全 文 ：中国农学通报 第23卷 第 2期 2007年 2月
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亚洲百合杂种系（ Theasiatichybrids）是百合生产
栽培及花卉市场常见的三大品系之一，由于具有花蕾
小、花朵生长方向多样、花形反卷或碗形、花色丰富而
成为花卉市场深受消费者喜爱的花卉之一。亚洲百合
杂种系的亲本包括卷丹、川百合、大花卷丹、山丹
等[1]。到目前为止，亚洲百合杂种系发展出了性状各
异的许多品种，由于其来源各异，造成杂种系内品种
之间亲缘关系模糊、难以分类定位等问题，为种系内
育种及系统研究带来了一定的麻烦。RAPD分子标记
技术由于具有信息量大、快速、高效，而且操作简单、
模板需要量少等特点，已被广泛用于物种亲缘关系、
遗传多样性分析以及遗传图谱的构建及杂交种的鉴
定[2~4]。但是在国内未见用于亚洲百合杂种系内系统
关系及杂交后代鉴定的应用报道。本试验通过对亚洲
百合DNA提取方法及RAPD-PCR反应体系的优化，
为进一步对亚洲百合品系内遗传多样性及亲缘关系
分析以及系统研究和杂交新品种的鉴定做好前期研
究工作。
1材料与方法
1.1材料
实验在仲恺农业技术学院园林与园艺实验室进
行，以2006年3月栽培于仲恺农业技术学院实习农
场的亚洲百合的幼嫩叶片为材料。采新鲜幼嫩无病虫
害的叶片于塑料封口袋，封口后立即放入冰盒带回实
验室置-80℃超低温冰箱保存备用。
1.2试剂和仪器
TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液（ 含 Mg2+ 15
mmol/L）为北京普博欣生物科技有限责任公司公司产
品；乙二胺四乙酸二钠（ ethylenediaminetetraacetic
acid,EDTA）、NaCl、无水乙醇、硼酸（ H3BO3）、氯仿、异
亚洲百合DNA的提取及RAPD-PCR
反应体系的优化
赵 琛
（ 广东仲恺农业技术学院实习农场，广州510225）
摘 要:为了促进亚洲百合分子水平的研究,以亚洲百合幼嫩叶片为材料,采用改良 CTAB法提取亚
洲百合基因组DNA,得到的DNA质量较高,适合于RAPD-PCR分析。通过单因素优化得到在25μl
反应体系中,亚洲百合 RAPD分析的最佳反应体系:160μmol/LdNTPs,0.3μmol/L随机引物,Taq
DNA聚合酶1.5U,Mg2+浓度2.0mmol/L。
关键词:CTAB;亚洲百合;DNA提取;RAPD-PCR
中图分类号:Q523 文献标识码:A
DNAExtractionandOptimizationofRAPDReactionSystemfor
LiliumAsiatichybrids(Liliaceae)
ZhaoChen
(FarmofZhongkaiUniversityofArgricultureandTechnology,Guangzhou510225)
Abstract:InordertoacceleratethemolecularbiologyresearchofLiliumasiatichybrids,DNAofLilium
asiatichybridswasextractedfromthefreshleavesbyCTAB.TheoptimizedreactionsystemforLilium
asiatichybridsareasfolows.Thereactionswereperformedinavolumeof25μlcontaining2.0mmol/L
Mg2+,160μmol/LdNTPs,1.5UTaqDNApolymerase,0.3μmol/Lprimer.
Keywords:CTAB,Liliumasiatichybrids,DNAextraction,RAPD-PCR
作者简介:赵琛，男，1975年出生，广东湛江人，农艺师，主要从事作物栽培与育种方面的研究。通信地址：510225广州市纺织路东沙街24号仲恺农业技术
学院实习农场。E-mail:zh1200400780@126.com。
收稿日期:2006-11-13，修回日期：2006-11-16。
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戊醇、醋酸钠（ NaAc）等试剂为国产分析纯；十六烷基
三甲基溴化铵（ cetyltriethylammoniumbromide,
CTAB），脱氧核苷三磷酸（ dNTPs）、随机引物，琼脂
糖 ， 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（ Tris-hydroxymethyl
aminomethane,Tris）的纯度>99.5%，β-巯基乙醇的
纯度≥99.0%，分子量标准（ Marker）:λDNA/EcoRⅠ
+HindⅢ，RnaseA液，等均购自上海生工生物工程有
限公司产品。
PCR仪：P×2ThermalCycler为美国Thermal公
司产品；DYY-5型电泳仪购自北京市六一仪器厂；ZF
型紫外透射反射分析仪购自上海嘉鹏科技有限公司。
1.3DNA提取
采用改良 CTAB法[5]：（ 1）取 1~2片百合幼嫩叶
片于研钵中，加少许细石英砂后充分研磨成糊状，转
入1.5ml离心管，用200μl2×CTAB液冲洗研钵，将
洗液一并倒入离心管；（ 2）在离心管中加入 200μl
2×CTAB和 12μl2%的 β-巯基乙醇，然后置于
60℃水浴30min，期间不时颠倒混匀；（ 3）水浴中取出
冷却至室温后加入400μl氯仿/异戊醇（ v/v：24：1），
颠倒混匀至乳浊状，8000rmp/min离心 10min；（ 4）将
上清液转移至一干净离心管，加入5μlRnaseA液，室
温下保持30min；（ 5）加入600μl异丙醇，颠倒混匀，
但不要震荡，DNA沉淀成絮状，置-20℃冰箱2h以上
或过夜；（ 6）取出后6000rmp/min离心 10min，弃上清
液；（ 7）用 70%乙醇 300μl清洗沉淀，8000rmp/min
离心 2min，弃上清液，重复 3次；（ 8）将沉淀（ 即
DNA）自然风干后溶解于200μlTE缓冲液中，置于
4℃冰箱待用。
1.4PCR扩增条件优化
扩增反应的总体积 25μl，比较 Taq酶用量、
dNTPs、随机引物浓度以及Mg2+浓度对RAPD扩增的
影响。反应程序：94℃预变性 3min；94℃变性 20
sec，37℃退火 30sec，72℃延伸 1min，40个循环；最
后72℃延伸10min，4℃保温。整个反应过程持续时
间约 4h。在 PCR管中加入 5μl电泳点样缓冲液混
匀，取10μl于 1.5%琼脂糖凝胶（ 含 EB0.5%）电泳，
于紫外透射反射分析仪观察、凝胶成像系统拍照记
录。
2结果与分析
2.1DNA的制备
由于百合鳞片中的多糖含量很高，多糖、多酚往
往与DNA缠在一起共沉淀，形成粘稠的褐色混合物
而难以得到适用于RAPD的高质量的DNA[6]。因此本
实验以嫩叶片做材料，采用改良CTAB法提取基因组
DNA，得到15份亚洲百合基因组DNA电泳图谱(图
1)。从琼脂糖凝胶电泳检测结果来看，DNA各样品主
带明显，除了5号有轻微拖影外，带型基本整齐一致。
除了8号材料的浓度较低，其它材料提取的DNA浓
度都较高，也没有降解现象，完全能够满足
RAPD-PCR扩增的要求。
2.2RAPD-PCR条件的优化
2.2.1Mg2+浓度对 PCR扩增的影响 按每反应设置
1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L4个浓度梯度，扩增结果见图
2泳道2~5。从图可以看出：Mg2+浓度为1.0mmol/L和
1.5mmol/L时，扩增出来的条带数及亮度都一样，而
且条带清晰，模糊条带少，随着 Mg2+量的增加，扩增
出的模糊条件增多，并且主带有变模糊的趋势。
2.2.2dNTPs浓 度 对 PCR扩 增 的 影 响 实验在
80~200μmol/L之间设置4个浓度梯度，扩增结果见
图 2泳道 6-9。扩增结果表明：dNTPs浓度为
图115份亚洲百合DNA电泳图(数码照)
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2.2.4引物浓度对 PCR扩增的影响 实验设置 0.2、
0.3、0.4、0.5μmol/L四个引物浓度梯度，得到扩增结
果见图2泳道15-18。在25μl体系中，引物浓度对扩
增结果影响不是很明显，从0.2~0.4μmol/L所扩增出
来的图谱条带数一样，亮度差不多，但是带型有扩散
的趋势；当引物浓度为 0.5μmol/L时条带数较其他
浓度少。
3讨论
RAPD-PCR对反应条件及其敏感，反应体系或反
应程序中任何因素发生改变都会严重影响扩增结果。
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、
模板和Mg2+。Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显
著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTPs浓度为
150μmol/L时，Mg2+浓度以 1.5~2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，
浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产
物减少。本实验得到适合亚洲百合扩增的最佳Mg2+
浓度为2.0mmol/L。
dNTPs的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关
系。dNTPs如保存不当易变性失去生物学活性，多次
冻融会使dNTPs降解，一般来说，如果在一星期内连
续使用可放4℃冰箱保存，如每隔一星期以上时间使
用一次应保存在-20℃冰箱。在PCR反应中，dNTPs
应保持在50~200μmol/L之间，浓度过低会降低PCR
产物的产量，浓度过高则与 Mg2+结合，使 Mg2+浓度
降低。
TaqDNA聚合酶是PCR扩增成功最重要的因素
之一，一般用量为1.0~2.0U每反应，浓度过高可引起
非特异性扩增，浓度过低则延伸不完全，合成产物量
减少。
随机引物是RAPD反应中的起始点，只有同模板
DNA稳定结合的引物才能扩增出稳定的产物。引物
的浓度一般在0.1~1μmol/反应之间，以最低引物量
产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和
非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机
会。
80μmol/L时条带较弱且条带不完全，当浓度增至
120μmol/L时条带亮度有所增加，而且出现较
80μmol/L多的模糊条带，浓度为160μmol/L时条带
多且亮，而且非常清晰，但是当增至 200μmol/L时，
条带数又减少了，而且带型扩散。笔者认为
160μmol/L是亚洲百合 RAPD-PCR反应的最佳
dNTPs浓度。
2.2.3Taq酶用量对 PCR扩增的影响 在 25μl反应
体系中分别用1.0、1.5、2.0、2.5U四种不同 Taq酶用
量，对亚洲百合进行RAPD扩增，得到结果见图2泳
道11-14。实验结果显示：Taq酶用量1.5U时扩增结
果最好，条带既亮又清晰，扩增出来的特异性条带多，
用量为1.0U和2.0U时条带减少且变暗，用2.5U时
效果更差。
泳道 2~5：Mg2+1.0、1.5、2.0、2.5(mmol/L)；泳道 6~9：dNTPs80、120、160、200(μmol/L)；泳道 11~14：Taq1.0、1.5、2.0、2.5(U)；泳道
15~18：引物0.2、0.3、0.4、0.5(μmol/L)；泳道1、10、19是Mark
图 2不同反应成分浓度对 PCR扩增的影响图谱
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由于RAPD-PCR对DNA的要求不高，其质量和
浓度对扩增结果影响较小，本实验中笔者未作浓度梯
度比较。
参考文献
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（ 责任编辑：陈素洁）
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