全 文 ：干旱胁迫诱导苹果属植物新根发生 PCD细胞的 DAPI荧光染色分析
李春霞 1, 3 , 曹 慧2, 3＊　
(1.延安职业技术学院 ,陕西延安 716000;2.潍坊学院生物工程学院 ,山东潍坊 261061;3.山西农业大学园艺学院 ,山西太谷 030801 )
摘要　[目的 ]从细胞核的形态变化观察干旱是否诱导苹果属植物发生细胞程序性死亡 ,并且鉴定 DAPI是否是观察细胞形态学的较好
方法。 [方法 ]以抗旱能力较强的八棱海棠和抗旱性较弱的平邑甜茶幼苗为试验材料 ,用 20%聚乙二醇模拟干旱 ,对这 2种幼苗根系进
行处理 ,并对处理的新根经DAPI染色在紫外光下照射。 [结果]经DAPI染色在紫外光(UV)照射下 ,正常新根细胞核发出均匀的蓝色
荧光 ,而经干旱处理后新根的细胞出现染色质凝集、细胞核缩小、变形 、解体、形成凋亡小体等细胞凋亡的形态学特征。 [结论 ]在干旱诱
导苹果属植物死亡过程中 ,有一个阶段存在明显的细胞程序性死亡过程 ,且DAPI荧光染色是观察细胞程序性死亡的较好方法。
关键词　苹果属;干旱胁迫;细胞程序性死亡;DAPI
中图分类号　Q942　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)18-09431-02
StudyonMorphologyofProgrammedCellDeathinMalusRootsunderDroughtStress
LIChun-xiaetal　(Yan anVocationalandTechnicalCollege, Yan an, Shaanxi716000)
Abstract　[ Objective] TheaimofthestudywastoobservetherelationshipbetweendroughtstressandprogrammedceldeathwithDAPIand
searchforagoodmorphologywaytoobserveprogrammedceldeath.[ Method] TwoMalusplants(MalusrobustaRehdandMalushupehensis
pampReld.seedlings)weretreatedwithtwentypercentofpolythyeneglycol(20%PEG6000)andDAPIUVtostimulatethetreatedroots.
[ Result] ThestudyshowedthatafterDAPIstainingbyultraviolet(UV)radiation, thenormalissuenucleiofnewrootsissueduniformblueflu-
orescence.Thefeaturesofprogrammedceldeath(PCD)werefoundinthetreatedrootscel, suchaschromatincondensated, karyonshinked,
distortedanddegraduatedwithrisingofstresstime.[ Conclusion] DroughtstresscouldinduceprogrammedceldeathinMalusplants, and
DAPIwasagoodwaytoidentifyprogrammedceldeath.
Keywords　 Malus;Droughtstress;Programmedcelldeath;DAPI
作者简介　李春霞(1972-),女 ,陕西黄龙人 ,硕士 ,讲师 ,从事果树栽
培生理方面的研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2010-03-23
　　植物细胞程序性死亡(ProgrammedCelDeath, PCD)又
称植物细胞凋亡 ,是植物细胞在发育过程或在某些因素作用
下发生的 ,受基因调控的 、主动的死亡方式。 PCD作为一种
普遍的生命现象 ,不仅在植物正常生长发育中发挥重要作
用 ,而且是抵御不良环境的重要手段 ,因此 PCD研究已成为
近些年生物学研究热点之一。
苹果是世界上重要的栽培果树之一 ,干旱是影响苹果生
产最重要的生态因子。尽管许多学者已经在干旱影响苹果
生产方面进行了大量研究 ,但关于干旱诱导苹果属植物细胞
程序性死亡的机理研究还较少。笔者选用抗旱性较强的八
棱海棠和抗旱性较弱的平邑甜茶 1年生实生苗为试材 ,经过
干旱胁迫处理 ,通过 DAPI荧光染色观察发生细胞程序性死
亡的细胞核的变化特点。
1　材料与方法
1.1　试验材料　以抗旱性较强的八棱海棠(Malusrobusta
Rehd.)和抗旱性较弱的平邑甜茶(Malushupehensispamp
Reld.)[ 1] 1年生实生幼苗为试验材料。采用营养液水培法培
养幼苗。精选种子 ,去除瘪种子及其他杂质 ,蒸馏水浸泡 12
h,纱布包好放在容器中 ,置于 4 ℃冰箱中层积处理。层积过
程中每 2 d用清水冲洗 3遍 ,尽量甩干水分以免发霉。当种
子露白时 ,选发芽一致的种子播入日光温室 ,待幼苗长到 4 ～
6片真叶时 ,移入 1/2剂量的营养液中培养 7 d后改用全剂
量的营养液培养 ,在温室培养期间每天定时通气。
1.2　试验处理　试验于 2006年 12月 ～2008年 6月在山东
淮坊学院日光温室大棚和生物工程重点实验室进行。当幼
苗长到 13 ～ 14片真叶时开始干旱处理。选择 2个品种大小
一致的幼苗 ,将选择好的每个品种幼苗分成 2等份(每份 50
株),一份在正常营养液中培养作为对照;另一份移入含有
20%PEG6000的营养液 (相当于 -0.63 MPa,属中等胁
迫)[ 2-3]中进行干旱处理 。从处理开始起 ,每 24 h取样进行
1次根荧光观察 ,直到植株完全死亡为止。每个处理随机取
样 ,每个品种鉴定重复 3次 。
1.3　检测方法　参照孙晓丽等 [ 4]和郭晓军等 [ 5]的方法进
行。①取样:分别取对照和处理 2个苹果属植物的白色新生
根洗净;②切片:用锋利的刀片在尽量短的时间内切取材料 ,
根切成 5 ～ 10mm的根段 ,然后将切片放入盛有 5%的戊二醛
的小瓶中进行固定;③固定:将装有材料的小瓶置于 4 ℃冰
箱内固定 2 h以上;④冲洗:固定后用吸管吸掉固定液 ,再用
0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值为 7.0)反复冲洗切片 3次;⑤
DAPI染色:将冲洗后的切片移到载玻片上(每片放置 5 ～ 10
个横纵切片),然后在根上滴加浓度为 5μg/mlDAPI染色液
10 ～ 20 μl,并盖好盖玻片 ,于黑暗处染色 10 ～ 15 min;⑥观
察 、拍照:将做好的镜片放置于日本尼康荧光倒置摄影显微
镜下 ,在激发波长为 UV330 ～ 380nm下观察 、拍照。
2　结果与分析
经干旱胁迫诱导后 1 ～ 6 d2种苹果属植物白色新根细
胞核的变化见图 1 ～ 2。由图 1 ～ 2可知 , 2个苹果属植物对
照中白色新根的细胞核为完整圆形 ,发出均匀明亮的蓝色荧
光 ,未发生染色质浓缩。当处理 1d后 ,八棱海棠大多数细胞
核仍为近圆形 ,只有少数呈 “月缺形 ”;第 2天许多细胞核发
出的亮蓝色荧光表现出染色质的不均一化 ,大多数细胞核形
状开始不规则 ,第 3 ～ 4天大多数细胞核为细长形或不定形
的荧光 ,且有大量凋亡小体形成;随着胁迫时间的延长 ,到第
5天大量 DNA降解 ,细胞核变得小而细;第 6天细胞核周只
剩下少量 DNA残余。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(18):9431 -9432, 9439 责任编辑　李占东　责任校对　卢瑶
平邑甜茶根在诱导后 1 d绝大部分细胞已观察不到完
整的圆形细胞核;第 2天几乎所有细胞核变小且形成少量凋
亡小体;第 3天形成大量核小体;第 4天大量 DNA降解 ,只
剩下少量 DNA残余 ,细胞核大部分解体;第 5 ～ 6天只看到
没有细胞核的细胞空腔。与八棱海棠相比 ,平邑甜茶细胞核
形态变化较快。
注:a、b、c、d、e、f、g分别为 CK和处理 1、2、3、4、5、6d。下同。
Note:a, b, c, d, e, f, gstandforCK,tretment1, 2, 3, 4, 5, 6 d.Thesameasbelow.
图 1　DAPI荧光染色后八棱海棠白色新根细胞核形态变化
Fig.1　 ThechangesofkaryomorphisminthenewrootsofMalurobustaRehd.underfluorescencestainingwithDAPI
图 2　DAPI荧光染色后平邑甜茶白色新根细胞核形态变化
Fig.2　 ThechangesofkaryomorphisminthenewrootsofMalushupehensispampReld.underfluorescencestainingwithDAPI
3　结论与讨论
(1)形态学观察法是研究细胞形态最直接的方法 ,发生
PCD的细胞和坏死的细胞形态存在明显差别 ,可通过荧光染
色来观察 ,其中 DAPI荧光染料可与细胞核内的 DNA发生特
异结合 ,经紫外光激发后 ,在荧光显微镜下 ,细胞核会发出明
亮的蓝色荧光 ,可以通过蓝色荧光观察细胞核的形态变化情
况 。许多研究认为 ,发生 PCD的细胞最典型的特征是 PCD
细胞的染色质发生浓缩和细胞核 DNA断裂 。
DAPI作为特异性的荧光探针已被广泛应用于细胞分子
生物学等各个领域 ,许多试验用它检测细胞程序性死亡 [ 6-8] 。
该试验用 DAPI对苹果属植物品种白色新根进行染色 ,结果表
明 ,经 20%PEG处理的 2个苹果属植物细胞核都有染色质凝
聚 、固缩 、逐渐趋边化 、最后形成凋亡小体等细胞凋亡的典型特
征 ,说明发生了细胞程序性死亡。从 2个品种的细胞核形态变
化进程来看 ,八棱海棠细胞核形态变化进程比平邑甜茶慢 ,说
明八棱海棠比平邑甜茶程序性死亡持续时间长。
(2)通过 DAPI荧光染色可清晰看出 ,细胞核的变化具
有程序性死亡的典型形态特征 ,说明干旱能诱导苹果属植物
根发生细胞程序性死亡;八棱海棠根细胞的死亡进程比平邑
甜茶慢 ,说明八棱海棠耐旱能力比平邑甜茶强 。
参考文献
[ 1] 叶乃好 ,翟衡,杜中军,等.水分胁迫条件下 10种苹果砧木抗旱性评价
[ J].果树学报, 2004, 21(5):395-398.
[ 2] 谭冬梅.干旱胁迫诱导新疆野苹果和平邑甜茶细胞程序性死亡的研究
[ D].北京:中国农业大学 , 2005.
[ 3] 林久生 ,王根轩.渗透胁迫诱导的小麦叶片细胞程序性死亡 [ J].植物
生理学报, 2001, 27(3):221-225.
[ 4] 孙晓丽 ,周荣华 ,贾继增.白粉菌诱导的小麦叶片程序性细胞死亡[ J].
扬州大学学报:农业与生命科学版 , 2006, 27(2):21-25.
(下转第 9439页)
9432 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
产量有不同程度的降低 ,但秧龄在 42d以内的产量仍可超过
10 000kg/hm2 ,其中秧龄 28 d的产量最高 ,而超过 42d后 ,产
量相对较低。结合处理Ⅳ早穗较严重来看 ,长秧龄及早穗严重
对产量影响较大。由此可以说明 ,对新两优香 4来说 ,秧龄在
42d以内是较安全的 ,超过 42d将会导致严重减产。
表 3　不同秧龄对新两优香 4产量及产量构成因素的影响
Table3　 YieldandgrainstructureofdiferentageofXinliangyou4
处理Treatment
有效穗数∥万 /hm2Numberofefectiveear
穗总粒数∥粒 /穗Totalgrainnumberperear
穗实粒数∥粒/穗Filedgrainnumberperear
结实率∥%Seed-settingrate
千粒重∥g
1 000-grainweight
实际产量kg/hm2Actualoutput
增减∥%Increaseordecrease
Ⅰ 273.4 215.9 192.8 89.3 27.5 10 769.8 0
Ⅱ 268.9 203.7 183.7 90.2 27.4 10 575.9 -1.8
Ⅲ 232.5 183.9 155.6 84.6 27.5 10 349.8 -3.9
Ⅳ 210.6 175.1 136.8 78.1 27.3 9 972.8 -7.4
2.4　相关性分析　由表 4可知 ,秧苗期单株分蘖数 、主茎叶
片数与产量均呈负相关关系 ,且达到极显著水平 (r=
-0.979 1＊＊ , -0.977 1＊＊);株高与产量呈负相关关系 ,但相
关不显著。说明秧苗期单株分蘖数越多 、主茎叶片数越多 ,
减产幅度越大 ,亦即秧龄越长 ,产量越低。成熟期的有效穗
数 、每穗总粒数 、每穗实粒数 、结实率与产量呈显著或极显著
正相关关系 (r=0.969 9＊＊ 、 0.963 3＊＊ 、0.981 5＊＊ ,
0.955 2＊)。由此可见 ,长秧龄减产主要与有效穗 、每穗总粒
数 、每穗实粒数以及结实率的下降有关。
表 4　各指标间的相关系数
Table4　 Correlationcoefficientamongindices
指标Indice
单株分蘖数Tileringsperplant
主茎叶片数Leafnumberofmainstem
株高Plantheight
有效穗数Numberofproductiveear
穗总粒数Totalgrainnumberperear
穗实粒数Filedgrainnumberperear
结实率Seed-setingrate
千粒重
1 000-grainweight
实际产量Actualyield
单株分蘖数 Tileringsperplant 1.000 0
主茎叶片数Leafnumberofmainstem 0.962 8＊＊ 1.000 0
株高 Plantheight 0.847 7 0.926 1＊ 1.000 0
有效穗数 Numberofefectiveear -0.987 6＊＊ -0.920 4＊ -0.754 1 1.000 0
穗总粒数 Totalgrainnumberperear -0.996 2＊＊ -0.962 6＊ -0.878 9＊ 0.973 1＊＊ 1.000 0
穗实粒数 Filedgrainnumberperear-0.996 9＊＊ -0.948 8＊ -0.805 6 0.996 5＊＊ 0.986 8＊＊ 1.000 0
结实率 Seed-setingrate -0.934 9＊ -0.870 9 -0.633 4 0.972 4＊＊ 0.900 9＊ 0.959 2＊＊ 1.000 0
千粒重 1 000-grainweight -0.598 0 -0.752 8 -0.616 6 0.567 0 0.564 3 0.600 4 0.644 1 1.000 0
实际产量 Actualyield -0.979 1＊＊ -0.977 1＊＊ -0.827 7 0.969 9＊＊ 0.963 3＊＊ 0.981 5＊＊ 0.955 2＊ 0.742 2 1.000 0
　注:＊和＊＊分别表示相关达显著和极显著水平。
　Note:＊and＊＊ standforsignificantandextremelysignificantcorelationrespectively.
3　结论与讨论
从不同秧龄的产量 、抽穗期情况及产量因子与产量的相
关性可知 ,长秧龄减产的原因主要是群体总茎蘖数随秧龄的
延长而减少 ,导致群体总穗数 、每穗总粒数和结实率同步下
降 。新两优香 4在正常栽培下要想获得理想产量 ,需保证秧
龄在 42 d以内 ,不宜过长 。通过对产量因素的相关性分析发
现 ,对新两优香 4而言 ,有效穗数 、穗粒数和结实率(或实粒
数)与产量的相关性较为密切 ,所以生产上在提高穗数的前
提下 ,应该主攻穗粒数 、穗实粒数和粒重。
参考文献
[ 1] 吴一梅,张洪程.秧龄对机插水稻秧苗素质及产量的影响 [ J].中国稻
米, 2009(1):36-38, 48.
[ 2] 黄义德 ,武立权.安徽省江淮丘陵地区单季中稻旱灾原因浅析及对策
[ J].安徽农业科学, 2006, 34(2):285-286.
[ 3] 段素梅 ,陈周前 ,杨安中 ,等.大苗抛栽秧龄对杂交中稻生长及产量的影
响[ J] .中国农学通报 , 2008, 24(2):150-154.
[ 4] 段素梅,杨安中 ,陈周前,等.秧龄、播量、密度和氮肥运筹对“新两优 6号”产量的影响 [ J].安徽科技学院学报 , 2009, 23(3):14-17.
[ 5] 高军 ,黄义德,陈金节,等.不同播种密度和秧龄对杂交中籼稻新两优 6
号群体数量及产量的影响 [ J].中国农学通报 , 2007, 23(9):231-236.
(上接第 9432页)
[ 5] 郭晓军,田国忠,赵少波,等.抗枣疯病枣树品种的 DAPI荧光染色检测
[ J].河北林业科技 , 2003(4):1-3.
[ 6] 刘爱新,李多川,王金生,等.HarpinXoo诱导烟草过敏性细胞死亡的细胞及分子特征 [ J].中国农业科学, 2005, 38(12):2446-2450.
[ 7] 纪睿 ,张正光 ,王源超.疫霉菌激发子 PB90诱导烟草悬浮细胞的凋亡
[ J].科学通报 , 2005, 50(5):448-452.
[ 8] 顾月华,赵寅生,赵凌.同步辐射软X射线引起小麦根尖细胞凋亡的研
究 [ J].核技术, 2005, 28(10):733-736.
[ 9] 董桃杏 ,蔡昆争 ,曾任森.干旱胁迫下茉莉酸甲酯对水稻叶片质膜透性
及无机离子含量的影响[ J] .华北农学报 , 2010, 25(1):136-140.
[ 10] 金丽萍,崔世茂,杜金伟,等.干旱胁迫对不同生态条件下蒙古扁桃叶
片PAL和 C 4H活性的影响[ J] .华北农学报 , 2009, 24(5):118-122.
[ 11] 魏磊,崔世茂.干旱胁迫对山杏光合特性的影响 [ J] .华北农学报,
2009, 24(5):194-197.
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