全 文 ：J.SHANXI AGRIC.UNIV.(Natura l S cience Ed i tion)
学报(自然科学版)2008 , 28(2) 002365
收稿日期:2007-08-28　　　修回日期:2007-09-27
作者简介:段国峰 (1978-), 男 (汉), 山西运城人 , 助教 , 硕士 , 主要从事园艺作物遗传育种方面的研究。
杜鹃花属植物基因组 DNA RAPD-PCR反应体系的优化
段国峰1 , 肖千文2
(1.山西农业大学 园艺学院, 山西 太谷 030801;2.四川农业大学 林学园艺学院 , 四川 雅安 625014)
摘　要:试验通过系统比较研究 , 确立了杜鹃属植物 RAPD-PCR 的最佳反应体系 , 即 20μL 反应体系中:模板
DNA (10 g · L-1)1.5 μL;10×PC R buffe r 2 μL;Taq 酶 (0.5 U ·μL -1) 0.3 μL;引物 (0.8 μmo l· L -1)4μL;
MgCl2 (25 mmo l· L-1)1.8μL;dNTPs (dATP、 dCTP、 dT TP、 dGTP 各含 1.0 mmol· L-1)0.6 μL。经试验验
证 , 该反应体系重复性高 , 扩增条带亮度均匀 , 弥散现象少。
关键词:杜鹃属植物;RAPD-PCR;反应体系
中图分类号:S664.5　　文献标识码:A　　文章编号:1671-8151 (2008)02-0136-03
Optimization of the Experiment Conditions for the Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis for
Rhododendron L.
DUAN Guo-feng et al.
(Col lege of Horticulture , Shan xi Agriculturial University , Tai gu S hanx i 030801 , China)
Abstract:The reaction conditions for the Randomly Amplified Po lymorphic DNA analy sis fo r Rhododendron L.was
optimized , with the 20 μL reaction sy stem containing 1.5 μL DNA templa te (10 g· L-1), 2.0μL10×Buffer , 0.3 μL
Taq DNA polymerase (0.5 U ·μL-1), 1.8 μL MgCl2 (25 mmo l· L-1), 4 μL primer (0.8 μmol· L-1), 0.6 μL
dN TPs (dATP 、 dCTP 、 dTTP、 dGTP each is 1.0 mmo l· L-1).This reaction sy stem demonstrated a high repro-
ducibility , and the bands w ere clea r and bright.
Key words:Rhododendron L.;RAPD-PCR;Reaction sy stem
　　杜鹃花属植物(Rhododendron)属于杜鹃花科
(Ericaceae)杜鹃花亚科(Rhododendroideae)。杜
鹃花属植物大多是世界上著名的观赏花卉 , 是我
国传统名花 , 不仅可供观赏 , 而且木材可作为雕
刻材料 , 具有很高的经济价值[ 1 ～ 3] 。杜鹃花科植
物大多数具有极高的药用价值 , 其典型的特征活
性成分为黄酮类和挥发油 , 它们大多具有抗菌消
炎和止痰平喘化痰作用[ 4] 。
杜鹃花属虽然早在 1753年被瑞典植物学家建
立 , 但到目前为止杜鹃属的分类问题依然十分复
杂 , 后来分类系统几经变更[ 5 ～ 7] , 除了经典的分
类学外 , 已有解剖学[ 8] , 数量分类学[ 9] , 化学分
类学[ 10] 等大量研究报告 , 但围绕杜鹃属的系统进
化与发育的许多基本问题仍得不到合理解决 。在
植物的分子遗传学研究中 , 分子标记 (Random ly
Ampli fied Polymorphic DNA)是一种非常重要的
工具 , 具有操作简单 , 模板用量少 , 扩增产物便
于转移分析等优点 , 可以用来解决杜鹃花属植物
分类的问题。由于杜鹃花植物种类繁多 , 绝大多
数野生或半野生 , 取材困难 , 部分种类材料尤其
稀少 , 为了高效科学和后续试验的需要 , 我们对
其基因组 DNA RAPD-PCR反应体系进行了必要
的优化。
1　材料与方法
1.1　材料
试验所用的杜鹃属植物叶片均从中国科学院
华西亚高山植物园选取。本试验采用单因素试验
设计 。
1.2　试剂
Taq酶和 dN TPs购自北京天为时代 ;随机
引物为 Operon 公司产品;其余均为国产或进口
分析纯试剂。PCR 仪为德国 Eppendorf 公司生
产;凝胶自动成像系统购自美国 BIO-RAD公司。
1.3　模板 DNA的制备
称取杜鹃叶片 (去叶脉)1 g 加入 1%β-巯基
乙醇 (或者 PVP)液氮研磨成粉状;将粉末转入
10 mL 离心管中 , 加入 3.5 mL CTAB 提取液
(500 mL CTAB 提取液配方:CTAB ,18.163 0 g ,
0.5 mol·L-1EDTA(pH8.0)100 mL , 1 mo l·L -1
T ris-HCl(pH8.0)100 mL , NaCl 40.9 g , 偏重
亚硫酸钠 1.901 3 g , 去离子水定容至 500 mL);
迅速将离心管置于 65 ℃恒温水浴锅中 30 min ,中
间轻轻混匀几次;取出离心管加入等体积的氯仿/
异戊醇(24∶1)溶液轻轻混匀于 5 000 r ·min-1离
心;取上清液加入 2倍体积的冰冷乙醇置-20 ℃
冰箱 1 h或更长时间;用钩针钩出絮状 DNA (若
不能钩出则 4 ℃12 000r ·min-1离心 5 min), 用
70%酒精洗 2 ～ 3次 , 再用无水酒精洗一次 , 每次
5 ～ 10 min , 然后晾干;加入适量 1×TE 溶液溶
解 DNA , -20 ℃保存备用。
利用核酸蛋白自动分析仪对 DNA 浓度和纯
度进行测量 , 基因组 DNA 纯度在 1.8 ～ 1.9 之间
符合要求 。根据所测基因组 DNA 浓度值将样品
均稀释至 10 mg ·L-1 。
1.4　RAPD-PCR反应体系的优化
以模板浓度 、 引物浓度 、 镁离子浓度 、脱氧
核苷三磷酸 (dNT Ps)浓度及 T aqDNA聚合酶用
量为因素进行单因素实验设计 , 分别将 PCR各反
应物包括:10 ×Buf fer 、 25 mmo l · L-1 MgCl2 、
(dA TP 、dCTP 、dTTP 、dG TP 各 1.0 mmol· L-1)
的 dN TP 、 0.8 μmol · L-1引物 、 0.5 U ·μL -1
TaqDNA 聚合酶 、 10 mg · L-1的杜鹃 DNA 模
板 、 ddH2O加入到 0.2 mL 的塑料薄壁 EP 离心
管中 , 加入一滴矿物油后分别放入 PCR仪中进行
扩增 , PCR结束后 , 进行琼脂糖凝胶电泳并利用
凝胶自动成像系统扫描检测。本试验 PCR反应进
行其一成分浓度梯度调整时 , 其它成分浓度与上
同。本试验采用 20 μL 反应体系 , 所列数据均为
20 μL 反应体系中使用量 。
2　结果与分析
2.1　Mg 2+浓度使用量优化
Mg2 +可以影响酶的活性 、扩增的真实性以及
产物的特异性。 Taq 酶的活性需要 Mg2+ , 同时
引物和模板的双链杂交体的解链和退火温度也受
Mg 2+的影响。在一定的实验条件下 , 增加 Mg 2+
的浓度 , 能增加扩增的条带数 , 但 Mg2+浓度过
高会使扩增的严谨性下降;虽然理论上减少
Mg
2+的浓度可以提高扩增的严谨性 , 但 Mg2+浓
度过低则会使 Taq酶失活 , 扩增不出产物。本试
验分别试验了 1.6 μL (泳道 1)、 1.8 μL (泳道
2)、 2.0 μL (泳道 3)、 2.2μL (泳道 4)、 2.4μL
(泳道 5)等不同的 Mg2+用量对 RAPD-PCR反应
的影响 , 结果如图 1所示。
图 1　镁离子浓度对 RAPD-PCR反应的影响
Fig.1　The re sults o f RAPD reaction at diffe rent
Mg 2+concentr ation
　　泳道 1 M g2+用量为 1.6 μL 扩增片段很少 ,
且条带模糊与背景难以区分;泳道 3 和泳道 4
M g2+用量为 2.0μL 和 2.2 μL , 二者均扩增条带
多但背景严重 , 非特异性产物也较多 , 拖尾现象
严重 , 增加了检测难度 , 尤其是泳道 4现象更为
明显;泳道 5 Mg 2+用量为 2.4 μL , 扩增产物较
少 , 背景干扰较大;泳道 2 M g2+用量为 1.8 μL ,
为本试验中效果最佳 , 扩增产物条带清晰 , 亮度
均匀 , 拖尾现象轻 。
2.2　Taq酶用量对反应的影响
Taq酶的活性与用量关系到扩增能否正常顺
利进行 , 酶的用量与酶的浓度有关 , 由于大多数
厂家对酶的标定都不准确 , 在试验过程中 , 应针
对所用的 Taq 酶确定用量 。本试验分别试验了
0.1 μL (泳道 1)、 0.2μL (泳道 2)、 0.3μL (泳
道 3)、 0.4 μL (泳道 4)、 0.5 μL (泳道 5)Taq
酶对 RAPD-PCR反应的影响 。从图 2可看出 Taq
酶用量对杜鹃属植物的 RAPD-PCR 反应的影响
不是很大 , Taq 酶用量为 0.1 μL (泳道 1)时 ,
PCR扩增条带少且模糊与背景难于区分;Taq酶
用量 0.5 μL (泳道 5)PCR扩增条带没有增多 ,
但条带模糊特异性并没有增强;Taq 聚合酶用量
为 0.2 μL (泳道 2)和 0.4 μL (泳道 4)PCR扩
增的结果几近相同 , 均表现为扩增条带特异性不
高 , 易受背景干扰 。本试验 TaqDNA 聚合酶用量
13728 (2) 段国峰等:杜娟花属植物基因组 DNA RAPD-PCR反应体系的优化
为 0.3 μL 时取得理想效果 , 所得 PCR 扩增产物
条带清晰 , 特异性高 。
图 2　Taq 聚合酶用量对 RAPD-PCR反应的影响
Fig.2　The results o f RAPD reaction at different
Taq DNA polymerase concent ration
2.3　引物浓度
引物对反应的特异性扩增和扩增产物的量都
有一定的影响 , 在引物浓度较低时 , 由于引物的
竞争抑制 , 基因组 RAPD 位点有时不能全部测
出 , 会造成差异的假象 。由图 3可看出当引物用
量为 4 μL 时 (泳道 3)PCR反应结果最理想。当
引物用量为 3μL (泳道 2)和 2 μL (泳道1)时 ,
扩增产物量很少 , 电泳结果几乎无带谱;引物用
量为 5 μL (泳道 5)PCR扩增条带虽多 , 但不清
晰 , 特异性不强;引物用量为 4 μL (泳道 4)扩
增条带受背景影响较大 , 难以分辨 。
图 3　引物浓度对 RAPD-PCR反应的影响
Fig.3　The results of RAPD reaction a t different
primer concentra tion
2.4　dN TPs浓度
dN TPs的量对循环次数 、 扩增产物的量有较
大的影响 , 从而对反应的特异性也有一定的影响 。
浓度过低 , 分子碰撞的几率低 , 偶然性大 , 会导
致无扩增或扩增产物不稳定或扩增出来的条带模
糊不清;浓度过高 , 错误掺入几率大大增加 , 导
致特异性降低。如图 4 所示笔者分别试验了用量
为 0.2 μL (泳道 1)、 0.4 μL (泳道 2)、 0.6 μL
(泳道 3)、 0.8 μL (泳道 4)、 1.0 μL (泳道 5)
对 RAPD-PCR反应的影响。当 dN TPs 用量大于
0.6 μL 时 , 扩增条带亮度增加 , 但扩增的主条带
数目减少 , 如泳道 4和泳道 5所示;当 dNTPs用
量小于 0.6 μL 时 , 扩增产物不很清晰 , 易受背景
干扰;因而最终确定 0.6 μL 为本反应最佳用量。
图 4　dNTPs 浓度对 RAPD-PCR反应的影响
Fig.4　The re sults o f RAPD reac tion at different
dNTPs concentr ation
2.5　模板浓度
RAPD-PCR反应对 DNA 的纯度要求不是很
高 , 重要的是每个 RAPD-PCR反应中 DNA 模板
的终浓度 , 一般认为在 5 ～ 200 ng/20μL 范围的
DNA 能提供较好的结果 。我们试验了 0.5 μL
(泳道 5)、 1.0 μL (泳道 4)、 1.5 μL (泳道 3)、
2.0 μL (泳道 2)、 3.0 μL (泳道 1)的不同模板
用量对 RAPD-PCR反应 (20μL 反应体系)的影
响 , 其结果对应如图 5 所示。当模板用量小于
1.5 μL 时 , 扩增的条带数目随 DNA 模板的用量
的逐渐增加而由少增多 , 带谱也逐渐趋于稳定;
当模板用量大于 1.5 μL 时 , 扩增条带数目增多 ,
带谱不稳定性增加 , 出现一些较弱带 , 弥散现象
也逐渐严重。因此 , 在此反应中 DNA 模板的最
佳用量为 1.5 μL , 此时条带整齐 , 多态性好。
图 5　模板浓度对反应体系的影响
Fig.5　The re sults o f RAPD reaction at diffe rent
DNA concentr ation
(下转第 148 页)
138 山 西 农 业 大 学 学 报 (自然科学版) 2008
2.25　铆钉菇科 Gomphidiaceae (1种)[ 1]
血 红 铆 钉 菇 Chroogomphis rut ilus
(Schaef f.:Fr.)O.K.Miller 夏秋两季生于松林
地上 , 单生或群生 (食 , 药用)。
2.26　腔地菇科 Hydnotraceae (1种)[ 3]
脑状腔块菌 Hydnotrya cerebri formis Harkn
夏秋季生于针叶林或混交林内地下土中 , 群生
(食)。
2.27　地菇科 Te rfeziaceae (1种)[ 3]
蜂窝孢猪块菌 Choiromyces alevolatus (Har-
kn.)Trappe 夏秋两季生于青杆林内地下 , 单生
或散生 (食)。
2.28　灵芝科 Ganodermataceae (1种)[ 1]
灵芝 Ganoderma lucidum (Ley ss.:Fr.)
Karst.夏秋两季生于栎及多种阔叶树木桩上或木
桩旁的地上 , 或生长在木头 、 立木或倒木上 , 有
时生长在某些针叶树种上 (药用)。
3　分析与建议
该区黑脉羊肚菌资源丰富 , 分布广 、 品种多 。
南部以羊肚菌为主 , 中部以黑脉羊肚菌为主。有
些地区没有开发 , 但有些地区出现开发过度。因
此 , 当地政府应该积极引导 、 广泛宣传 , 使野生
菌资源得到更广泛和有序的开发 , 以便在发展经
济的同时 , 保护好当地的野生菌资源 。
建议当地政府要利用当地资源的优势条件 ,
进行广泛的宣传 , 开展可食 、 药用及有毒实物标
本和图片展示 , 保护和开发利用资源 。
本项目得到山西省农科院科研处的资助 , 部
分鉴定工作得到中国科学院微生物研究所卯晓岚
先生的帮助 , 特此一并致谢 。
参　考　文　献
[ 1] 刘波.山西大型食用真菌 [ M] .山西:高校联合出版社 , 1991:13-25.
[ 2] 黄年来.中国大型真菌原色图鉴 [ M] .北京:中国农业出版社 , 1998:27-48.
[ 3] 卯晓岚.中国经济真菌 [ M] .北京:科学出版社 , 1998:49-67.
(上接第 138 页)
3　结论
对 RAPD-PCR反应体系的影响较大的因素
有:模板质量 、 药品的纯度 、 酶的活性 、缓冲液
条件 , 以及各主要反应成分的用量等。由于各影
响因素的相互作用普遍存在 , 要想得到比较理想
的结果 , 必须将各反应成分精心调配才行 。本试
验对 PCR反应影响比较大的因素进行了优化 , 得
出的结论为 , 在杜鹃属植物的 RAPD-PCR 反应
体系中各主要反应成分的用量如下 , 即 20 μL 反
应体系中有:模板 DNA (10 mg ·L -1)1.5 μL;
10×PCR buf fer 2 μL ;Taq酶 (0.5U ·μL)0.3
μL ;Primer (0.8μmo l·L-1)4μL ;MgCl2 (25
mmol · L-1)1.8 μL;dNTPs (dA TP 、 dCTP 、
dTT P 、 dG TP 各 1.0 mmol · L-1)0.6 μL 此优
化方案条带清晰 , 稳定 , 重复性高 , 并且在后续
的试验中也得到进一步的证实。
参　考　文　献
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148 山 西 农 业 大 学 学 报 (自然科学版) 2008