扩增产物经
限制酶 Hinf I和 Taq I酶切后，酶切位点有显著差异(图 1)。 30份大果山楂品种和开原软籽、新宾软籽、大山里
红、垂枝山里红等山楂种野生资源间的酶切位点没有差异，而不同的山楂种之间在酶切片段大小和数目上有一
定的差异。 阿尔泰山楂的 cp DNA 酶切位点与其他山楂都不相同（图 1，A和 C）；甘肃山楂、光叶山楂、伏山楂、
辽宁山楂、毛山楂与山楂在 trnk1-trnk2 /Taq I (图 1，B)和 trnH-trnK /Taq I (图 1，C)上明显不同；准葛尔山楂
与山楂除了在 trnk1-trnk2 /Taq I (图 1，B)上明显不同外，在其他的 cp DNA 酶切位点上完全相同。
2.3 山楂种间聚类分析
由于供试的 30 个山楂品种之间及 3 个伏山楂品种之间在 cp DNA PCR-RFLP 上没有差异， 所以在进行
山楂种间的聚类分析时，山楂和伏山楂各取 1个试材。 山楂属植物种间的系统发育分子树显示：准葛尔山楂与
山楂的距离系数为 0.20，亲缘关系比较近，首先聚为一组；甘肃山楂、光叶山楂、伏山楂、辽宁山楂和毛山楂等 5
个野生种的距离系数为 0，它们聚为一组，然后与准葛尔山楂和山楂聚在一起；阿尔泰山楂与其他山楂种的亲
缘关系较远，距离系数达 0.91，单独聚为一组(图 2)。
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第 6期
图 2 基于 cp DNA PCR-RFLP 标记的山楂属
植物种间的系统发育分子树
Figure 2 Dendrogram for the species of
Crataegus based on cp DNA PCR-RFLP
markers
图 1 山楂属植物 cp DNA特异扩增产物的酶切结果
A.trnk1-trnk2 /Hinf I；B.trnk1-trnk2 /Taq I；C.trnH-trnK /Taq I;1. 准葛尔山楂；2. 甘肃山楂；3. 光叶山楂；4. 阿尔泰山楂；5. 伏山楂（左伏 2）；6.
伏山楂（吉伏 1）；7. 伏山楂（吉伏 2）；8. 辽宁山楂；9. 毛山楂；10. 山楂（开原软籽）；11. 山楂（新宾软籽）；12. 山楂（大山里红）；
13. 山楂（垂枝山里红）；M. DNA 分子量 maker
Figure 1 Restriction patterns of amplified products from cp DNA in the genus Crataegus
A. trnk1-trnk2 /Hinf I; B. trnk1-trnk2 /Taq I; C. trnH-trnK /Taq I; 1. C. songorica; 2. C. kansuensis; 3. C. dahurica; 4. C. altaica;
5. C. brettschneideri Zuofu2; 6. C. brettschneideri Jifu1; 7. C. brettschneideri Jifu2; 8. C. sanguinea; 9. C. maximouiczii; 10. C. pinnatifida
Kaiyuanruanzi; 11. C. pinnatifida Xinbinruanzi; 12. C. pinnatifida Dashanlihong; 13. C. pinnatifida Chuizhishanlihong; M. DNA ladder
3 结论与讨论
本研究以 8 个山楂种的 39 份资源为试材， 采用目前已报道
的 10 对 cp DNA 通用引物对总 DNA 进行扩增，并用 7 种限制性
内切酶对扩增产物酶切，结果表明山楂属种间存在较为丰富的 cp
DNA PCR-RFLP 多态性，引物对 cp01(trnH-trnK)和 cp04(trnk1-
trnk2)的扩增产物经限制酶 Hinf I 和 Taq I 酶切后，酶切位点有
显著差异。但是甘肃山楂、光叶山楂、辽宁山楂和毛山楂这 4个野
生种未能区别开来，而且山楂(C. pinnatifida)不同基因型间未检测
到变异位点。 因此，cpDNA PCR-RFLP 标记在分析山楂遗传多样
性上具有一定的局限性 。 今后随着更多的 cp DNA 通用引物被
开发及更多种类的限制性内切酶的使用，cpDNA PCR-RFLP 的
多态性将进一步提高。
基于分子标记的聚类分析结果与传统的形态学分类结果往
往存在不一致之处，本研究结果也说明了这一点。众多的山楂属植物一般被划分为 6个组(Section)，即：羽裂组、
浅裂组、楔形组、毛序组、麻核组、光核组[16]。 甘肃山楂、光叶山楂、辽宁山楂、毛山楂、阿尔泰山楂在传统分类中
归属麻核组[2]，RAPD 和 ISSR标记分析结果也证明它们亲缘关系较近，它们首先聚在一起，然后与山楂(羽裂组)
吴菲菲等:利用 cp DNA PCR-RFLP 分析中国山楂属植物的亲缘关系 667· ·
第 39卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
和准葛尔山楂(光核组)聚在一起[17]。 但是在本研究中，麻核组的甘肃山楂、光叶山楂、辽宁山楂和毛山楂这 4 个
野生种的 cpDNA PCR-RFLP没有差别，而阿尔泰山楂(麻核组)却与这 4 个野生种在酶切片段大小和数量上存
在明显不同，聚类结果也表明阿尔泰山楂单独聚为一组。 在核 DNA和叶绿体 DNA分子水平上，研究结论之所
以不同是由于叶绿体基因组是母性遗传的，而且相对稳定[3]。 因此，这种 cpDNA PCR-RFLP的差别反映了阿尔
泰山楂与其他麻核组山楂在起源和演化上存在明显不同。 伏山楂在分子系统树中的位置与传统的形态学分类
结果有所不同。 产于我国东北中北部长白山等地的伏山楂为三倍体(2n=3x=51)[18]，也是中国山楂属植物中唯一
的三倍体种。 伏山楂与山楂同属于羽裂组(Sect. Pinnatifidae)，在形态上非常近似，唯后者叶片 3～5对羽裂，小核
3～5，可以区别[16]。 对于伏山楂的分类地位人们存在一些争议，有人主张伏山楂为山楂种下的一个变种。 基于过氧
化物同工酶酶谱结果，郭太君等[19]认为在植物学分类上伏山楂是在长期自然演化过程中形成的与山楂亲缘关系
较近的一个新种，但在园艺学分类上，宜将其归属在山楂系统下。 本研究结果表明，伏山楂(羽裂组)与麻核组的甘
肃山楂、光叶山楂、辽宁山楂和毛山楂在 DNA PCR-RFLP上完全相同，而与山楂(羽裂组)存在明显不同。因此，伏
山楂并不是山楂的一个变种，而很可能是一个新种。 本研究结果揭示了山楂属植物起源和演化的复杂性。
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[责任编辑 马迎杰]
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